Praca oryginalna Original paper
W ostatnim dwudziestoleciu przestrzeñ lizosomo-wa komórek ssaków znalaz³a siê w centrum zaintere-sowañ badaczy, miêdzy innymi jako potencjalny uk³ad mog¹cy uczestniczyæ w reakcjach adaptacyjnych or-ganizmu. Lizosomom powiêconych zosta³o tak¿e wiele naszych wczeniejszych badañ (9, 10, 13-15, 20, 25-28).
Bia³ka s¹ jednym z najwa¿niejszych elementów diety niezbêdnej do prawid³owego funkcjonowania organiz-mu zwierz¹t, co wyra¿a siê bezporednim zapotrze-bowaniem na aminokwasy endogenne oraz egzogen-ne. Rodzaj diety bia³kowej wp³ywa nie tylko na prze-bieg podstawowych procesów metabolicznych, ale tak-¿e na masê cia³a, a u zwierz¹t gospodarskich równie¿ na wydajnoæ produktów hodowlanych (1, 5). Jednym z podstawowych obszarów katabolicznych komórki jest przestrzeñ lizosomowa, a czynnikami moduluj¹-cymi jej metabolizm mog¹ byæ, m.in. hormony, wród nich za testosteron (20). Oprócz wp³ywu na proces spermatogenezy oraz rozwój drugo- i trzeciorzêdowych mêskich cech p³ciowych, hormon ten uczestniczy w przemianach anabolicznych, a tak¿e kszta³towaniu siê mêskiego profilu p³ciowego morfologicznego i behawioralnego (16). Podawanie testosteronu
wp³y-wa zarówno na syntezê, jak i degradacjê bia³ek, przy-spiesza tempo wzrostu i pokwitania, a u dojrza³ych osobników p³ci mêskiej stabilizuje masê miêniow¹, dziêki czemu organizm ma zapewnion¹ odpowiedni¹ retencjê azotu, fosforu, potasu i wapnia (4).
Celem badañ by³o okrelenie aktywnoci modelo-wo wybranych enzymów uk³adu lizosomowego komó-rek w¹troby i nekomó-rek myszy pozostaj¹cych na diecie o zró¿nicowanej zawartoci bia³ka standardowej (16%) i wyranie obni¿onej (10%) oraz poddanych dzia³aniu farmakologicznych dawek egzogennego tes-tosteronu.
Materia³ i metody
Badania przeprowadzono na 40 samcach myszy linii Swiss, o redniej masie cia³a 22,0-23,5 g, wybranych loso-wo z licz¹cej ponad 1000 osobników populacji. Zwierzêta pochodzi³y z hodowli Instytutu Genetyki i Hodowli Zwie-rz¹t PAN w Jastrzêbcu, gdzie utrzymywano je w standar-dowych warunkach mysiej fermy, w pomieszczeniu o tem-peraturze 20-22°C i 12-godzinnym cyklu wietlnym, za-pewniaj¹c im sta³y dostêp do wody dziêki umocowanym w pokrywie klatek samoczynnym poide³kom. Wszystkie myszy mia³y zapewnion¹ fachow¹ opiekê weterynaryjn¹.
Wp³yw testosteronu na aktywnoæ enzymów
lizosomowych w w¹trobie i nerkach myszy
utrzymywanych na ró¿nym poziomie bia³ka w paszy
BO¯ENA WITEK, EWA OCHWANOWSKA, IWONA STANIS£AWSKA, ARTUR WRÓBEL*, W£ODZIMIERZ MIERZWA**, ADAM KO£¥TAJ***, EMILIA BAGNICKA***
Instytut Biologii Akademii wiêtokrzyskiej, ul. wiêtokrzyska 15, 25-406 Kielce *Prywatna Praktyka Stomatologiczna, Kielce
**Wojewódzki Szpital Specjalistyczny, ul. Bialska 104-108, 42-200 Czêstochowa ***Instytut Genetyki i Hodowli Zwierz¹t PAN, ul. Postêpu, 05-552 Wólka Kosowska
Witek B., Ochwanowska E., Stanis³awska I., Wróbel A., Mierzwa W., Ko³¹taj A., Bagnicka E. Effect of testosterone on the activity of lysosomal enzymes in the mouse liver and kidney
maintained on the different protein level in diet Summary
The experiment was conducted on the influence of testosterone on the activity of ten lysosomal enzymes in the mouse liver and kidney. Mice were divided into two feeding group [control 16% protein] and [10% protein] in diet. The animals of the both groups were injected with 0.05 mg/kg b.w. of testosterone intraperi-toneally. In the lysosomal fraction of the liver and kidney the activity of lysosomal enzymes were estimated. Testosterone decreased activity of all investigated enzymes in the liver, except alanine aminopeptidase, cathepsins D and L, lysosomal lipase. In the lysosomal fraction of the kidney testosterone decreased of all lysosomal enzymes, too, except alanine aminopeptidase. The results suggest that exogenous testosterone and different proteins diet had a significant influence on the activity of investigated lysosomal enzymes.
Po odsadzeniu od matek w wie-ku 6 tygodni myszy zaczêto karmiæ w okresie nastêpnych 4 tygodni dwoma rodzajami pasz granulowa-nych, zawieraj¹cych odpowiednio 16% bia³ka (grupa kontrolna) i 10% bia³ka (grupa eksperymentalna). Pasza 16% zawiera³a dok³adnie 15,63% bia³ka i 14,04 MJ/kg, pasza
o obni¿onym poziomie bia³ka zawiera³a 10,38% bia³ka i 13,47 MJ/kg.
Analizê sk³adu procentowego obu rodzajów pasz opra-cowano w Instytucie Fizjologii i ¯ywienia Zwierz¹t im. Jana Kielanowskiego PAN w Jab³onnie k./Warszawy, a wyprodukowano je w Instytucie Parazytologii PAN im. Witolda Stefañskiego w £omnej-Las k./Warszawy, spec-jalnie dla potrzeb tego eksperymentu.
Po 21 dniach podawania obu rodzajów pasz, 9-tygodnio-we myszy podzielono w obrêbie tych grup ¿ywieniowych na licz¹ce po 10 osobników grupy dowiadczalne (tab. 1). Myszom grup kontrolnych (I, III) podawano codziennie w iniekcji dootrzewnowej olej w objêtoci 200 µl/mysz, raz dziennie stale o godzinie 8:00 w okresie 5 dni. Myszy grup dowiadczalnych (II, IV) w iniekcji dootrzewnowej otrzymywa³y testosteron w dawce 0,05 mg/kg masy cia³a, w objêtoci 200 µl/mysz, raz dziennie o godzinie 8:00, w okresie 5 dni. Dawkê testosteronu dobrano tak, aby stê-¿enie testosteronu w osoczu krwi myszy dowiadczalnych by³o ponad dwukrotnie wy¿sze ni¿ u osobników kontrol-nych. Wszystkie te dane zestawiono w tab. 1.
Po up³ywie 12 godzin od ostatniej iniekcji myszy wszyst-kich grup dekapitowano, po czym natychmiast pobierano fragmenty w¹troby i nerek. Przygotowanie homogenatów w¹troby i nerek przeprowadzono zgodnie z metod¹ Beau-faya (3). Wypreparowane w¹troby wa¿ono, perfundowa-no sch³odzonym do 4°C roztworem 0,9% chlorku sodu ce-lem usuniêcia ece-lementów morfotycznych krwi i podobnie jak zwa¿one nerki zawieszano w sch³odzonym do 5°C 100 mM buforze fosforanowym o pH 7,0, w stosunku 500 mg tkanki/5 ml buforu. Tak przygotowan¹ ca³oæ mogenizowano w niskoobrotowym
ho-mogenizatorze Pottera-Elvehjema z t³o-kiem teflonowym, umieszczonym w po-jemniku z pokruszonym lodem, przy 200 obrotach/minutê, przeprowadzaj¹c czte-ry cykle t³oka góra-dó³.
Otrzymane homogenaty w¹troby i ne-rek wirowano w wirówce Janetzkyego K-26D przez 8 minut przy 600 g. Uzys-kane nads¹cze poddawano ponownemu wirowaniu przez 20 minut przy 20 000 g (wirówka K-26D). Osady otrzymane z wirowania rozpuszczano w 4 ml 0,1% Tritonu X-100, czterokrotnie zamra¿ano i rozmra¿ano, po czym przechowywano w temperaturze 20°C. Tak przygotowa-ne nads¹cze przed przyst¹pieniem do analiz wirowano ponownie w wirówce K-26D przez 5 minut przy 700 g. Otrzy-mane supernatanty poddawano
weryfika-cji na aktywnoæ fosfatazy kwanej (AcP) EC 3.1.3.2 (8) uznawanej za enzym znacznikowy s³u¿¹cy do identyfika-cji frakidentyfika-cji lizosomowej. Po jej pozytywnej lokalizaidentyfika-cji w przygotowanych supernatantach oznaczano aktywnoæ badanych hydrolaz lizosomowych zgodnie z danymi zawar-tymi w tab. 2.
Aktywnoæ badanych enzymów lizosomowych oznacza-no, stosuj¹c syntetyczne substraty 4-nitrofenylowe, odpo-wiednio dla: fosfatazy kwanej (4-nitrophenyl phosphate, disodium salt hexahydrate), b-N-acetylo-hexozaminidazy (4-nitrophenyl-N-acetyl-b-D-hexosaminide), b-glukozyda-zy (4-nitrophenyl-b-D-glucopyranoside), b-galaktob-glukozyda-zydab-glukozyda-zy (4-nitrophenyl-b-D-galactopyranoside), b-glukuronidazy (4-nitrophenyl-b-D-glucuronide) oraz dla esterazy lizoso-mowej (4-nitrophenyl palmitate); substraty b-naftyloami-dowe dla: aminopeptydazy alaninowej (L-Alanine b-Naph-thylamide) i aminopeptydazy leucynowej (L-Leucine b-Naphthylamide hydrochloride); syntetyczn¹ azokazeinê jako substrat dla katepsyn D i L (2% Azo-casein sodium salt w 6 M moczniku) oraz dwumalan fenoloftaleiny jako substrat dla lipazy lizosomowej (phenolphthalein dibuty-rate). Oznaczenie aktywnoci wykonano zgodnie z danymi opisanymi poni¿ej:
Wykonanie oznaczeñ dla AcP, Hex, b-Glu, b-Gal, b-GlcUr, EL i LL:
100 µl badanej próby,
1000 µl odpowiedniego substratu,
1 godzina inkubacji w temperaturze 37°C,
1000 µl buforu alkalicznego po 60 minutach inkubacji, pomiar ekstynkcji przy d³ugoci fali 420 nm (dla LL przy 530 nm). a k ³ a i b i c o tr a w a z % 6 1 o a z s a P Paszao10%zawatrocibia³ka .I zwierzêtakonrtolneortzymuj¹ceolej (oleumproiniecitone;Pofla,Warszawa) II.I (zowlieeurmzêtparokoinniertoclnitoeneo;rtPzyomfluaj,¹Wcearoslzeajwa) .I I zwierzêtadowiadczalneortzymuj¹ce ; m u c i n o i p o r p m u n o r e t s o t s e T ( n o r e t s o t s e t . A . S e n z c y t u e c a m r a F o w t s r o i b ê i s d e z r P a fl e J ) a r ó G a i n e l e J . V I zwierzêtadowiadczalneortzymuj¹ce ; m u c i n o i p o r p m u n o r e t s o t s e T ( n o r e t s o t s e t . A . S e n z c y t u e c a m r a F o w t s r o i b ê i s d e z r P a fl e J ) a r ó G a i n e l e J Tab. 1. Grupy dowiadczalne myszy
Tab. 2. Wykaz badanych hydrolaz lizosomowych u m y z n e a w z a N Sitnousmowearneynzsykmróut Metoda a n a w k a z a t a f s o F AcP(EC3.1.3.2) Hollande,r1970 (8) b-N-acetylo-hexozaminidaza Hex(EC3.2.1.52) Barret,t1972 (2) b-glukozydaza b-Glu(EC3.2.1.21) Barret,t1972 (2) b-galaktozydaza b-Gal(EC3.2.1.23) Barret,t1972 (2) b-glukuronidaza b-GlcUr(EC3.2.1.31) Barret,t1972 (2) a w o n y c u e l a z a d y t p e p o n i m A LeuAP(EC3.4.11.1) PlfeidereriCelilers,1963 (21) a w o n i n a l a a z a d y t p e p o n i m A AlaAP(EC3.4.11.2) Plfeidereriwsp,.1964 (22) L i D y n y s p e t a K CCaatthh..DL((EECC33..44..2223..155)) LLaannggnneerriiwwsspp,.,.11997733 ((1177)) a w o m o s o zi l a z a p i L LL(EC3.1.1.13) Main,1960 (18) a w o m o s o zi l a z a r e t s E EL(EC3.1.1.2) Main,1960 (18) e n l ó g o o k ³ a i B KrischkeiWiederanders,1984 (12)
Wykonanie oznaczeñ dla AlaAP i LeuAP: 100 µl badanej próby,
1000 µl odpowiedniego substratu,
1 godzina inkubacji w temperaturze 37°C,
1000 µl odczynnika sprzêgaj¹cego po 60 minutach inkubacji,
pomiar ekstynkcji przy d³ugoci fali 540 nm. Wykonanie oznaczenia dla Cath. D i L: 100 µl badanej próby,
50 µl buforu octanowego (100 mM, pH 5,0), 250 µl roztworu azokazeiny,
1 godzina inkubacji w temperaturze 37°C, 200 µl 10% TCA po 60 minutach inkubacji, wymieszanie, odwirowanie,
pomiar ekstynkcji przy d³ugoci fali 366 nm.
Pomiarów ekstynkcji dokonywano spektrofluorymetrem Lambda Bio firmy Perkin-Elmer (USA). Aktywnoæ bada-nych hydrolaz lizosomowych wyra¿ono w nmolach (odpo-wiedniego) substratu/mg bia³ka/godzinê.
W uzyskanych supernatantach lizosomowych oznaczo-no równie¿ poziom bia³ka ca³kowitego (12).
Wszystkie zastosowane w dowiadczeniu substraty pochodzi³y z firmy Serva Feinbiochemica GmbH&Co., Heidelberg, Germany.
Statystyczne okrelenie istotnoci wp³ywu zastosowa-nych w dowiadczeniu czynników dowiadczalzastosowa-nych (ro-dzaj diety bia³kowej, iniekcja oleju, iniekcja testosteronu oraz interakcje miêdzy tymi czynnikami) na aktywnoæ badanych enzymów wykonano, stosuj¹c analizê wariancji wieloczynnikowej przy pomocy procedury GLM, pakietu z testem Duncana (SAS/STAT 1999-2001, Users Guide, SAS Institute Inc. Cary, USA), stosuj¹c nastêpuj¹cy mo-del:
yijk = Pi + Cj + Pi*C j + eijk,
gdzie:
yijk aktywnoæ badanych enzymów w w¹trobie lub w nerce,
Pi sta³y wp³yw poziomu ¿ywienia (i = 1,2),
Cj sta³y wp³yw iniekcji oleju lub testosteronu (j = 1,2), Pi*C
j sta³y wp³yw interakcji poziomu ¿ywienia i
iniek-cji (ij = 1,2,3,4), eijk b³¹d.
Eksperyment zosta³ zatwierdzony przez Komisjê Etycz-n¹ do Badañ nad Zwierzêtami dzia³aj¹c¹ przy Instytucie Genetyki i Hodowli Zwierz¹t PAN w Jastrzêbcu (Nr 18/99).
Wyniki i omówienie
Uzyskane wyniki odnosz¹ siê do zmian aktywnoci enzymów lizosomowych w badanych organach (w¹t-roba, nerki) wywo³anych dzia³aniem czynników do-wiadczalnych w postaci iniekcji testosteronu oraz zró¿nicowanych poziomów ¿ywienia bia³kowego (16% i 10% bia³ka w paszy).
Tab. 3 przedstawia zmiany koncentracji testostero-nu w osoczu krwi myszy kontrolnych po iniekcjach tego hormonu (grupa dowiadczalna). Stê¿enie testo-steronu w osoczu krwi myszy kontrolnych ¿ywionych pasz¹ o 16% zawartoci bia³ka i poddanych nowej iniekcji oleju wynosi³o 60,6 ng/dL. Po dootrzew-nowych iniekcjach testosteronu w dziennej dawce
0,05 mg testosteronu/kg masy cia³a stê¿enie testoste-ronu zwiêkszy³o siê do 160,0 ng/dL (p £ 0,05), co oznacza wzrost stê¿enia testosteronu o 164% wobec wartoci jego stê¿enia w grupie myszy kontrolnych.
W grupie myszy ¿ywionych diet¹ o 10% poziomie bia³ka, stwierdzono wzrost koncentracji testosteronu z 72,5 ng/dL w grupie myszy kontrolnych do 167,0 ng/dL (p £ 0,05) w grupie myszy dowiadczalnych. Oznacza to, ¿e po iniekcjach testosteronu jego stê¿e-nie w grupie osobników dowiadczalnych zwiêkszy³o siê o 130%, wobec wartoci stê¿enia testosteronu w grupie kontrolnej. Dane te wskazuj¹, ¿e koncentra-cja testosteronu po wstêpnych jego iniekkoncentra-cjach ekspe-rymentalnych ponad dwukrotnie przewy¿sza³a wartoæ w surowicy zwierz¹t kontrolnych (160,0 wobec 60,6 ng/dL i 167,0 wobec 72,5 ng/dL), a wiêc testosteron móg³ istotnie oddzia³ywaæ na reaktywnoæ badanych enzymów lizosomowych w w¹trobie i w nerkach.
Z tab. 4 wynika, ¿e po podaniu testosteronu w w¹-trobie myszy ¿ywionych pasz¹ zawieraj¹c¹ 16% bia³-ka nast¹pi³o istotne zwiêkszenie aktywnoci b-glu-kuronidazy o 51% (p £ 0,01), katepsyn D i L o 133% (p £ 0,01), esterazy lizosomowej o 37% (p £ 0,01) oraz lipazy lizosomowej o 133% (p £ 0,01) w porów-naniu z wartociami w grupie kontrolnej. Jednocze-nie iJednocze-niekcja testosteronu wywo³a³a zmJednocze-niejszeJednocze-nie ak-tywnoci b-N-acetylo-hexozaminidazy o 44% (p £ 0,01), b-glukozydazy o 24% (p £ 0,01), b-galaktozy-dazy o 43% (p £ 0,01), aminopeptyb-galaktozy-dazy alaninowej o 48% (p £ 0,01) oraz aminopeptydazy leucynowej o 52% (p £ 0,01). Nie wykazano istotnych zmian ak-tywnoci fosfatazy kwanej.
Jak wynika z tab. 5, w w¹trobie myszy ¿ywionych pasz¹ o 10% zawartoci bia³ka, po podaniu testostero-nu stwierdzono znamienne zwiêkszenie aktywnoci aminopeptydazy leucynowej o 70% (p £ 0,01) i lipa-zy lizosomowej o 75% (p £ 0,01) oraz zmniejszenie aktywnoci fosfatazy kwanej o 35% (p £ 0,01), b-N--acetylo-hexozaminidazy o 36% (p £ 0,01), b-glu-kozydazy o 49% (p £ 0,01), b-galaktozydazy o 55% (p £ 0,01), b-glukuronidazy o 54% (p £ 0,01), ami-nopeptydazy alaninowej o 79% (p £ 0,01), katepsyn
y z s y m y p u r G Tesxto±stseeron zmPriaonceynwtoowbeec il o rt n o k a k ³ a i b % 6 1 a t e i D e n o it c e i n i o r p m u e l O 200µl(konrtola) 60,6±12,1 4 6 1 . c . m g k / g m 5 0 , 0 n o r e t s o t s e T 160,0±25,3* a k ³ a i b % 0 1 a t e i D e n o it c e i n i o r p m u e l O 200µl(konrtola) 72,5±14,1 0 3 1 . c . m g k / g m 5 0 , 0 n o r e t s o t s e T 167,0±30,4*
Tab. 3. Koncentracja testosteronu (ng/dL) w osoczu krwi ba-danych myszy grup kontrolnych (I, III) i dowiadczalnych (II, IV)
D i L o 50% (p £ 0,01) oraz esterazy lizosomowej o 37% (p £ 0,01) w stosunku do wartoci aktywnoci w grupie kontrolnej. Wzrost aktywnoci aminopepty-dazy leucynowej i lipazy lizosomowej w w¹trobie my-szy ¿ywionych pasz¹ o niedostatecznej zawartoci bia³-ka i po podaniu testosteronu wiadczyæ mo¿e o sty-mulowaniu procesu syntezy tych enzymów w warun-kach niedoboru bia³ka w diecie i zmianie tempa meta-bolizmu w komórkach w¹troby wywo³anego nadmia-rem egzogennego testosteronu.
Po iniekcji testosteronu wykazano w nerkach myszy ¿ywionych pasz¹ o 16% po-ziomie bia³ka (tab. 6), zna-mienne podwy¿szenie ak-tywnoci b-glukuronidazy (o 190%; p £ 0,01), ami-nopeptydazy alaninowej (o 52%; p £ 0,01) i estera-zy lizosomowej (o 43%; p £ 0,01 oraz istotne zmniejszenie aktywnoci fosfatazy kwanej (o 57%; p £ 0,01), b-N-acetylo--hexozaminidazy (o 62%; p £ 0,01), b-glukozydazy (o 20%; p £ 0,05) w po-równaniu z aktywnocia-mi w grupie kontrolnej. Nie stwierdzono istotnych zmian aktywnoci b-galak-tozydazy, aminopeptydazy leucynowej, katepsyn D i L oraz lipazy lizosomowej. W nerkach myszy ¿ywionych pasz¹ o 10% zawartoci bia³ka po iniekcji testosteronu (tab. 7) stwierdzono znamienne zwiêk-szenie aktywnoci fosfatazy kwanej o 64% (p £ 0,01), b-ga-laktozydazy o 89% (p £ 0,01), aminopeptydazy alaninowej o 37% (p £ 0,01), aminopepty-dazy leucynowej o 71% (p £ 0,01) i katepsyn D i L o 28% (p £ 0,05) oraz obni¿enie ak-tywnoci b-glukozydazy o 20% (p £ 0,05) i b-glukuronidazy o 32% (p £ 0,05). Nie stwier-dzono istotnych zmian aktyw-noci b-N-acetylo-hexozamini-dazy, esterazy lizosomowej i li-pazy lizosomowej.
Analiza wyników zestawio-nych w tabelach 4-7 dowodzi, ¿e w w¹trobie myszy pozostaj¹cych na obu rodzajach paszy (16% i 10%), po iniekcji testosteronu w przewa¿aj¹cej liczbie odnotowano obni¿enie aktyw-noci badanych hydrolaz. W nerkach myszy pozosta-j¹cych na diecie standardowej (16% bia³ka) liczba istot-nych statystycznie zmian w kierunku zwiêkszenia lub zmniejszenia aktywnoci by³a porównywalna, za w nerkach myszy ¿ywionych diet¹ niskobia³kow¹ (10%) istotny wzrost aktywnoci wykazano w piêciu wypadkach, a jej obni¿enie jedynie w dwóch.
Analiza zmian aktywnoci badanych enzymów w w¹trobie myszy grup kontrolnych (I, III) ¿ywionych Tab. 4. Aktywnoæ enzymów lizosomowych w w¹trobie myszy ¿ywionych pasz¹ o 16%
za-wartoci bia³ka (nmol/mg bia³ka/godz.) po 5 dobach podawania testosteronu; kontrola (olej) = 100%; (Lsmean rednia najmniejszych kwadratów, se b³¹d standardowy szacunku)
Objanienia: ** ró¿nice potwierdzone statystycznie przy p £ 0,01; NS brak istotnoci ró¿nic m y z n E Konrtola %zmian Testosteron wParotroceæntzomwiaan ) 2 : 5 ( c e b o w y n a i m Z il o rt n o k ) 4 : 7 b u l 7 : 4 ( n a e m s L se Lsmean se 1 2 3 4 5 6 7 8 a n a w k a z a t a f s o F 9,06 0,51 100 8,22NS 0,51 191 9 b-N-acetylo -a z a d i n i m a z o x e h - 2,34 0,14 100 1,32** 0,14 156 44 b-glukozydaza 0,58 0,03 100 0,44** 0,03 176 24 b-galaktozydaza 0,72 0,03 100 0,41** 0,03 157 43 b-glukuronidaza 0,71 0,04 100 1,07** 0,04 151 +51 a z a d y t p e p o n i m A a w o n i n a l a 5,53 0,24 100 2,86** 0,24 152 48 a z a d y t p e p o n i m A a w o n y c u e l 6,66 0,17 100 3,18** 0,17 148 52 L i D y n y s p e t a K 0,06 0,10 100 0,14** 0,10 233 +133 a w o m o s o zi l a z a r e t s E 2,24 0,12 100 3,08** 0,12 137 +37 a w o m o s o zi l a z a p i L 2,72 0,32 100 6,33** 0,32 233 +133
Tab. 5. Aktywnoæ enzymów lizosomowych w w¹trobie myszy ¿ywionych pasz¹ o 10% zawartoci bia³ka (nmol/mg bia³ka/godz.) po 5 dobach podawania testosteronu; kon-trola (olej) = 100%; (Lsmean rednia najmniejszych kwadratów, se b³¹d standar-dowy szacunku)
Objanienia: ** ró¿nice potwierdzone statystycznie przy p £ 0,01 m y z n E Konrtola %zmian Testosteron %zmian zmPrioacneynwtoowbeec il o rt n o k n a e m s L se Lsmean se a n a w k a z a t a f s o F 8,63 0,51 100 5,60** 0,51 65 35 b-N-acetylo -a z a d i n i m a z o x e h - 1,27 0,14 100 0,81** 0,14 64 36 b-glukozydaza 0,37 0,03 100 0,19** 0,03 51 49 b-galaktozydaza 0,44 0,03 100 0,20** 0,03 45 55 b-glukuronidaza 0,69 0,04 100 0,32** 0,04 46 54 a z a d y t p e p o n i m A a w o n i n a l a 9,81 0,24 100 2,09** 0,24 21 21 a z a d y t p e p o n i m A a w o n y c u e l 1,50 0,17 100 2,55** 0,17 1701 +70 L i D y n y s p e t a K 0,12 0,10 100 0,06** 0,10 50 50 a w o m o s o zi l a z a r e t s E 1,78 0,12 100 1,13** 0,12 63 37 a w o m o s o zi l a z a p i L 3,60 0,32 100 6,32** 0,32 1751 +75
paszami o 16% i 10% zawar-toci bia³ka pozwala zauwa¿yæ, ¿e w w¹trobie myszy utrzymy-wanych na paszy 10% (tab. 5) w porównaniu z myszami ¿y-wionymi pasz¹ 16% (tab. 4) stwierdzono istotne zwiêkszenie aktywnoci aminopeptydazy alaninowej (z 5,53 do 9,81, p £0,01), katepsyn D i L (z 0,06 do 0,12, p £ 0,01) i lipazy lizosomowej (z 2,72 do 3,60, p £0,01), ale te¿ znamienne zmniejszenie aktywnoci b-N--acetylo-hexozaminidazy (z 2,34 do 1,27, p £ 0,01), b-glukozy-dazy (z 0,58 do 0,37, p £ 0,01), b-galaktozydazy (z 0,72 do 0,44, p £ 0,01), aminopeptydazy leucynowej (z 6,66 do 1,50, p £ 0,01) i esterazy lizosomowej (z 2,24 do 1,78, p £ 0,05). Nie wykazano istotnych zmian aktywnoci fosfatazy kwanej i b-glukuronidazy.
W nerkach myszy pozostaj¹-cych na paszy zawieraj¹cej 10% bia³ka (tab. 7) wykazano istotne podwy¿szenie aktywnoci jedy-nie aminopeptydazy alaninowej (z 34,87 do 46,29, p £ 0,01), ale obni¿enie aktywnoci fosfatazy kwanej (z 49,79 do 16,84, p £ 0,01), b-N-acetylo-hexozamini-dazy (z 12,09 do 6,45, p £ 0,01), b-galaktozydazy (z 2,33 do 1,04, p £ 0,01) wobec wartoci ak-tywnoci tych enzymów w gru-pie myszy utrzymywanych na paszy zawieraj¹cej 16% bia³ka (tab. 6). Nie stwierdzono istot-nych zmian aktywnoci b-gluko-zydazy, b-glukuronidazy, amino-peptydazy leucynowej, katepsyn D i L, esterazy lizosomowej i li-pazy lizosomowej.
Bia³ka odgrywaj¹ zasadnicz¹ rolê w metabolizmie oraz w
pro-cesach wzrostu i rozwoju organizmu (7). Pewna, choæ bardzo niewielka pula bia³ek przyjêtych w nadmiarze wraz po¿ywieniem, magazynowana jest w w¹trobie i miêniach, jednak g³ówna ich czêæ poddawana jest degradacji na szlaku proteolizy realizowanej w lizo-somach (23). Zmiany aktywnoci enzymów lizosomo-wych poza charakterem adaptacyjnym pozostaj¹ w zwi¹zku ze zmian¹ intensywnoci przemian meta-bolicznych, które zabezpieczaj¹ prawid³ow¹ strukturê i funkcje komórki w stanach niedoboru bia³kowego
(11). Badania (6, 19, 24) wskazuj¹, ¿e w wyniku zmia-ny diety standardowej na niskobia³kow¹ dochodzi do wzrostu we krwi poziomu trijodotyroniny, tyroksy-ny, hormonu wzrostu i insulinopodobnego czynnika IGF-1, których podwy¿szony poziom prowadzi do zwiêkszenia intensywnoci transportu aminokwasów do miêni, nasilaj¹c jednoczenie intensywnoæ tocz¹-cych siê tam procesów proteolitycznych. Wzrost ak-tywnoci aminopeptydazy leucynowej i katepsyn D i L w w¹trobie i nerkach myszy ¿ywionych pasz¹ Objanienia: jak w tab. 6.
Tab. 7. Aktywnoæ enzymów lizosomowych w nerkach myszy ¿ywionych pasz¹ o 10% zawartoci bia³ka (nmol/mg bia³ka/godz.) po 5 dobach podawania testosteronu; kon-trola (olej) = 100%; (Lsmean rednia najmniejszych kwadratów, se b³¹d standar-dowy szacunku) m y z n E Konrtola %zmian Testosteron %zmian zmPrioacneynwtoowbeec il o rt n o k n a e m s L se Lsmean se a n a w k a z a t a f s o F 16,84 2,71 100 27,64** 2,71 164 +64 b-N-acetylo -a z a d i n i m a z o x e h - 16,45 0,82 100 6,66NS 0,82 103 +3 b-glukozydaza 10,15 0,01 100 0,12** 0,01 180 20 b-galaktozydaza 11,04 0,17 100 1,97** 0,17 189 +89 b-glukuronidaza 10,54 0,06 100 0,37** 0,06 168 32 a z a d y t p e p o n i m A a w o n i n a l a 46,29 2,76 100 63,42** 2,76 137 +37 a z a d y t p e p o n i m A a w o n y c u e l 21,87 2,09 100 37,33** 2,09 171 +71 L i D y n y s p e t a K 10,07 0,01 100 0,09** 0,01 128 +28 a w o m o s o zi l a z a r e t s E 11,13 0,09 100 1,03NS 0,09 191 9 a w o m o s o zi l a z a p i L 10,25 0,02 100 0,28NS 0,02 112 +12
Tab. 6. Aktywnoæ enzymów lizosomowych w nerkach myszy ¿ywionych pasz¹ o 16% zawartoci bia³ka (nmol/mg bia³ka/godz.) po 5 dobach podawania testosteronu; kon-trola (olej) = 100%; (Lsmean rednia najmniejszych kwadratów, se b³¹d standar-dowy szacunku)
Objanienia: * i ** ró¿nice potwierdzone statystycznie przy p £ 0,05 i p £ 0,01; NS brak istotnoci ró¿nic m y z n E Konrtola %zmian Testosteron %zmian zmPiraonceynwtoowbeec il o rt n o k n a e m s L se Lsmean se a n a w k a z a t a f s o F 49,79 2,71 100 21,29** 2,71 43 57 b-N-acetylo -a z a d i n i m a z o x e h - 12,09 0,82 100 14,57** 0,82 38 62 b-glukozydaza 10,15 0,01 100 0,12** 0,01 80 20 b-galaktozydaza 12,33 0,17 100 1,98NS 0,17 85 15 b-glukuronidaza 10,49 0,06 100 1,42** 0,06 2901 +1901 a z a d y t p e p o n i m A a w o n i n a l a 34,87 2,76 100 53,03** 2,76 1521 +52 a z a d y t p e p o n i m A a w o n y c u e l 25,61 2,09 100 22,80NS 2,09 89 11 L i D y n y s p e t a K 10,07 0,01 100 0,06NS 0,01 86 14 a w o m o s o zi l a z a r e t s E 11,12 0,09 100 1,60** 0,09 1431 +43 a w o m o s o zi l a z a p i L 10,29 0,02 100 0,24NS 0,02 83 17
niskobia³kow¹, gdzie alanina, leucyna i glutamina od-powiadaj¹ za uwolnienie prawie 50% ca³kowitego azo-tu, mo¿e wiadczyæ o naturalnej odpowiedzi przysto-sowawczej komórek tych organów. Jest mo¿liwe, ¿e podczas zagro¿enia nisk¹ poda¿¹ bia³ka lizosomy he-patocytów i komórek nerek, poprzez zmiany aktyw-noci swoich enzymów zabezpieczaj¹ tym komórkom mo¿liwoæ d³u¿szego przetrwania. Wyniki naszych badañ s¹ potwierdzeniem wyników uzyskanych wcze-niej (9, 10) i wskazuj¹, ¿e diety niestandardowe za-równo niskobia³kowe, ale tak¿e wysokobia³kowe mog¹ generowaæ istotne zmiany aktywnoci wszystkich grup enzymów lizosomowych nie tylko w w¹trobie, lecz równie¿ w nerkach.
Iniekcja egzogennego testosteronu w dawce 0,05 mg/kg m.c. u myszy ¿ywionych pasz¹ o 10% zawar-toci bia³ka wywo³a³a ponad dwukrotne zwiêkszenie koncentracji tego hormonu w osoczu krwi, w porów-naniu z jego wartociami w grupie osobników pozo-staj¹cych na diecie standardowej. Wielokrotne iniek-cje testosteronu w w¹trobie badanych myszy (pasza 16% i 10%) w przewa¿aj¹cej liczbie wykazywa³y ob-ni¿enie aktywnoci badanych hydrolaz. W nerkach myszy pozostaj¹cych na paszy o 16% zawartoci bia³-ka liczba istotnych zmian aktywnoci by³a porówny-walna, za w nerkach myszy ¿ywionych pasz¹ 10% przewa¿a³y zmiany w kierunku wzrostów aktywnoci badanych enzymów.
Reasumuj¹c, uzyskane przez nas wyniki wskazuj¹, ¿e wprowadzony egzogennie testosteron oraz niestan-dardowa dieta o obni¿onej zawartoci bia³ka (10%) w istotny sposób oddzia³ywa³y na aktywnoæ badanych hydrolaz komórek w¹troby i nerek. Na tej podstawie mo¿na sugerowaæ, ¿e zak³ócenia homeostazy bioche-micznej testosteronem czy te¿ niedostatecznym udzia³em bia³ka w diecie, zmienia³y aktywnoæ enzy-mów lizosomowych. Ró¿ny stopieñ reaktywnoci tych enzymów w odpowiedzi na egzogenny testosteron za-le¿a³ od badanego organu, rodzaju paszy i enzymu.
Pimiennictwo
1.Alleman F., Michel J., Chagneau A. M., Leclerq B.: The effect of dietary protein independent of essential amino acid of growth and body composition in genetically lean and fat chickens. Br. Poultry Sci. 2000, 41, 214-218. 2.Barrett A. J.: Lysosomal enzymes, [w:] Lysosomes. A Laboratory Handbook
(Dingle J. T.), North-Holland Publ. Co., Amsterdam 1972, 46-135. 3.Beaufay H.: Methods for isolation of lysosomes, [w:] Lysosomes. A
Labora-tory Handbook. (Dingle J. T.), North-Holland Publ. Co., Amsterdam 1972, 1-30.
4.Bhasin S., Storer T. W., Berman N.: Testosterone replacement increases fat mass and muscle protein synthesis in hypogonadal men. J. Clin. Endocrinol. Metab. 1997, 81, 3469-3475.
5.Corwin R. L.: Biological and behavioral consequences of food restriction. Appetite 2000, 34, 112-113.
6.Gonzales E., Buyse J., Loddi M. M., Takita T. S., Buys N., Decuypere E.: Performance, incident of metabolic disturbance and endocrine variables of food restricted male broiler chickens. Br. Poultr. Sci. 1998, 39, 671-678. 7.Grizard J., Dardevet D., Papet I., Mosoni L., Patureau Mirand P., Attaix D.:
Nutrient regulation of skeletal muscle protein metabolism in animals. Nutr. Res. Rev. 1995, 53, 132-156.
8.Hollander V. P.: Acid phosphatases, [w:] The Enzymes (Boyer P. D.), Acade-mic Press, London 1970, 449-498.
9.Jówik A.: Wp³yw zró¿nicowanego ¿ywienia bia³kowego na aktywnoæ enzymów lizosomowych w w¹trobie, nerce i miêniu szkieletowym myszy
selekcjonowanych na wysokie tempo przyrostu masy cia³a. Praca doktorska, Instytut genetyki i Hodowli Zwierz¹t PAN w Jastrzêbcu, Biblioteka Instytu-tu, 2001, 1-102.
10.Jówik A., liwa-Jówik A., Kumañski K., Ko³¹taj A.: The Activity of Lysosomal Enzymes in the Liver, Kidney and the Skeletal Muscle of Mice Remaining on Low Protein Diet. Acta Biol. Cracov. Series. Zool. 2005, 47, 67-72.
11.Kilicalp D., Dede S., Belge F., Tatar M.: Effect of protein deficiency on macroelement and trace element levels of weanling rats small intestine and liver tissues. Biol. Trace Elem. Res. 2005, 107, 255-261.
12.Kirschke H., Wiederanders B.: Methoden zur Aktivitätsbestimmung von Proteinasen. Martin-Luther-Universität, Halle-Wittenberg, Wissenschaftl. Beitr. Halle/Salle 1984, 11-17.
13.Ko³¹taj A., Dymnicki E., Oprz¹dek J., Jówik A., liwa-Jówik A., Oprz¹-dek A.: Influence of starvation and sex on some lysosomal enzymes activity in young dairy cattle. Arch. Tierzucht 2004, 3, 225-230.
14.Ko³¹taj A., Konecka A. M., liwa-Jówik A., Jówik A.: Effect of antioxi-dants on lysosomal enzyme activity in mouse liver, kidney and muscle. I. Effect of vitamin C. Acta Biol. Cracov. Series Zool. 2003 45, 49-53. 15.Ko³¹taj A., Witek B., Ochwanowska E., Baranowska D.,
Kmera-Muszyñ-ska M.: Wp³yw witamin B1, B2, B6 na aktywnoæ enzymów lizosomowych
w w¹trobie i nerce myszy dowiadczalnych. Medycyna Wet. 2006, 62, 347--351.
16.Kubini K., Zachmann M., Albers N., Hiort O., Bettendorf M., Wolfle J., Bidlingmaier R., Klingmiiller D.: Basal Inhibin B and the Testosterone Response to Human Chorionic Gonadotropin Correlate in Prepubertal Boys. J. Clin. Endocrinol. Met. 2000, 85, 134-138.
17.Langner J., Wakil A., Zimmermann M., Ansorge S., Bohley P., Kirschke H., Wiederanders B.: Aktivitätsbestimmung proteolytischer Enzyme mit Azo-kasein als Substrat. Acta Biol. Med. Germ. 1973, 31, 1-18.
18.Main A. R.: The purification of the enzyme hydrolyzing diethyl p-nitro-phenyl phosphate (paraoxon) in sheep serum. J. Biol. Chem. 1960, 74, 11-20. 19.Mc Murtry J. P.: Nutritional amid developmental role of insulin-like growth
factor in poultry. J. Nutr. 1998, 128, 302S-305S.
20.Ochwanowska E.: Wp³yw insuliny i glukagonu na aktywnoæ wybranych enzymów lizosomowych w w¹trobie i nerce myszy utrzymywanych na ró¿-nym poziomie ¿ywienia bia³kowego. Praca doktorska. Biblioteka Akademii Pedagogicznej w Krakowie 2004, 5-62.
21.Pfleiderer G., Celliers P. G.: Isolierung der Aminopeptidase aus Nierenparti-keln. Biochem. Zeitschr. 1963, 339, 186-189.
22.Pfleiderer G., Celliers P. G., Stanulovic M., Wachsmuth E. D., Braunitzer G.: Eigenschaften und analytische Anwendungen der Aminopeptidase aus Nierenpartikeln. Biochem. Zeitschr. 1964, 340, 417-429.
23.Pillay C. S., Elliot E., Dennison C.: Endolysosomal proteolysis and its regu-lation. Biochem. J. 2002, 363, 417-429.
24.Rosenbrought R. W.: Dietary protein levels and the responses of broilers to single or repeated bouts of fasting and refeeding. Nutr. Res. 2000, 20, 877-887.
25.Stojek W., Borman A., Glac W., Baracz-Jówik B., Witek B., Kamyczek M., Tokarski J.: Stress-induced enhancement of activity of lymphocyte lysoso-mal enzymes in pigs of different stress-susceptibility. J. Physiol. Pharm. 2006, 57, supp. 8, 61-72.
26.liwa-Jówik A., Jówik A., Ko³¹taj A.: Influence of exogenous glutathione (GSH), as stress factor, on the activity of lysosome enzymes in some organs of mice. Arch. Tierzucht, Dummerstorf 2002, 45, 3, 307-314.
27.Witek B., Graniczka A., Ochwanowska E., Ko³¹taj A.: Aktywnoæ enzymów lizosomowych w w¹trobie i nerkach myszy po iniekcjach glukagonu. Medy-cyna Wet. 2006, 62, 717-719.
28.Witek B., Ochwanowska E., Rafay J., Ko³¹taj A., Chrenek P., Suvegova K., Jurcik R., Sirotkin A., Darlak K.: Effect of ghrelin on activities of some lysosomal hydrolases in rabbits. Neuroendocrinology Letters 2005, 26, 4, 397-400.
Adres autora: dr hab. Bo¿ena Witek, ul. wiêtokrzyska 15, 25-406 Kielce; e-mail: b.witek@pu.kielce.pl
