Transkrypcja _ przebieg i regulacja_2015_SHORT

Transkrypcja u eukaryota i jej regulacja

Andrzej Jerzmanowski

Co to jest gen - zmieniające się wyobrażenia i

definicje

 _gen

Definicja wg encyklopedii:

 _{Funkcjonalna i fizyczna jednostka}

dziedziczności przekazywana

potomstwu przez rodziców w trakcie mitozy.

 _{Geny są fragmentami DNA,}

większośc genów zawiera informację potrzebna do wytworzenia

specyficznych białek i, w konsekwencji, komórek.

 _{Terapia genowa bada możliwości}

wykorzystania genów do leczenia nowotworów.

Klasyczne wyobrażenie genu – fragment DNA,

który koduje funkcjonalny mRNA

Definicje historyczne

 _{Niektórzy wciąż używają definicji podobnej do tej, z przed pół}

wieku: gen to sekwencja kodująca polipeptyd.

 _{Jest tak zwana definicja ‘jeden gen – jedno białko’. Raczej}

staromodna.

 _{Istnieją geny, które nie kodują białek, choć zwykle, gdy mówimy}

o typowych genach, mamy na myśli właśnie geny kodujące białka. Są geny kodujące przenośnikowe RNA (tRNA),

rybosomalne RNA (rRNA), czy wielkie heterogenne RNA (hnRNA). Żadne z nich nie mają rejonów kodujących białka.

 _{Transkrypt jest produktem funkcjonalnym, często powstającym}

Współczesne definicje odnoszą się do produktu, jakim jest transkrypt, i nie biorą pod uwagę białka



Jak zawsze w biologii, istnieją wyjątki. Oto lista genów, które nie pasują do ‘definicji odnoszącej się do transkryptu’.

Operony: Niekiedy sąsiadujące ‘geny’ są transkrybowane łącznie, co prowadzi do powstania wielkiego początkowego transkryptu zawierającego szereg rejonów

kodujących. W innych wypadkach początkowy transkrypt jest szybko przecinany na liczne funkcjonalne RNA. Nie ma sensu w tej sytuacji odnosić się do

ko-transkrybowanych genów, jako do ‘pojedynczego genu’. Zamiast tego, ‘genami’ nazwiemy odcinki DNA odpowiadające pojedynczym jednostkom funkcjonalnym. Tak więc, operon lac operon zawiera trzy “geny” a operony rRNA zawierają, dwa, trzy lub cztery ‘geny’.

 _{Trans-splicing: Istnieją geny ‘ w kawałkach’. Transkrypt pochodzący z jednego}

fragmentu jest łączony z transkryptem z innego fragemntu, aby mógł powstać funkcjonalny RNA.

 _{Geny nakładające się: Niektóre ‘geny’ nakładają się. Oznacza to, że pojedynczy}

fragment DNA może być częścią dwóch lub nawet trzech genów.

 _{Redagowanie RNA: Niekiedy pierwotny transkrypt ulega intensywnemu redagowaniu}

zanim stanie się transkryptem funkcjonalnym. W najbardziej skrajnych przypadkach dochodzi do wstawiania lub usuwania nukleotydów. Ozna cza to, że zawartość

informacyjna ‘genu’ jest niepełna dla zapewnienia jego funkcjonalności i musi być uzupełniona z udziałem innych ‘genów’

Czy gen obejmuje także sekwencje regulatorowe?

Takie definicje rodzą problemy logiczne i semantyczne.

 _{Nie mówimy, że tylko ‘część’ genu jest transkrybowana, albo że sekwencje}

regulatorowe kontrolują ekspresję ‘części’ genu, co byłoby poprawne, gdyby definicja obejmowała także sekwencje regulatorowe.



Włączając sekwencje regulatorowe do definicji genu, rozmywamy jego tożsamość. W odniesieniu do większości genów nie wiemy, jak daleko

rozciągają się sekwencje regulatorowe, ani gdzie dokładnie są zlokalizowane w stosunku do początku genu. Tak więc tracimy pewnośc, gdzie zaczyna się i gdzie kończy tak zdefiniowany gen.

Nowa definicja genu według Encode

 _{Ten obszar genomu wytwarza trzy transkrypty.}  _{Po alternatywnym splicingu, produkty dwóch z}

tych transkryptów kodują pięć białek, natomiast trzeci traskrypt zawiera informacje o

niekodującym RNA (ncRNA).

 _{Białka są kodowane przez trzy zestawy sekwencji}

DNA łączących różne fragmenty (A, B, i C; D; i E). W przypadku trzech fragmentów (A, B, C), każdy występuje przynajmniej w dwóch białkach. Dwa pierwotne transkrypty mają ten sam nie ulegający translacji rejon 5’, ale ich ulegające translacji rejony D i E nie nakładają się. Ponieważ trzeci transkrypt koduje ncRNA, fakt że jego

fragmenty X i Y pokrywają się z fragmentami genów kodujących białka A i E, nie oznacza, że jest on ko-produktem tych genów.

 _{W sumie, w tym rejonie DNA występują cztery}

geny obejmujące zaznaczone sekwencje: Gen 1 składa się z fragmentów sekwencji A, B, i C; gen 2 to sekwencja D; gen 3 - E; gen 4 składa się z fragmentów sekwencji X i Y.

Kontekst transkrypcji – chromosomy

eukariotyczne

Nukleosomy

Struktury chromatynowe wyższego rzędu

Umiejscowienie transkrypcji w komórce

Zawartość nie kodującego białek DNA (jako % całkowitego

DNA) u różnych organizmów

Płazy cechuje najwyższa zmienność wartości C wśród

kręgowców

 _.  Paradoks wartości C oddaje

niemożliwość wyjaśnienia relacji

między wielkością genomu a funkcją na poziomie organizmu.

 _{Jedną z większych zagadek w biologii}

jest ogromne zróżnicowanie wartości C pomiędzy gatunkami, których

przedstawiciele nie różnią się w

podobny sposób poziomem złożoności.

 _{Skrajne różnice w wartości C}

charakteryzują płazy. Najmniejsze genomy w tej gromadzie zawierają nieco poniżej 109 par zasad, podczas

gdy największe – prawie 1011. Nie jest

możliwe, by do funkcjonowania

jednych płazów potrzeba było 100 razy więcej genów niż do funkcjonowania innych.

Transkrypcja



_{Przetwarzanie informacji z zapisanej w DNA na}

zapisaną w RNA



_{Katalizowana przez zależne od DNA RNA-polimerazy}

RNA zawiera rybonukleotydy,

a nie deoksyrybonukleotydy, jak DNA

Grupa 2’ hydroksylowa w RNA, w DNA ta grupa jest ‘deoksy’ (nie zawiera

atomu tlenu)

U replaces T in RNA Różnice pomiędzy RNA i DNA

RNA jest syntetyzowany w kierunku 5’ 3’

Matryca

DNA

Nowy RNA

3’

5’

3’

5’

Geny mogą być ułożone w różnych kierunkach

Promoter region

Reakcja polimeryzacji RNA

 _{β- i γ-grupy fosforanowe są}

usuwane z dołączanego trifosfonukleozydu, a grupa hydroksylowa jest usuwana z atomu węgla 3′- nukleotydu na końcu łańcucha.

 _{Rozpad powstającego w reakcji}

pirofosforanu przesuwa

równowagę na korzyść reakcji polimeryzacji

Rodzaje RNA w komórkach eukariontów

Initiation

Elongation

Termination

This is a file from the Wikimedia Commons

Typy eukariotycznych polimeraz RNA

Chloroplasty: jak mitochondria

Struktura α-amanityny i innych inhibitorów transkrypcji

Rifampicina hamuje polimerazy prokariotyczne, α-amanityna hamuje eukariotyczną RNA pol II.

Polimerazy RNA u pro- i eukariontów

Homologi Homologi

Kompleks z inhibitorem wiązania RNA

Widok z boku (w przekroju) kompleksu transkrybującego RNA Pol II, ukazujący ułożenie kwasów nukleinowych i lokalizację niektórych elementów

funkcjonalnych enzymu

Bushnell D A et al. PNAS 2002;99:1218-1222

©2002 by The National Academy of Sciences

Duża liczba równoległych łańcuchów DNA tworzy grube

prążki widoczne w chromosomach politenicznych

Kluczowe znaczenie domeny karboksylowej (C-końcowej) RNA Pol II

 “CTD” to domena C-końcowa największej

podjednostki RNA polimerazy II.

 U człowieka liczy ponad 350

aminokwasów złożonych z wielokrotnych powtórzeń 7-aminokwasowego motywu o sekwencji konsensusowej: tyr-ser-pro-thr-ser-pro-ser.

 _{CTD ma kluczowe znacznie dla}

mechanizmów, które łączą zdarzenia po-transkrypcyjne z transkrypcją. Na

przykład, praktycznie wszystkie

kompleksy zaangażowane w obróbkę RNA (RNA processing) zawierają składniki, które wiążą się do CTD.

 _{Wciąż niewiele wiadomo, jak CTD}

lokalizuje się przestrzennie w stosunku do głównej części polimerazy. Wiadomo jedynie, że CTD jest bardzo elastyczna i może się dynamicznie przekształcać w trakcie pełnienia swoich licznych funkcji.

Chromosomy politeniczne uwidocznione za pomocą przeciwciał: czerwone – fosforylowana domena CTD RNA Pol II, zielone - nieufosforylowana domena CTD RNA Pol II. Kolor czerwony kolokalizuje z ’puffami’, w których

Sekwencje regulatorowe w transkrypcji

RNA POL II – promotor i ‘TATA box’

DNA

RNA

Do czego służy regulacja?

‘Włączanie’ i ‘wyłączanie’ genów zależy od

sekwencji DNA i oddziałujących z nimi

Idea działania białek wiążących się do sekwencji

cis-regulatorowych

Operon laktozowy

Prokarionty

Operon tryptofanowy

Promotory

i

Enhancery (wzmacniacze)

Podstawowe elementy bliskiego promotora Pol II

- 10 0 - 5 0 +1 5 0 100

core pro mot e r

C A G A G C A T A T A A G G T G A G G T A G G A T C A G T T G C T C C T C A C C T T

-30 -20 - 1 0 + 1

Sekwencyjny model składania Kompleksu Preinicjacyjnego (PIC) -30 +1 TATA Inr

Polimeryzacja pierwszych kilku

nukleozydotrifosforanów i fosforylacja CTD prowadzą do uwolnienia

promotora. TFIIB, TFIIE i TFIIH dysocjują, PolII+IIF rozpoczyna elongację, a TFIID + TFIIA pozostają na TATA. IIB RNA polimeraza II TFIID

}

IIA _{Pol IIa} IIF IIE

Kompleks preinicjacyjny

TATA Inr

IIA

IIB Pol IIa

IIF IIE

ATP - hydroliza

Kompleks inicjacyjny, DNA na I nukl. stopiony IIH

IIH

= PIC

Activated PIC

TFII A, B, D,E, H, F – Ogólne Czynniki Transkrypcyjne (GTF) TFIID TAFs - TBP Associated Factors CTD

TATA binding protein (TBP) w kompleksie z DNA w rejonie ‘TATA-box’



Elementy cis-regulatorowe w sekwencji

DNA (dalszy promotor, enhancery)

Sekwencje w promotorze Pol II

Motywy sekwencji cis-regulatorowych i czynniki transkrypcyjne (TF) regulujące geny histonów rdzeniowych

Motywy w TF umożliwiające oddziaływania z DNA



_-helix

_{Zinc fingers}

Kompleks Mediatora – wielopodjednostkowy kompleks 25

białek, kluczowy podczas aktywacji RNA polimerazy II w

trakcie inicjacji transkrypcji (odkrywca: R. Kornberg)

Lokalizacja Mediatora w stosunku do Ogólnego Aparatu Transkrypcyjnego (OAT) w układzie aktywacji transkrypcji

CTD Pol II Aktywatory

OAT Pol II

Osobny moduł kompleksu Mediatora odpowiedzialny za represję transkrypcji

Lokalizacja Mediatora w stosunku do Ogólnego Aparatu Transkrypcyjnego (OAT) w układzie represji transkrypcji

Mediator przyłączony do Represora (REPR) zawiera moduł SRB 8-11, który uniemożliwia oddziaływanie z Pol II i OAT

Regulacja przez TF działające na kompleks mediatora

Enhancer

Enhancer

y

y

i

i

Silencer

Silencer

y

y



_{Enhancery stymulują transkrypcję, silencery hamują}

transkrypcję .



_{Jedne i drugie działają niezależnie od orientacji, tj}

odwrócenie ich sekwencji nie wpływa na efekt.



_{Jedne i drugie działają niezależnie od miejsca położenia w}

genomie.

– Mogą działać na odległość w stosunku do promotora

– Enhancery wykrywa się nieomal wszędzie



_{Jedne i drugie stanowią miejsce wiązania dla specyficznie}

regulowanych czynników transkrypcyjnych.



Czynniki transkrypcyjne i

Zawartość i liczebność rodzin czynników transkrypcyjnych u

eukariontów

Gen kontrolujący inne geny za pomocą kodowanego

czynnika transkrypcyjnego

Czynniki transkrypcyjne w ogólnej sieci sygnałowej komórki

Białka stanowiące czynniki transkrypcyjne zaznaczono kolorem niebieskim

Oscylacje różnych czynników transkrypcyjncyh w cyklu dobowym .

Mierzono poziom transkryptów poziom 42 TF z trzech rodzin: MYB, bHLH, i bZIP Hanano et al. BMC Genomics 2008 9:182 doi:10.1186/1471-2164-9-182

Obróbka nowozsyntetyzowanego (prekursorowego)

mRNA



_{Czapeczka “Cap”}

_{jest dodawana na 5’ końcu}

mRNA



_{Introny są usuwane}

Funkcje ‘CAP’

5' cap pełni 4 główne funkcje:

 Reguluje eksport z jądra.

 Zapobiega degradacji przez egzonukleazy.  Promuje translację.

 Promuje wycinanie sąsiadującego z końcem 5’ intronu.

 Eksport RNA z jądra jest regulowany przez Cap Binding Complex (CBC),

który przyłącza się wyłącznie do RENA z ‘CAP’. CBC jest następnie rozpoznawany przez Kompleks Poru Jądrowego i eksportowany.

 Zapobieganie degradacji 5‘ końca przez egzonuklelazy polega na upodobnieniu tego

końca funkcjonalnie do końca 3'. Wydłuża to okres pół-trwania mRNA, co jest niezbędne u eukariontów ze względu na długi czas potrzebny na eksport mRNA z jądra.

 Podczas aktywnej translacji do ‘CAP’ wiąże się czynnik inicjacji translacji eIF-4E,

który następnie przyłącza czynnik eIF-4G i w następstwie, rybosom.

 Usunięcie ‘CAP’ z mRNA jest katalizowane przez kompleks białkowy (Decapping

complex) zawierający czynniki dcp1 i dcp2, które konkurują z eIF-4E o wiązanie z ‘CAP’.

 Mechanizm promowania przez ‘CAP’ wycinania sąsiadującego z 5' końcem intronu

Introny



U prokariontów geny są ciągłe, tj.

kolinearne z ich mRNA.



U wyższych eukariontów geny są

nieciągłe, tj. niekolinearne z ich mRNA.



Części genu ulegające ekspresji noszą

nazwę eksonów, zaś sekwencje

przedzielające eksony – intronów.

Precyzyjne usuwanie intronów



_{Sekwencje konsensusowe oskrzydalające}

miejca:

5’ donorowe i 3’ akceptorowe

nnnnnnG//

GU

n---nnAnn---

AG

//Gnnnnn

Current Drug Discovery Nov. 2004, page 15

W każdej chwili w jądrze komórki ludzkiej odbywa się średnio 63,000

Genom ludzki zawiera 22 tysiące genów, ale koduje

ponad 100 tysięcy białek

• Przyczyna?

• Alternatywny splicing prekursorów

I

II

III

I

II

III

I

III

Alternatywny splicing pre-mRNA

Z jednego genu powstają dwa mRNA kodujące dwa różne białka

Terminacja – dodawanie poliA

NMD- Nonsense-Mediated Decay

System degradacji nieprawidłowych mRNA, zawierających PTC (Premature Terminantion Codon) - przedwczesne kodony terminacyjne translacji

Ścieżka NMD wywiera bezpośredni wpływ na setki zaburzeń genetycznych w populacji ludzkiej. ¼ wszystkich znanych mutacji u człowieka

Świat małych RNA

Czym są małe RNA?

•_{Małe RNA to populacja cząsteczek RNA o}

długości 21 to 24 nt, które generalnie powodują wyciszanie genów (gene silencing)

•_{Małe RNA przyczyniają się do}

potranskrypcyjnego wyciszania genów

(post-transcriptional gene silencing-PTGS) poprzez

negatywne działanie na translację lub stabilność mRNA

•_{Małe RNA przyczyniają się do transkrypcyjnego} wyciszania genów (transcriptional gene

silencing-TGS) poprzez epigenetyczne

modyfikacje chromatyny

AAAAA

RNA Pol

Podstawa wyciszania przez RNA

– białka Dicer i Argonaute

Wyciszanie przez RNA

opiera się na dwóch

podstawowych reakcjach:

a) Dwuniciowy RNA (dsRNA) jest rozcinany przez Dicer i jego

homologi na krótkie dwuniciowe

RNA.

b) Te małe RNA asocjują następnie z białkami rodziny ARGONAUTE i powodują wyciszenie.

DICER

AGO

Dicer i białka podobne do Dicer

From MacRae, I.J., Zhou, K., Li, F., Repic, A., Brooks, A.N., Cande, W.., Adams, P.D., and Doudna, J.A. (2006) Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer. Science 311: 195 -198. Reprinted with permission from AAAS. Photo credit: Heidi

Struktura Dicer’a pozwala mu „mierzyć” RNA, który rozcina. Podobnie jak kucharz szatkujący marchewkę, Dicer tnie RNA na równe

fragmenty.

W biogenezie siRNA i miRNA, Dicer lub białka podobne do Dicer (Dicer-like – DCL proteins) rozcinają dsRNA lub RNA ze spinką (hairpin) na fragmenty ~ 21 – 25 nt.

Białka Argonaute

Reprinted by permission from Macmillan Publishers Ltd: EMBO J. Bohmert, K., Camus, I., Bellini, C., Bouchez, D., Caboche, M., and Benning, C. (1998) AGO1 defines a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development. EMBO J. 17: 170–180. Copyright 1998; Reprinted from Song, J.-J., Smith, S.K., Hannon, G.J., and Joshua-Tor, L. (2004) Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity. Science 305: 1434 – 1437. with permission of AAAS.

Białka ARGONAUTE

wiążą małe RNA i ich cele

Mutant Arabidopsis ago1 i ośmiornica Argonauta argo Białka ARGONAUTE

nazwano tak ze względu na wygląd mutanta

Arabidopsis argonaute1 ;

ago1 ma promieniście

rozłożone liście przez co przypomina ośmiornicę o nazwie Argonauta.

Wyciszanie przez RNA – obraz ogólny

MicroRNA

siRNA

Zastosowania technologii małych

RNA

Huang, G., Allen, R., Davis, E.L., Baum, T.J., and Hussey, R.S. (2006) Engineering broad root-knot resistance in transgenic plants by RNAi silencing of a conserved and essential root-knot nematode parasitism gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 14302–14306. Wyciszanie genów służy do eliminacji alergenów z orzeszków ziemnych. Wyciszanie genów służy do usuwania szkodliwych związków z nasion bawełny, co pozwala na ich zastosowanie jako pokarmu. DNA tworzące siRNA lub miRNA mogą być stabilnie wprowadzane do genomów roślin w celu selektywnego

wyciszenia genów. _Kontrola

zainfekowana przez pasożytniczegio nicienia Oporność indukowana RNAi

Rośliny wyrażające dsRNA

odpowiadające wybranym genom nicienia sa odporne na infekcje. Wchlonietę przez nicienia dsRNA indukuje wyciszenie jego genów.

Podsumowanie

Małe RNA biorą udział w regulacji aktywności i ochronie

genomu; specyficzność ich działania wyciszającego opiera się na parowaniu zasad.

Celami dla siRNA sa bogate w sekwencje powtarzalne rejony heterochromatyny, transpozony, wirusy i inne patogeny.

Celami dla miRNAs i tasiRNAs sa geny regulatorowe wpływające za czasowy i przestrzenny wzór rozwoju,