11-12
(845-846)
2017
POLSKIEGO TOWARZYSTWA CHEMICZNEGO
Publikacja dotowana ze środków MNiSW
Korespondencję należy kierować pod adresem: Redakcja „Wiadomości Chemicznych” ul. F. Joliot-Curie 14, 50-383 Wrocław tel.: 71 375 73 89, tel./fax: 71 322 14 06
e-mail: wchem@wchuwr.pl INTERNET
http://www.wchuwr.pl/wiadchem.htm (English abstracts) http://www.dbc.wroc.pl (pełne teksty publikacji od roku 2006)
„Wiadomości Chemiczne” są wydawane w ramach serii Acta Universitatis Wratislaviensis © Copyright by Redakcja „Wiadomości Chemicznych”, Wrocław 2017
pISSN 0043-5104 eISSN 2300-0295
Maszynopis niniejszego numeru przekazano Wydawcy w grudniu 2017 Przygotowanie do druku i druk:
Firma Wydawnicza K2, e-mail: k2@druk-k2.pl
RADA REDAKCYJNA
RYSZARD ADAMIAK, IRENA BARANOWSKA, ANDRZEJ BARAŃSKI, BOGUSŁAW BUSZEWSKI (PRZEWODNICZĄCY), TADEUSZ GORECKI,
MIETEK JARONIEC, ANATOL KOJŁO, TADEUSZ M. KRYGOWSKI, JERZY LESZCZYNSKI, KRZYSZTOF MATYJASZEWSKI, PIOTR PANETH, JANUSZ PAWLISZYN, K. MICHAŁ PIETRUSEWICZ, DARIUSZ POGOCKI, MAREK POTRZEBOWSKI, SŁAWOMIR RUBINSZTAJN, GRZEGORZ SCHROEDER,
ANDRZEJ W. SOKALSKI, ARTUR P. TERZYK
KOMITET REDAKCYJNY
MARCIN DRĄG, ADAM JEZIERSKI, LESZEK KĘPIŃSKI,
LUDWIK KOMOROWSKI, WITOLD RYBA-ROMANOWSKI, SŁAWOMIR SZAFERT, ANDRZEJ TROCHIMCZUK, KAZIMIERA WILK
REDAKTOR NACZELNY
ZDZISŁAW LATAJKA
SEKRETARZ REDAKCJI
BEATA ŚWIĄTEK-TRAN BARBARA LATKO (FINANSE) KAZIMIERA LUKJAN (KOLPORTAŻ)
NATURALNE I SYNTETYCZNE POCHODNE
5,8-CHINOLINODIONU WYKAZUJĄCE AKTYWNOŚĆ
BIOLOGICZNĄ
NATURAL AND SYNTHETIC 5,8-QUINOLINEDIONE
DERIVATIVES EXHIBITED BIOLOGICAL ACTIVITY
Monika Kadela-Tomanek*, Elwira Chrobak,
Ewa Bębenek, Stanisław Boryczka
Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu Katedra i Zakład Chemii Organicznej
*e-mail: mkadela@sum.edu.pl
Abstract Wprowadzenie
1. Antybiotyki 5,8-chinolinodionowe pochodzenia naturalnego 1.1. Mechanizm działania antybiotyków 5,8-chinolinodionowych 1.2. Zależność struktura-aktywność
2. Syntetyczne analogi antybiotyków 5,8-chinolinodionowych 2.1. Reakcje 6,7-dichloro-5,8-chinolinodionu 19 z aminami 2.2. Reakcje 6,7-dichloro-5,8-chinolinodionu 19 z fenolami 2.3. Reakcje 6,7-dichloro-5,8-chinolinodionu 19 z alkoholami 2.4. Reakcje 6,7-dichloro-5,8-chinolinodionu 19 z tiofenolami Uwagi końcowe
Podziękowanie
Dr n. farm. Monika Kadela-Tomanek ukończyła studia na kierunkach chemia
(2008) oraz biotechnologia (2009) na Wydziale Chemicznym Politechniki Śląskiej w Gliwicach. Od 2009 r. pracuje w Katedrze i Zakładzie Chemii Organicznej Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach. Stopień naukowy doktora nauk farma-ceutycznych uzyskała w 2017 roku. Jej zainteresowania naukowe dotyczą syntezy, analizy struktury oraz oceny aktywności biologicznej acetylenowych pochodnych 5,8-chinolinodionu oraz betuliny.
Dr n. farm. Elwira Chrobak ukończyła studia na Wydziale Chemicznym
Politech-niki Śląskiej w Gliwicach (1986). W latach 1987-1996 pracowała w Katedrze Chemii i Analizy Leków, a od 1996 roku w Katedrze i Zakładzie Chemii Organicznej Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach. Stopień naukowy doktora nauk farmaceutycznych uzyskała w 2005 roku. W ramach realizowanych prac zajmuje się syntezą pochodnych chinotiadiazyny, a także otrzymywaniem oraz analizą struktury związków uzyskiwanych na drodze modyfikacji chemicznej triterpenu – betuliny.
Dr n. farm. Ewa Bębenek ukończyła studia na Wydziale
Matematyczno-Fizyczno--Chemicznym Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach (1996). Od 1996 r. pracuje w Katedrze i Zakładzie Chemii Organicznej na Wydziale Farmaceutycznym z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach. W 2005 r. uzyskała stopień naukowy doktora nauk farmaceutycznych. Realizowane przez nią badania naukowe związane są z syntezą związków pochodzenia naturalnego w grupie triterpenów pentacyklicznych typu lupanu.
Prof. dr hab. n. farm. Stanisław Boryczka ukończył Wydział Chemiczny
Politech-niki Łódzkiej (1973). Od 1980 r. pracuje w Katedrze i Zakładzie Chemii Organicznej Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu Śląskiego Uniwersytetu Medycznego. W 2014 roku otrzymał tytuł naukowy pro-fesora. Jego obecne zainteresowania naukowe koncentrują się na poszukiwaniu nowych związków biologicznie aktywnych w grupie chinolin i triterpenów penta-cyklicznych typu lupanu.
ABSTRACT
The compounds produced by a living organisms are most commonly used as medicinal agents and starting materials to the preparation of new semi-synthetic derivatives. It is estimated that over 23% of currently used medicinal products are natural substances. Natural compounds and their semisynthetic derivatives are most often used in the treatment of cancer and the treatment of infectious diseases.
One of the groups of compounds obtained from Gram-positive bacterium are 5,8-quinolinedione antibiotics, like: streptonigrin, lavendamycin and streptonigron. The all compounds exhibit high anticancer, antimicrobial and antiviral activity. Unfortunately due to high toxicity this alkaloids did not find place in the therapy. The mechanism of action depends on interaction of compounds with the nicotina-mide quinone oxidoreductase 1 (NQO1). The 5,8-quinolinedione can be reduced by the NAD(P)H as a cofactor to form the semiquinone or hydroquinone intermedia-tes. These compounds can react with oxygen yielding a regenerated 5,8-quinoline-dione fragment and creating the hydroxyl radicals, which are ultimately responsible for the DNA strands cleavage.
The structure–activity relationship study has shown that the most important part of the molecule is the 5,8-quinolinedione moiety. Furthermore, it was found, that the introduction of amine, hydroxyl or thiol substituents at position 6 or 7 of the 5,8-quinolinedione moiety results in an enhanced biological activity.
A lot of synthetic derivatives of 5,8-quinolinediones which containing amine, alkoxyl and thiol groups at the C-6 or/and C-7 positions have been obtained during the last few years. Commonly this compounds are obtained in the reaction of 6,7-dichloro-5,8-quinolinedione with nucleophilic factor. Depending on the reac-tion condireac-tions, mono- or di-substituted derivatives are obtained. Most of synthesi-zed compounds exhibit high biological activity, like: anticancer, antibacterial, anti-viral, anti-inflammatory.
Keywords: 5,8-quinolinedione, streptonigrin, lavendamicin, biological activity Slowa kluczowe: 5,8-chinolinodion, streptonigryna, lawendamycyna, aktywność biologiczna
WPROWADZENIE
Substancje pochodzenia naturalnego od tysięcy lat były wykorzystywane jako panaceum na wszelkie dolegliwości. Głównymi źródłami pozyskiwania tego rodzaju związków są: rośliny, zwierzęta, grzyby oraz mikroorganizmy. Związki pochodzenia naturalnego stały się punktem wyjścia do poszukiwania nowych półsyntetycznych pochodnych o wyższej aktywności biologicznej, lepszej biodostępności oraz niższej toksyczności. Szacuje się, że obecnie ponad 23% stosowanych środków leczniczych stanowią substancje pochodzenia naturalnego. Związki naturalne oraz ich półsynte-tyczne pochodne najczęściej wykorzystywane są w terapii przeciwnowotworowej oraz w leczeniu chorób zakaźnych [1]. Ważnym aspektem badań nad nowymi lekami jest opracowywanie metod otrzymywania całkowicie syntetycznych związków w oparciu o struktury znanych substancji naturalnych, wykazujących aktywność biologiczną.
Antybiotyki przeciwnowotworowe takie jak: antracykliny, mitomycyny i bleomycynę pozyskano z promieniowców z rodzaju Streptomyces. Pochodne antra-cyklinowe, wykazują wiele niepożądanych działań ubocznych, powodują uszko-dzenie mięśnia sercowego oraz szpiku kostnego, pomimo to, należą do jednych z najskuteczniejszych cytostatyków. Do grupy najczęściej stosowanych antracyklin zaliczamy doksorubicynę oraz mitoksantron, które wykorzystuje się w leczeniu chłoniaków złośliwych oraz białaczek [2].
Cząsteczki antracyklin zbudowane są z czteropierścieniowego aglikonu połączo-nego wiązaniem glikozydowym z resztą cukrową. Występowanie w aglikonie pier-ścienia 1,4-chinonu strukturalnie łączy te związki z antybiotykami opartymi o układ 5,8-chinolinodionu. Przeciwnowotworowe działanie naturalnych antybiotyków 5,8-chinolinodionowych polega na uszkodzeniu DNA poprzez generowanie wol-nych rodników oraz hamowaniu topoizomerazy II. Przeprowadzone badania wykazały znaczną toksyczność tych związków co spowodowało, że nie znalazły one i prawdopodobnie już nie znajdą zastosowania w lecznictwie. Wysoka aktywność przeciwnowotworowa pochodnych zawierających układ 5,8-chinolinodionu stała się podstawą do poszukiwania prostych, w pełni syntetycznych analogów, o podob-nym do związków naturalnych mechanizmie działania oraz niższej toksyczności [3–5].
1. ANTYBIOTYKI 5,8-CHINOLINODIONOWE POCHODZENIA NATURALNEGO
Układ 5,8-chinolinodionu jest fragmentem struktury związków posiadających szerokie spektrum aktywności biologicznej obejmujące m.in. działanie
przeciwno-wotworowe, drobnoustrojowe czy przeciwmalaryczne. Do takich związków należą naturalne antybiotyki aminochinonowe zwane streptonygrynoidami [6].
Pierwszym poznanym antybiotykiem była streptonygryna 1 wyizolowana w 1959 roku ze szczepu bakterii Gram-dodatnich Streptomyces floccules [3]. Trzy lata później związek ten pozyskano ze szczepów bakterii Streptomyces rufochromogenes i Streptomyces echinatus, nadając mu nazwę rufochromomycyny, a następnie w 1966 tę samą substancję uzyskano z promieniowców Actinomyces albus var. bruneomy-cini nazywając ją bruneomycyną [7, 8]. Ostatecznie w 1968 roku przyjęto wspólną nazwę – streptonygryna 1 [9]. Związek ten jest słabo rozpuszczalny w wodzie, roz-cieńczonych alkoholach, octanie etylu, dichlorometanie i chloroformie, natomiast dobrze rozpuszcza się w dioksanie, pirydynie, dimetyloformamidzie oraz tetrahy-drofuranie [10].
Budowę antybiotyku 1 opisali w 1963 roku Rao, Biemann i Woodward opierając się na analizie widm spektroskopowych oraz badaniach produktów degradacji che-micznej. Stwierdzili oni, że alkaloid 1 składa się z czterech sześcioczłonowych pierś-cieni (A, B, C i D), z których A i B tworzą fragment 5,8-chinolinodionu. Ponadto w pozycjach C-6 i C-7 układu 5,8-chinolinodionu występują odpowiednio grupy metoksylowa oraz aminowa [11]. Ostatecznie struktura chemiczna streptonygryny 1 została potwierdzona przez Chiu i Lipscomb’a w 1975 roku poprzez analizę rent-genostrukturalną monokryształu związku 1, w postaci solwatu z octanem etylu w stosunku molowym 1:1 [12].
Alkaloid 1 posiada szeroki zakres aktywności biologicznej obejmującej działanie przeciwnowotworowe, przeciwbakteryjne, przeciwwirusowe oraz przeciwgrzybicze. Wysoką aktywność cytotoksyczną tego związku zaobserwowano w stosunku do linii komórek nowotworów: płuc, piersi, sutka, jajników, jelita grubego, mięsaków, czer-niaków, chłoniaków oraz białaczek. Skuteczność działania przeciwnowotworowego streptonygryny 1 w stosunku do linii komórek białaczek spowodowała rozpoczęcie w latach 60 ubiegłego wieku badań klinicznych nad zastosowaniem go w skojarzonej chemioterapii przeciwnowotworowej. Niestety ze względu na wysoką toksyczność, związaną z długotrwałym zahamowaniem czynności szpiku kostnego, badania zakończono na etapie drugiej fazy w 1977 roku [4, 13].
Streptonygryna 1 powoduje zmniejszenie wzrostu bakterii Gram-dodatnich, Gram-ujemnych, bakterii kwasowych, bakterii beztlenowych oraz grzybów. Wyka-zuje również właściwości przeciwwirusowe w stosunku do wirusa HIV oraz pta-siego retrowirusa (AMV-RT) [5].
Po 22 latach od odkrycia streptonygryny 1, ze szczepu bakterii Strepomy-ces lavendulae, zespół Balitza wyizolował czerwony krystaliczny związek, który nazwano lawendamycyną 2. Ograniczona rozpuszczalność związku 2 w większo-ści rozpuszczalników organicznych utrudniła otrzymanie go w postaci kryształów, a niska wydajność jego izolacji uniemożliwiła przeprowadzenie degradacji chemicz-nej. Dopiero zastosowanie metod spektroskopowych oraz wysokorozdzielczej spek-trometrii mas doprowadziło do określenia struktury chemicznej alkaloidu 2 [14].
Lawendamycyna 2 jest pentacyklicznym związkiem, który zawiera dwa hetero-cykliczne ugrupowania: 5,8-chinolinodionu oraz indolopirydyny. Alkaloid 2 wyka-zuje szerokie spektrum aktywności farmakologicznej, obejmujące działanie: prze-ciwnowotworowe, przeciwwirusowe, przeciwgrzybiczne oraz przeciwbakteryjne. Porównując działanie związków 1 i 2 stwierdzono, że ugrupowanie β-karboliny (skondensowane pierścienie C, D i E) korzystnie wpływa na wzrost aktywności przeciwnowotworowej, przeciwgrzybiczej oraz przeciwwirusowej. Obydwa antybio-tyki charakteryzują się wysoką toksycznością, jednak dawka toksyczna (TD) lawen-damycyny 2 wynosi 12,9 mg/kg, a wartość TD wyznaczona dla streptonygryny 1 wynosi 0,52 mg/kg [15, 16].
W 1985 roku ze szczepu promieniowców Streptomyces floccules, uzyskano kolejny antybiotyk 7-amino-5,8-chinolinodionowy jako produkt uboczny podczas izolacji streptonygryny 1, nadając mu nazwę streptonygron 3 [6, 17].
Strukturę chemiczną związku 3 wyznaczono metodami spektroskopowymi, poprzez porównanie widm jedno- i dwuwymiarowych NMR z widmami otrzyma-nymi dla streptonygryny 1. Stwierdzono, że różni się on od alkaloidu 1 obecnością w pozycji C-2’ grupy karbonylowej zamiast grupy karboksylowej. Antybiotyk 3 wykazuje słabe właściwości przeciwnowotworowe oraz nie posiada działania prze-ciwbakteryjnego [6, 17].
W 2007 roku z żyjących u wybrzeży Nowej Zelandii żachw Alpidium conicum pozyskano dwa związki o nazwie ascidiatiazyny 4a i 4b, których budowę ustalono metodami spektroskopowymi [18].
Ascidiatiazyny A 4a i B 4b są tricyklicznymi alkaloidami zawierającymi układ 5,8-chinolinodionu skondensowany z pierścieniem 1,1-diokso-4-tiomorfoliny. Formy A i B różnią się od siebie ułożeniem fragmentu tiazynowego, co potwier-dzono w oparciu o analizę widm 1H–13C HMBC. Ponadto ascidiatiazyna B 4b
zawiera dodatkowe wiązanie podwójne w pierścieniu C [18].
Związki 4a-b wykazują silne działanie przeciwzapalne oraz słabe właściwości przeciwnowotworowe. Pochodna 4a charakteryzuje się ponad 3-krotnie wyższą aktywnością przeciwzapalną oraz ponad 5-krotnie niższą aktywnością cytotok-syczną wobec ludzkiej linii komórkowej białaczki promielocytarnej (HL-60) od ascidiatiazyny B 4b [18, 19].
1.1. MECHANIZM DZIAŁANIA ANTYBIOTYKÓW 5,8-CHINOLINODIONOWYCH
Od momentu odkrycia właściwości biologicznych naturalnych antybiotyków 7-amino-5,8-chinolinodionowych rozpoczęto badania nad poznaniem mechanizmu ich działania. Jednak pomimo wielu lat badań nie został on do końca wyjaśniony.
Wydaje się, że największy wpływ na aktywność biologiczną tej grupy związków ma ugrupowanie chinonowe, które jest naturalnym substratem NAD(P)H dehydro-genazy chinonowej 1 (NQO1) [5]. Dehydrogenaza ta jest cytozolowym enzymem odpowiedzialnym za transport protonów do wewnętrznej błony mitochondrialnej [20]. Mechanizm działania streptonygryny 1, lawendamycyny 2 oraz streptony-gronu 3 polega na dwuelektronowej redukcji układu chinonowego do hydrochi-nonu, a następnie utlenieniu go do semichinonu. Produktem ubocznym reakcji jest rodnik hydroperoksydowy (HO·
2), który ulega rozkładowi na wolny rodnik
hydrok-sylowy, uważany za główne źródło uszkodzeń DNA [5, 20].
Podwyższoną zawartość enzymu NQO1 zaobserwowano w komórkach wielu typów nowotworów, m. in. płuc, piersi, okrężnicy i wątroby. Stwierdzono że,
zaawan-sowane stadia guza oraz guzy z przerzutami wykazują wyższy poziom białka NQO1, niż te w początkowej fazie rozwoju [21, 22].
Kolejnym sposobem oddziaływania antybiotyków 1–3 z DNA jest tworzenie silnych wiązań koordynacyjnych z cząsteczką DNA, w wyniku których następuje rozerwanie wiązań wodorowych i rozdzielenie helisy DNA na dwa pojedyncze łań-cuchy. Kompleks antybiotyku z DNA tworzy się na początku fazy S cyklu komórko-wego i może indukować proces apoptozy [23].
Antybiotyki 5,8-chinolinodionowe 1–3 mogą także wpływać na aktywność topoizomerazy II poprzez tworzenie wiązań wodorowych zarówno z centrum aktywnym enzymu jak i z zasadami nukleotydowymi DNA. Konsekwencją takich oddziaływań jest utworzenie stabilnego potrójnego kompleksu, który uniemożliwia powtórną ligację DNA, a tym samym zapoczątkowuje kaskadę procesów apoptozy prowadzących do śmierci komórki [24, 25].
Wykazano, że antybiotyki 5,8-chinolinodionowe 1–3 pośrednio wpływają na cyklazę guanylową, która jest enzymem zależnym od rodnika tlenku azotu. Enzym ten pełni istotną rolę w przekazywaniu sygnału komórkowego. Wytworzone pod-czas redukcji semichinonu do hydrochinonu wolne rodniki hydroksylowe reagują z rodnikiem tworząc kwas azotowy(III). Brak tlenku azotu przyczynia się do dez-aktywacji cyklazy guanylowej, co powoduje zakłócenia w odpowiedzi komórki na bodźce zewnętrzne. Przypuszcza się, że wysoka toksyczność naturalnych antybioty-ków 5,8-chinolinodionowych 1–3 związana jest z zaburzeniami w przekazywaniu sygnałów komórkowych [26].
Innym enzymem, z którym oddziałują antybiotyki 7-amino-5,8-chinolino-dionowe jest odwrotna transkryptaza retrowirusów, takich jak: wirus HIV oraz AMV-RT [27, 28].
1.2. ZALEŻNOŚĆ STRUKTURA-AKTYWNOŚĆ
Ze względu na interesujący profil działania farmakologicznego antybiotyków 5,8-chinolinodionowych, a jednocześnie ich wysoką toksyczność podjęto bada-nia nad określeniem zależności struktura-aktywność (SAR), która pozwala ustalić grupy funkcyjne oraz fragmenty cząsteczki odpowiedzialne za aktywność biolo-giczną. Poznanie zależności SAR umożliwia otrzymywanie pochodnych o wyższej skuteczności działania, a jednocześnie niższej toksyczności.
Poszukiwania struktury wiodącej antybiotyków 1–3 rozpoczęto od otrzymania związku 5, który w porównaniu ze streptonygryną 1 nie zawiera pierścienia feny-lowego D. Związek ten wykazuje taką samą aktywność przeciwbakteryjną wobec szczepu baterii Bacillus subtilis oraz przeciwnowotworową wobec linie białaczki limfoblastycznej (CCRF/CEM jak alkaloid 1. Na tej podstawie stwierdzono, że pierś cień D nie wpływa na działanie biologiczne antybiotyków 7-amino-5,8-chino-linodionowych 1–3 [7, 29].
Kolejnym etapem badań było otrzymanie pochodnej 6, która w porównaniu z naturalnym antybiotykiem 1 w pozycji C-2’ zamiast grupy karbonylowej zawiera grupę metylową oraz w pozycji C-5’ nie posiada ugrupowania aminowego. Zwią-zek 6 nie wykazuje działania przeciwnowotworowego wobec linii komórek ludzkiej białaczki limfoblastycznej (CCRF/CEM) [7, 30, 31]. Otrzymane wyniki sugerują, że istotną rolę w kreowaniu aktywności biologicznej odgrywają modyfikacje pierście-nia C.
Celem określenia wpływu podstawników w pierścieniu C na działanie przeciw-nowotworowe otrzymano pochodne 7–9 [7, 30, 31].
Cząsteczka związku 7 posiada podstawnik karboksylowy przy atomie węgla C-2’ w pierścieniu pirydynowym, a pochodna 8 niepodstawiony pierścień piry-dynowy C. Dla związku 8 wartość IC50 wobec linii komórek ludzkiej białaczki lim-foblastycznej (CCRF/CEM) jest ponad 23-krotnie wyższa niż dla pochodnej 7 co wskazuje na wyraźny wpływ grupy karboksylowej w pozycji C-2’ na wzrost aktyw-ności cytotoksycznej [5, 7]. Zamiana pierścienia pirydynowego na pierścień feny-lowy podstawiony w pozycjach C-2’ i C-5’ odpowiednio grupą karboksylową i ami-nową (pochodna 9) powoduje utratę aktywności cytotoksycznej wobec badanej linii komórek nowotworowych [5]. Można zatem przypuszczać, że pierścień pirydynowy oraz grupa karboksylowa w pozycji C-2’ są niezbędne do zachowania aktywności przeciwnowotworowej.
mentu 5,8-chinolinodionowego i grupy karboksylowej w pierścieniu pirydynowym zawierają odpowiednio podstawniki metoksykarbonylowe [5].
Brak aktywności przeciwnowotworowej oraz przeciwbakteryjnej pochodnych 10 i 11 sugeruje, że jest ona uwarunkowana obecnością ugrupowania 5,8-chinolino-dionu [5]. W celu potwierdzenia tej tezy zsyntetyzowano azastreptonygrynę 12, w której grupę karbonylową przy atomie węgla C-8 zastąpiono podstawnikiem imi-nowym, uzyskując związek pozbawiony aktywności farmakologicznej [30–33]. Taki wynik świadczy o tym, że ugrupowanie 5,8-chinolinodionu jest ważnym elementem strukturalnym naturalnych antybiotyków warunkującym ich działanie biologiczne [5, 30–33].
Ostatni etap badań zależności struktura-aktywność obejmował określenie wpływu podstawników w pozycjach C-6 i C-7 pierścienia 5,8-chinolinodionu na działanie biologiczne związków 1–3.
Otrzymane syntetyczne pochodne 13–14 wykazują aktywność przeciwnowo-tworową w stosunku do linii komórek: ludzkiej białaczki limfoblastycznej (CCRF/ CEM), mysich białaczek (L-1210 i P388) oraz mysiego czerniaka (B16) [5]. Wartość
IC50 wobec linii komórkowej B16 dla 7-amino-5,8-chinolinodionu 14 jest ponad 7-krotnie niższa niż dla pochodnej 13. Związek 14 wykazuje również wyższą aktyw-ność przeciwbakteryjną w stosunku do bakterii Gram-ujemnych niż 7-amino--6-metoksy-5,8-chinolinodion 13. Na tej podstawie stwierdzono, że wprowadzenie grupy metoksylowej w pozycję C-6 niekorzystnie wpływa na aktywność przeciw-bakteryjną oraz przeciwnowotworową pochodnych 5,8-chinolinodionu [5].
Związki 15 i 16, które w pozycji C-7 zamiast grupy aminowej (streptony-gryna 1) mają odpowiednio grupę hydroksylową lub metoksylową, nie wykazują działania przeciwnowotworowego. Zatem dla zachowania aktywności biologicznej istotną rolę odgrywa obecność grupy aminowej w pozycji C-7 [34]. W latach póź-niejszych stwierdzono, że zastąpienie tego podstawnika inną grupą np. tiolową [15], alkiloaminową [33, 35], alkilową [15] lub atomem fluorowca [15, 33, 35] prowadzi do zwiększenia aktywności biologicznej.
2. SYNTETYCZNE ANALOGI ANTYBIOTYKÓW 5,8-CHINOLINODIONOWYCH
Pierwsze syntetyczne pochodne 5,8-chinolinodionu otrzymano już w 1884 roku, czyli ponad 70 lat przed odkryciem streptonygryny 1, jednak chemia tych związków rozwinęła się dopiero w latach 50. ubiegłego wieku [36].
Jednym z pierwszych zsyntetyzowanych związków był 6-metoksy-5,8-chinoli-nodion 17, otrzymany w reakcji utleniania 6-metoksy-5,8-diaminochinoliny. Zwią-zek 17 został wykorzystany do wprowadzenia grupy aminowej na drodze wymiany podstawnika metoksylowego [37].
W reakcji związku 17 z heksyloaminą lub 3-(N,N-dietyloamino)propyloaminą w środowisku metanolu w temperaturze pokojowej uzyskano z wysokimi wydaj-nościami (73–75%) pochodne aminowe 18a-b [37].
W ostatnich latach substratem najczęściej stosowanym w syntezie nowych pochodnych 5,8-chinolinodionu jest 6,7-dichloro-5,8-chinolinodion 19, który otrzymuje się poprzez utlenianie 8-hydroksychioliny za pomocą chloranu(V) sodu w obecności kwasu chlorowodorowego w temperaturze 60°C [35].
2.1. REAKCJE 6,7-DICHLORO-5,8-CHINOLINODIONU 19 ZAMINAMI
Reakcje 6,7-dichloro-5,8-chinolinodionu 19 z arylo- i alkiloaminami zachodzą na drodze substytucji nukleofilowej atomu chloru i prowadzą do uzyskania pochod-nych aminowych. Brak regioselektywności tej przemiany prowadzi do powstania trudnej do rozdzielania mieszaniny 6- i 7-amino podstawionych izomerów. Z tego powodu syntetyczna przydatność takiej reakcji jest mała. W celu zwiększenia selek-tywności reakcji podstawienia wykorzystuje się katalizator cerowy. Przypuszcza się, że jony ceru tworzą wiązania koordynacyjne z atomem azotu pierścienia 5,8-chi-nolinodionu i jednocześnie oddziaływają elektrostatycznie z atomem tlenu grupy karbonylowej w pozycji C-8. Powoduje to przesunięcie ładunku ujemnego w stronę grupy karbonylowej, a tym samym pojawienie się ładunku dodatniego na atomie węgla C-6 (struktura 20) [28].
Otrzymane 6-aryloaminowe pochodne 21 wykazują wysoką aktywność cyto-toksyczną, przeciwgrzybiczą oraz przeciwbakteryjną wobec bakterii Gram-dodat-nich. Porównując działanie związków 21a-b stwierdzono, że zamiana atomu chloru na atom fluoru korzystnie wpływa na wzrost aktywności przeciwnowotworowej wobec ludzkich linii nowotworu jajnika (SK-OV-3), jelita grubego (HTC-15) oraz
czerniaka (SK-MEL-2). W grupie badanych pochodnych najwyższe działanie wyka-zywał związek 21b, dla którego wartości IC50 wobec badanych linii komórek
nowo-tworowych mieściły się w zakresie 0,28–0,38 µg/ml. Pochodna 21b charakteryzuje się także wysoką aktywnością przeciwbakteryjną oraz przeciwgrzybiczą [28, 38].
Wielopierścieniowe układy aromatyczne zawierające fragment 1,4-benzochi-nonu swoją budową przypominają antybiotyki antracyklinowe, które są szeroko wykorzystywane w chemioterapii. Stało się to punktem wyjścia do syntezy tetracy-klicznych pochodnych 5,8-chinolinodionu [27, 30, 32].
W reakcji 6,7-dichloro-5,8-chinolinodionu 19 z pochodnymi aniliny pro-wadzonej w obecności jonów ceru w środowisku etanolu otrzymano 6-aminowe pochodne 22a-c, które następnie poddano cyklizacji z udziałem azydku sodu uzy-skując tetracykliczne związki 23a-c [30].
N N
N O
O
R 22a R = OCH3 wyd. 82 %
22b R = OC2H5 wyd. 91 % 22c R = OCHCH3 wyd. 74 % CH3 19 22 N O O Cl Cl N O O H N R Cl Ce+2/EtOH H2N R NaN3/
23a R = OCH3 wyd. 24 % 23b R = OCH2CH3 wyd. 42 % 23c R = OCHCH3 wyd. 48 %
CH3 23
Spośród pochodnych 23a-c najwyższą aktywność przeciwnowotworową in vitro wobec ludzkich linii komórek nowotworowych płuc (A549), okrężnicy ( HCT-15) oraz czerniaka (SK-MEL-2) wykazał związek 23c, dla którego wyznaczone wartości IC50 były niższe od otrzymanych dla zastosowanego wzorca, doksorubicyny [30].
Opisaną wyżej metodę wykorzystano również w syntezie imidazolowych pochodnych 5,8-chinolinodionu 24a-c [27].
Związki 24a-c charakteryzują się wysokim działaniem cytotoksycznym wobec ludzkich linii komórek nowotworów jajnika (SK-OV-3) i czerniaka (SK-MEL-2), o wartościach IC50 mieszczących się w zakresie 0,0052–0,347 µg/ml [27].
Bardziej systematyczne badania wpływu jonów metali na regioselektywność jednoetapowej reakcji kondensacji 6,7-dichloro-5,8-chinolinodionu 19 z pirydyną i acetylooctanem etylu w etanolu opisali Dafent i in. (Tab. 1) [39]. W każdym przy-padku otrzymano mieszaninę złożoną z pochodnej 25, w której atomy azotu ułożone
są względem siebie w sposób N,N-syn, będącej odpowiednikiem 7-podstawionego związku oraz 26 o ułożeniu atomów azotu N,N-anty, która odpowiada 6-podstawio-nemu produktowi. t.pok. 4' 4' N O O Cl Cl N CH3CCH2COEt O O EtOH N O O N COOEt N O O N COOEt 19 25 26 + + +
Stosunek ilościowy powstających produktów 25 i 26 określono za pomocą spektroskopii 1H NMR porównując intensywność sygnału pochodzącego od atomu
wodoru H-4’. Dla pochodnej 25 sygnał ten występował przy wartości 9,94 ppm, a dla związku 26 przy wartości 9,80 ppm [39].
Tabela 1. Skład mieszaniny produktów 25 i 26 w zależności od rodzaju zastosowanego katalizatora Table 1. Composition of product 25 and 26 depending on the type of catalyst used
Lp. Katalizator Stosunek produktów 25:26
1. – 64:36
2. CeCl3·7H2O 22:78
3. NiCl2·6H2O 22:78
Zgodnie z przedstawionymi danymi w reakcji prowadzonej bez katalizatora powstaje głównie produkt 25 (Tab. 1). Wprowadzenie do środowiska reakcji chlorku ceru(III) lub chlorku niklu(II) umożliwia otrzymanie głównie związku 26 o konfi-guracji N,N-anty [39]. Przeprowadzone badania aktywności przeciwnowotworowej wykazały, że izomer 25 posiada wyższą aktywność cytotoksyczną od pochodnej
26, wobec linii ludzkich komórek nowotworowych gruczolakoraka płuc (GLC-82),
piersi (MCF-7) i białaczki promielocytarnej (HL-60) [40].
Otrzymane wyniki badań stały się przesłanką do opracowania selektywnej metody syntezy 7-aminopodstawinych pochodnych. Pierwszym etapem była ocena wpływu rozpuszczalnika na skład powstającej mieszaniny produktów.
Reakcję 6,7-dichloro-5,8-chinolinodionu 19 z azyrydyną wykonano w obec-ności trietyloaminy w środowisku dioksanu, tetrahydrofuranu (THF) lub etanolu (Tab. 2).
Kierunek reakcji podstawienia ustalono w oparciu o analizę przesunięć che-micznych sygnałów atomów wodorów H-2 i H-4 w widmach 1H NMR mieszaniny
produktów. Dla pochodnej 7-azyrydynylowej 27 przesunięcia chemiczne tych sygnałów wynoszą odpowiednio 8,91 ppm i 8,37 ppm, a dla związku 28 – 8,93 ppm i 8,35 ppm. Niezależnie od zastosowanego rozpuszczalnika otrzymano trudną do rozdzielenia mieszaninę dwóch izomerów, której skład wyrażony jako stosunek ilo-ściowy powstających produktów 27 i 28 przedstawiono w Tabeli 2 [41].
Tabela 2. Skład mieszaniny produktów 27 i 28 w zależności od użytego rozpuszczalnika Table 2. Composition of product 27 and 28 depending on the type of solvent used
Lp. Rozpuszczalnik Stosunek produktów 27:28
1. Dioksan 95:5
2. THF 96:4
3. Etanol 48:52
Przeprowadzone badania wykazały, że rozpuszczalnik znacząco wpływa na przebieg reakcji. Głównym produktem reakcji przeprowadzonej w rozpuszczalniku aprotonowym, takim jak: dioksan czy tetrahydrofuran była 7-aminopodstawiona pochodna 27. Zastosowanie rozpuszczalnika protonowego, takiego jak etanol pre-feruje powstawanie związku 6-podstawionego, ponieważ prawdopodobnie rozpusz-czalnik protonowy ułatwia powstawanie ładunku dodatniego na atomie węgla C-6, podobnie jak w pochodnej 20, a tym samym ułatwia reakcję substytucji nukleofi-lowej.
Innym przykładem otrzymywania związków 7-aminopodstawionych jest reak-cja 6,7-dichloro-5,8-chinolinodionu 19 z metyloaminą zachodząca w mieszaninie rozpuszczalników 1,4-dioksanu i pirydyny w stosunku molowym 1:2. W opisy-wanych warunkach głównym produktem był związek 7-podstawiony 29 uzyskany z wydajnością 67% [42]. 1,4-dioksan, Py 19 29 30 N O O Cl NHCH3 N O O Cl Cl CH3NH2 temp. pok. N O O NHCH3 Cl
Na podstawie badań aktywności przeciwnowotworowej in vitro wobec linii komórek ludzkiej białaczki promielocytarnej (HL-60) stwierdzono, że 6-metyloaminowa pochodna 30 wykazuje wyższą aktywność cytotoksyczną w porównaniu ze związkiem 29. Przeprowadzono także badania toksyczności w sto-sunku do limfocytów T, które biorą udział w odpowiedzi immunologicznej przeciw czynnikom wewnątrzkomórkowym, takim jak wirusy czy komórki nowotworowe. Otrzymane wyniki badań sugerują, że pochodna 30 nie wykazuje toksycznego dzia-łania wobec limfocytów T [42].
Kolejnym etapem badań nad otrzymywaniem 7-aminopodstawionych związków była reakcja związku 19 z propyloaminą prowadzona w obecności węglanu potasu w tetrahydrofuranie. Otrzymaną mieszaninę regioizomerów rozdzielono za pomocą chromatografii kolumnowej, uzyskując czyste związki 31–32 z wydajnościami odpowiednio 72% i 18% [43]. N O O Cl Cl + CH3CH2CH2NH2 Ktemp. pok.2CO3, THF N O O NHCH2CH2CH3 Cl N O O Cl NHCH2CH2CH3 + 19 31 32
Analiza rentgenostrukturalna głównego produktu potwierdziła, że jest to zwią-zek 7-aminopodstawiony 31 [43].
Przedstawioną powyżej metodę wykorzystano także do syntezy alkinyloamino-wych pochodnych 5,8-chinolinodionu 33–34.
6 7 7 6 a R1 = H, R2 = CH2C CH b R1 = CH3, R2 = CH2C CH c R1 = H, R2 = CC CH3 CH CH3 N O O N Cl R2 R1 N O O N R2 R1 Cl N O O Cl Cl HNR1R2 + + 19 33 34 K2CO3, THF rt. 3h
Związki 31-34 poddano ocenie aktywności przeciwnowotworowej wobec ludzkich linii nowotworów piersi (T47D), glejaka mózgu (SNB-19) oraz czerniaka (C-32). Pochodne acetylenowe 33a-c i 34a-c wykazywały silniejsze działanie wobec wszystkich linii nowotworowych w porównaniu do związków 31 i 32. Zauważono, że aktywność antyproliferacyjna aminoacetylenowych pochodnych 33-34 oznaczona wobec linii C-32 i SNB-19 zależy od rodzaju ugrupowania aminowego i układa się w następującym porządku: N-metylopropargiloamina < 1,1-dimetylopropargilo-amina < propargilo1,1-dimetylopropargilo-amina [44].
2.2. REAKCJE 6,7-DICHLORO-5,8-CHINOLINODIONU 19 Z FENOLAMI
W literaturze opisano kilkadziesiąt 6- lub 7-aminopodstawionych 5,8-chinoli-nodionów o wysokiej aktywności biologicznej [27, 39, 42–44]. Znacznie mniej wia-domo na temat wprowadzania do cząsteczki 5,8-chinolionodionu podstawników fenoksylowych oraz działania biologicznego tego typu połączeń. Jest to najprawdo-podobniej spowodowane trudnościami w ich syntezie i oczyszczaniu.
Początkowo w celu otrzymania fenoksylowych pochodnych 5,8-chinolino-dionu próbowano wykorzystać warunki opracowane dla reakcji wprowadzania pod-stawników aminowych czyli zastosować siedmiowodny chlorek ceru(III) w etanolu lub trietyloaminę w tetrahydrofuranie [39, 41]. Okazało się, że w opisanych wyżej
warunkach nie uzyskano fenoksylowych pochodnych 5,8-chinolinodionu. Zamiana chlorku ceru(III) na węglan cezu oraz zastosowanie jako rozpuszczalnika tetrahy-drofuranu umożliwiło otrzymanie trudnej do rozdzielnia mieszaniny produktów 35 i 36 [45]. N O O Cl Cl OH R 19 35 36 N O O Cl O OCH3 Cs2CO3, THF rt, 24h N O O O Cl OCH3
Analizując widma 1H NMR mieszaniny stwierdzono, że w reakcji powstały
dwa monopodstawione związki 35 i 36 w stosunku molowym 1:1. Skład określono w oparciu o różnice przesunięć chemicznych sygnałów pochodzących od atomów wodoru H-4 [45].
Interesującym przykładem 5,8-chinolinodionów z grupą fenoksylową są tetracykliczne pochodne 38a-b, które otrzymano podczas dwuetapowej syntezy z 6,7-dichloro-5,8-chinolinodionu 19. W pierwszym etapie zachodzi reakcja kon-densacji związku 19 z rezorcyną w toluenie z dodatkiem pirydyny, która jednocze-śnie stanowiła katalizator reakcji [24].
N O O Cl Cl N O O O OH HO OH 19 37 Toluen/Py reflux PhN(C2H5)3Cl K2CO3, CH3Cl RCl, HCl, H2O N O O O OR 38 a R = CH(CH3)CH2N(CH3)2 b R = CH2CH(CH3)N(CH3)2
Następnie związek 37 przekształcono w pochodne eterowe w reakcji z chlorkiem N,N-dimetyloaminoalkilowym. Syntezę prowadzono w obecności węglanu potasu i chlorku fenylotrietyloamoniowego w układzie chloroform–woda. Pochodne 38a-b wykazują wysoką aktywność cytotoksyczną wobec ludzkich linii komórek nowo-tworowych płuc (A549), jajnika (SK-OV-3), białaczki promielocytarnej (HL-60) oraz czerniaka (SK-MEL-2). Ponadto selektywnie hamują aktywność topoizome-razy II nie wpływając na działanie topoizometopoizome-razy I [24].
2.3. REAKCJE 6,7-DICHLORO-5,8-CHINOLINODIONU 19 Z ALKOHOLAMI
W ostatnich latach ukazały się prace dotyczące syntezy i oceny aktyw-ności przeciwnowotworowej alkoksylowych i alkinyloksylowych pochodnych 5,8-chinolinodionu [46, 47]. Opisywane związki otrzymano w reakcji 6,7-dichloro--5,8-chinolinodionu 19 z odpowiednimi alkoholami w obecności węglanu potasu. W zależności od zastosowanego rozpuszczalnika uzyskano 7-mono- lub 6,7-dialkoksy- podstawione pochodne.
K2CO3, THF rt, 3 h K2CO3, DMSO rt, 3 h N O O Cl Cl + ROH N O O OR OR N O O Cl OR 19 39 40 CH2CH2CH3 CH2CH CH2 CH2CH2CH2CN CH2C CH CH2C CCH2Cl CH2C CCH2OC O CH2C CCH2OCCH CH O a R = g R = f R = e R = d R = c R = b R =
W reakcji prowadzonej w środowisku tetrahydrofuranu powstały monopod-stawione pochodne 39a-f. Analiza widm spektroskopowych 1H i 13C NMR nie
pozwoliła w sposób jednoznaczny określić miejsca podstawienia grupy alkok-sylowej. Dopiero analiza rentgenostrukturalna monokryształów związków 39c oraz 39d potwierdziła ich strukturę jako 7-podstawionych pochodnych [46, 47]. Zmiana rozpuszczalnika na dimetylosulfotlenek (DMSO) umożliwiła otrzymanie 6,7-dialkoksylowych 5,8-chinolinodionów, których strukturę potwierdzono w opar-ciu o widma spektroskopowe 1H i 13C NMR [46, 47].
Pochodne 39-40 wykazywały wysoką aktywność wobec ludzkich linii czer-niaka (C-32) oraz glejaka mózgu (SNB-19). Najwyższą aktywność zaobserwowano w stosunku do komórek linii czerniaka (C-32), dla której wartości IC50 mieściły się w zakresie 0,11–7,36 µM [46, 47]. Według danych literaturowych mecha-nizm działania związków zawierających ugrupowanie 1,4-benzochinonu polega na oddziaływaniu z NAD(P)H dehydrogenazą chinonową (NQO1) [5, 48, 49]. Z tego powodu alkinyloksylowe pochodne zostały przebadane wobec dwóch linii nowotworów piersi (MDA-MB-231 oraz MCF-7), które różnią się poziomem tego enzymu w komórkach. Przeprowadzone badania wykazały, że związki 39d-g i 40d-g charakteryzują się silniejszym działaniem w stosunku do komórek linii MCF-7, w których stężenie enzymu NQO1 jest podwyższone. Stało się to przesłanką do zasto-sowania metody modelowania molekularnego w celu określenia sposobu oddziały-wania pochodnych 39d-g i 40d-g z enzymem. Modelowanie molekularne zostało wykonane metodą grid-based Find Binding Pockets zaimplementowaną w progra-mie CLC DDWB. Jako ligandy wykorzystano związki 39d-g, 40d-g oraz cisplatynę. Na podstawie otrzymanych wyników stwierdzono, że pochodne zawierające układ 5,8-chinolinodionu (19, 39d-g i 40d-g) mocniej wiążą się z enzymem niż cisplatyna. Zauważono, że zmiana powinowactwa badanych związków do enzymu NQO1 układa się w następującym porządku: 6,7-dipodstawione 40d-g > 7-podstawione 39d-g > 6,7-dichloro-5,8-chinolinodion 19. Analiza kompleksów enzymu z pochodnymi
39d-g i 40d-g wykazała, że ugrupowanie 5,8-chinolinodionu tworzy silne
oddzia-ływania hydrofobowe typu π-π z resztami tryptofanu (Trp 105), tyrozyny (Tyr 128) oraz fenyloalaniny (Phe 178). Ponadto w miejscu wiążącym NQO1 tworzy się wią-zanie wodorowe pomiędzy grupą karbonylową w pozycji C-5 a tyrozyną (Trp 126) [47].
2.4. REAKCJE 6,7-DICHLORO-5,8-CHINOLINODIONU 19 Z TIOFENOLAMI
W literaturze opisano również układy 5,8-chinolinodionu zawierające grupy tiofenolowe, które otrzymano w reakcji pomiędzy związkiem 19 a pochodnymi tio-fenolu prowadzonej w środowisku etanolu. Zastosowanie dwukrotnego nadmiaru tiofenolu umożliwiło wymianę dwóch atomów chloru i powstanie 6,7-dipodstawio-nych pochod6,7-dipodstawio-nych 41a-c [50].
N O O Cl Cl OH R 19 35 36 N O O Cl O OCH3 Cs2CO3, THF rt, 24h N O O O Cl OCH3
Najwyższą aktywność w stosunku do gatunku Candida albicans wykazuje zwią-zek 41a, dla którego wartość MIC wynosi 3,2 µg/ml. Wprowadzenie dodatkowego podstawnika w pozycję para pierścienia fenylowego, tak jak w przypadku pochod-nych 41b i 41c, korzystnie wpływa na działanie przeciwgrzybicze w stosunku do grzybów Aspergillus niger [50].
UWAGI KOŃCOWE
Odkrycie pod koniec lat pięćdziesiątych XX wieku naturalnych antybiotyków 5,8-chinolinodionowych stworzyło nadzieję na wprowadzenie nowego sku-tecznego leku przeciwnowotworowego. Badania kliniczne nad wprowadze-niem antybiotyków do terapii chorób nowotworowych zakończono na etapie II fazy ze względu na wysoką toksyczność tego rodzaju połączeń. Poznanie przy-puszczalnych mechanizmów działania tych związków jak również zależności struktura-aktywność zapoczątkowało rozwój badań nad otrzymywaniem ich syntetycznych analogów, o prostszej budowie, charakteryzujących się podob-nym działaniem biologiczpodob-nym oraz niższą toksycznością. Przeprowadzone w ostatnich latach badania nad syntezą, aktywnością biologiczną oraz mechani-zmem działania aminowych, alkoksylowych oraz tiofenolowych pochodnych 5,8-chinolinodionu wniosły istotny wkład w rozwój chemii układów chinolinodio-nowych.
PODZIĘKOWANIE
Praca wykonana w ramach badań statutowych Śląskiego Uniwersytetu Medycz-nego w Katowicach (KNW-2-011/N/7/N).
PIŚMIENNICTWO CYTOWANE
[1] J. Solecka, J. Zajko, A. Rajnisz, M. Postek, Gaz. Farm., 2012, 21, 36. [2] J. Lown, Mol. Cell. Biochem., 1983, 55, 17.
[3] K.V. Rao, W.P. Cullen KV, Antibiot. Annu., 1960, 7, 950. [4] A. Bolzan, M. Bianchi, Mut. Res., 2001, 488, 25.
[5] D. Boger, M. Yasuda, L. Mitscher, S. Drake, P. Kitos, S. Thompson, J. Med. Chem., 1987, 30, 1918. [6] B. Chan, M. Ciutolini, J. Org. Chem., 2007, 72, 8489.
[7] G. Bringmann, Y. Reichert, V. Kane, Tetrahedron, 2004, 60, 3539.
[8] E. Kudrina, O. Olkhovatova, L. Muraveva, G. Gauze, Antibiotiki, 1966, 11, 400.
[9] M. Brazhnikova, I. Ponomarenko, E. Kovsharova, E. Kruglyak, V. Proshlyakova, Antibiotiki, 1968,
13, 99.
[10] M. Harding, G. Long, C. Brown, J. Med. Chem., 1993, 36, 3056. [11] K. Rao, K. Biemann, R. Woodward, J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 2532. [12] Y.Y. Chiu, W. Lipscomb, J. Am. Chem. Soc., 1975, 52, 2525.
[13] T. Donohoe, C. Jones, A. Kornahrens, L. Barbosa, L. Walport, M. Tatton, M. O’Hagan, A. Rathi, D. Baker, J. Org. Chem., 2013, 78, 12338.
[14] D. Balizt, J. Bush, W. Bradner, T. Doyle, F. O’Herron, D. Nettleton, J. Antibiot., 1982, 35, 259. [15] W. Cai, M. Hassani, R. Karki, E. Walter, K. Koelsch, H. Seradj, J.P. Lineswala, H. Mirza
ei, J.S. York, F. Olang, M. Sedighi, J.S. Lucas, T.J. Eads, A.S. Rose, S. Charkhzarrin, N.G. Her-mann, H.D. Beall, M. Behforouz, Bioorg. Med. Chem., 2010, 18, 1899.
[16] L. Golodberg, V. Baumshtein, Antibiotiki, 1967, 12, 132. [17] A. Herlt, W. Rickards, J. Wu, J. Antibiot., 1985, 38, 516.
[18] A. Pearce, E. Chia, M. Berridge, G.R. Clark, J.L. Harper, L. Larsen, E.W. Maas, M.J. Page, N.B. Perry, V.L. Webb, B.R. Copp, J. Nat. Prod., 2007, 70, 936.
[19] E.W. Chia, A.N. Pearce, M.V. Berridge, L. Larsen, N.B. Perry, C.E. Sansom, C.A. Godfrey, L.R. Han-ton, G.L Lu, M. WalL.R. Han-ton, W.A. Denny, V.L. Webb, B.R. Copp, J.L. Harper, Bioorg. Med. Chem., 2008, 16, 9432.
[20] J. Berg, J. Tymoczko, L. Stryer, Biochemia, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2005. [21] T. Fryatt, D. Goroski, Z. Nilson, C. Moody, H. Beall, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1999, 9, 2195. [22] C. Ryu, H. Jeong, L. S. H. You, C. K. J. Shim, H. Y., C. Lee, Arch. Pharm. Res., 2001, 24, 390. [23] N. Mizuno, D. Gilbeo, Biochim. Bioppys. Acta., 1970, 224, 319.
[24] H. Rhee, H. Park, S. Lee, C. Lee, H. Choo, Bioorg. Med. Chem., 2007, 15, 1651.
[25] F. Leteurtre, G. Kohlhagen, Y. Pommier, Biochem. Biophys. Pres. Commun., 1994, 203, 1259. [26] I. Severin, N. Pyatakova, A. Postnikov, M. Preobrazhenskaya, Y. Khropov, Eur. J. Pharmacol., 2004,
483, 127.
[27] M. Suh, M. Kang, H. Yoo, S. Park, C. Lee, Bioorg. Med. Chem., 2000, 8, 2079. [28] K. H.-J. Ryu Ch-K, Arch. Pharm. Res., 1994, 17, 139.
[29] K. Rao, J. Heterocycl., 1977, 14, 653.
[30] Y. Kim, S. Park, H. Lee, M. Suh, D. Schollmeyer, C. Lee, Bioorg. Med. Chem., 2003, 11, 1709. [31] A. Kende, P. Naegely, Tetrahedron Lett., 1978, 19, 4775.
[32] M. Sush, S. Park, C. Lee, Bioorg. Med. Chem., 2001, 9, 2979. [33] I. Shaikh, F. Johnson, A. Grollman, J. Med. Chem., 1986, 29, 1329.
[34] N. Mizuno, Mechanism of action of antieukaryotic and antiviral compounds, Heidelberg, Verlag Berlin 1979.
[35] M. Hassani, W. Cai, D. Holley, J. Lineswala, B. Maharjan, G. Ebrahimian, H. Seradj, M. Stocksdale, F. Mohammadi, C. Marvin, J. Gerdes, H. Beall, M. Behforouz, J. Med. Chem., 2005, 48, 7733. [36] Y. Pratt, J. Org. Chem., 1962, 27, 3905.
[37] Y. Pratt, N. Drake, J. Am. Chem. Soc., 1955, 71, 37.
[38] C. Ryu, H. Kang, Y. Yi, C. Lee, Arch. Pharm. Res., 2000, 23, 42. [39] A. Defant, G. Guella, I. Mancini, Eur. J. Org. Chem., 2006, 18, 4201.
[40] Y. Cheng, L.K. An, N. Wu, X.D. Wang, X.Z. Bu, Z.S. Huang, L.Q. Gu, Bioorg. Med. Chem., 2008,
16, 4617.
[41] E. Yoon, H. Choi, K. Shin, K. Yoo, D. Chi, D. Kim, Tetrahedron Lett., 2000, 41, 7475.
[42] B. Mulchin, C. Newton, J. Baty, C. Grasso, W. Martin, M. Walton, E. Dangerfield, C. Plunkett, M. Berridge, J. Harper, M. Timmer, B. Stocker, Bioorg. Med. Chem., 2010, 18, 3238.
[43] M. Jastrzebska, S. Boryczka, M. Kadela, R. Wrzalik, J. Kusz, M. Nowak, J. Mol. Struct., 2014, 1067, 160.
[44] M. Kadela-Tomanek, M. Jastrzębska, E. Bębenek, E. Chrobak, M. Latocha, J. Kusz, D. Tarnawska, S. Boryczka, Crystals, 2017, 7, 15.
[45] D. Lee, J. Ko, K. Lee, Monatsh. Chem., 2007, 138, 741.
[46] M. Kadela, M. Jastrzębska, E. Bębenek, E. Chrobak, M. Latocha, J. Kusz, M. Książek, S. Boryczka, Molecules, 2016, 21, 156.
[47] M. Kadela-Tomanek, M. Jastrzębska, B. Pawełczak, E. Bębenek, E. Chrobak, M. Latocha, M. Ksią-żek, J. Kusz, S. Boryczka, Eur. J. Med. Chem., 2017, 126, 969.
[48] A. Atia, N. Alrawaiq, A. Abdullah, J. Appl. Pharm. Sci., 2014, 4, 118.
[49] C. Keyari, A. Kearns, N. Duncan, E. Eickholt, G. Abbott, H. Beall, P. Diaz, J. Med. Chem., 2013, 56, 3806.
[50] C. Ryu, Y. Sun, J. Shim, H. You, K. Choi, H. Lee, Arch. Pharm. Res., 2002, 25, 795. Praca wpłynęła do Redakcji 22 listopada 2017
KWAS α-LIPONOWY – ANTYUTLENIACZ
ANTYUTLENIACZY – WŁAŚCIWOŚCI I METODY
OZNACZANIA
α-LIPOIC ACID – ANTIOXIDANT OF ANTIOXIDANTS
– PROPERTIES AND DETERMINATION METODS
Agata Skorupa*, Sławomir Michałkiewicz
Uniwersytet Jana Kochanowskiego, Instytut Chemii ul. Świętokrzyska 15G, 25-408 Kielce
*e-mail: agata.skorupa@ujk.edu.pl
Abstract
Wykaz stosowanych skrótów Wprowadzenie
1. Kwas α-liponowy – właściwości fizykochemiczne 2. Kwas α-liponowy – właściwości biochemiczne 3. Metody oznaczania
3.1. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) 3.2. Chromatografia cienkowarstwowa (TLC)
3.3. Chromatografia gazowa (GC) 3.4. Spektrofotometria
3.5. Elektroforeza kapilarna (CE) 3.6. Metody elektrochemiczne
3.7. Oznaczanie LA związanego w lipolizynę Uwagi końcowe
Dr Agata Skorupa w 2006 r. ukończyła studia chemiczne
na Wydziale Matematyczno-Przyrodniczym Akademii Świętokrzyskiej (obecnie Uniwersytet Jana Kochanow-skiego w Kielcach). Stopień doktora nauk chemicznych uzyskała w marcu 2016 r. na tym samym Wydziale. Pra-cuje na stanowisku asystenta w Zakładzie Chemii Ana-litycznej Instytutu Chemii UJK. Jej zainteresowania naukowe koncentrują się wokół właściwości elektroche-micznych substancji o znaczeniu biologicznym.
Dr hab. Sławomir Michałkiewicz prof. UJK ukończył
w 1989 r. studia chemiczne na Wydziale Matematyczno--Przyrodniczym Wyższej Szkoły Pedagogicznej w Kiel-cach (obecnie Uniwersytet Jana Kochanowskiego). Sto-pień doktora nauk chemicznych uzyskał w 1998 r. na Wydziale Chemii UMCS w Lublinie, a doktora habili-towanego (dziedzina nauk chemicznych, dyscyplina chemia) na Akademii Górniczo-Hutniczej w Krakowie w 2013 r. Pracuje na stanowisku profesora nadzwyczaj-nego w Zakładzie Chemii Analitycznej Instytutu Che-mii UJK w Kielcach. Tematyka badawcza obejmuje właściwości elektrochemiczne i woltamperometryczne oznaczanie substancji bio-chemicznie czynnych.
ABSTRACT
Attention has been paid to healthy lifestyle in recent years. This is possible through increased physical activity and proper nutrition. This involves a significant increase in the interest in natural ingredients in a human daily diet. They come from both vegetable and animal products. This group of substances includes, for example, ascorbic acid (vitamin C), tocopherol (vitamin E), vitamin D, coenzyme Q10 and others. The important role of many compounds provided with food is their antioxi-dant action, which protects the body against the harmful effects of reactive oxygen species. They also exhibit therapeutic effects in diseases caused by oxidative stress. α-Lipoic acid (LA) also fits well into this group of substances and even gains the title of an “universal antioxidant” and an “antioxidant of antioxidants”.
LA is produced in the human body in small amounts, and its biosynthesis occurs in the mitochondria. It is a compound with a very broad spectrum of therapeutic and biological activity. The amounts produced in the body are not sufficient and should therefore be supplied to the body from external sources. Food is the second, except de novo synthesis, the source of this compound. LA is a great antioxidant that can counteract the effects of aging. It is used mainly in the treatment of diabetic neuropathy and cardiovascular diseases, multiple sclerosis and Alzheimer’s disease.
Such a wide action and occurrence causes the development of determination methods. Literature data indicate that free LA is primarily determined by liquid and gas chromatography, capillary electrophoresis, spectrophotometric and electro-chemical techniques. In plant and animal cells it is mainly in the form of lipoyl-lysine. Determination of such a bound LA requires the proper preparation of the sample. This is usually acid, alkaline or enzymatic hydrolysis.
This review summarizes the basic physicochemical and biochemical properties of α-lipoic acid and the methods of its determination.
Keywords: α-lipoic acid, dihydrolipoic acid, lipoyllysine, antioxidant, determination Słowa kluczowe: kwas α-liponowy, kwas dihydroliponowy, lipolizyna, przeciwutle-niacz, oznaczanie
WYKAZ STOSOWANYCH SKRÓTÓW
Asc – kwas askorbinowy, witamina C
ASE – przyspieszona ekstrakcja rozpuszczalnikowa (ang. accelerated solvent extraction)
ASS – zatężanie przez spiętrzanie w mieszaninie acetoni-trylu i soli (ang. acetonitryl-salt stacking)
BDDE – elektroda diamentowa domieszkowana borem (ang. boron doped diamond electrode)
CE – elektroforeza kapilarna (ang. capillary electrophoresis) CEAD – wielokanałowy detektor kulometryczny (ang.
culome-tric electrode array detector) CL – chemiluminescencja DHAA − kwas dehydroaskorbinowy
DHLA – kwas dihydroliponowy (ang. dihydrolipoic acid) DPV – woltamperometria pulsowa różnicowa (ang.
differen-tial pulse voltammetry)
ε – molowy współczynnik absorpcji Epa – potencjał piku anodowego
ESI-MS – jonizacja przez elektrorozpylanie sprzężona ze spek-trometrią mas (ang. electrospray ionisation mass spec-trometry)
FPD – detektor płomieniowo-fotometryczny (ang. flame photometric detector)
FID – detektor płomieniowo-jonizacyjny (ang. flame ioni-zation detector)
FL – fluorymetria
FTO – elektroda z tlenku cyny domieszkowana fluorem (ang. fluorine-doped tin oxide)
GC – chromatografia gazowa (ang. gas chromatography) GCE – elektroda ze szklistego węgla (ang. glassy carbon
elec-trode)
GSH – glutation, forma zredukowana GSSG – glutation, forma utleniona
HPLC – wysokosprawna chromatografia cieczowa (ang. high performance liquid chromatography)
Ip – natężenie prąd piku
LA – kwas α-liponowy (ang. α-lipoic acid) LLys − lipolizyna (ang. lipoyllysine)
LOD – granica wykrywalności (ang. limit of detection) LOQ – granica oznaczalności (ang. limit of quantification) log Kow − współczynnik podziału n-oktanol/woda w postaci
NADH – dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy
PG/CoPc – elektroda z pirolitycznego grafitu modyfikowana ftalocyjanianem kobaltu (ang. pyrolytic graphite elec-trode modified with cobalt phthalocyanine)
ROS – reaktywne formy tlenu (ang. reactive oxygen species) RP-HPLC – wysokosprawna chromatografia cieczowa w
odwró-conym układzie faz (ang. reverse phase high perfor-mance liquid chromatography)
RP-TLC – chromatografia cienkowarstwowa w odwróconym układzie faz (ang. reverse phase thin layer chromato-graphy)
SWV − woltamperometria fali prostokątnej (ang. square wave voltammetry)
TFA – kwas trifluorooctowy TOH – tokoferol, witamina E
WPROWADZENIE
W ostatnich latach zaczęto przywiązywać dużą wagę do zdrowego trybu życia. Jest to możliwe poprzez zwiększenie aktywności fizycznej oraz prawidłowe odży-wianie. Wiąże się z tym znaczący wzrost zainteresowania udziałem naturalnych składników w codziennej diecie. Pochodzą one zarówno z produktów roślinnych, jak i zwierzęcych. Do tej grupy substancji należą na przykład: kwas askorbinowy (witamina C), tokoferol (witamina E), witamina D, koenzym Q10 oraz inne. Istotną rolą wielu związków dostarczanych z pokarmem jest ich działanie antyutleniające, chroniące organizm przed szkodliwym wpływem reaktywnych form tlenu. Dzięki temu wykazują one również terapeutyczne działanie w chorobach wywoływanych stresem oksydacyjnym. Kwas α-liponowy (LA) także doskonale wpisuje się w tę grupę substancji, a nawet zyskuje miano „uniwersalnego przeciwutleniacza” [1–3] i „antyutleniacza antyutleniaczy” [4].
1. KWAS α-LIPONOWY – WŁAŚCIWOŚCI FIZYKOCHEMICZNE Kwas α-liponowy (LA, kwas tiooktanowy, 6,8-ditiooktanowy,
1,2ditiolo--3-pentanowy, 1,2-ditiolo-3-walerianowy, Rys. 1) ma postać żółtego ciała stałego. Został odkryty przez Snella w 1937 roku, a po raz pierwszy był wyizolowany w for-mie krystalicznej z wątroby bydlęcej przez Reed’a i współpracowników w 1951 r. Początkowo uznawano go za witaminę, ale aktualne badania wykazały, że może być syntezowany przez komórki roślinne i zwierzęce. W komórkach ludzkich LA w małych ilościach może być syntezowany de novo z kwasu oktanowego i cysteiny [5, 6]. Dokładną biosyntezę kwasu α-liponowego, która zachodzi w mitochondriach opisują Malińska i Winiarska [7] oraz Navari-Izzo i współpracownicy [3].
Pierścień ditiolowy występujący w cząsteczce LA może ulegać redukcji, która prowadzi do utworzenia kwasu dihydroliponowego (DHLA). Obydwie formy: kwas α-liponowy i dihydroliponowy wykazują właściwości przeciwutleniające [7, 8].
S S OH O S H OH O S H * * LA DHLA 1 2 3 4 5 6 7 8
Rysunek 1. Struktura kwasu α-liponowego (LA) i dihydroliponowego (DHLA) Figure 1. Structure of α-lipoic acid (LA) and dihydrolipoic acid (DHLA)
Naturalnie kwas α-liponowy najczęściej występuje w połączeniu za pomocą wiązania kowalencyjnego z grupą ε-aminową łańcucha lizyny tworząc lipolizynę (LLys, Rys. 2). Fizjologiczne stężenie LA w surowicy krwi waha się w granicach 1–25 ng mL–1 [5]. Takie ilości nie są wystarczające dla prawidłowego
S S N O O H N O H H H H
Rysunek 2. Struktura lipolizyny (LLys) Figure 2. Structure of lipoyllysine (LLys)
LA jest stabilny jako ciało stałe, łatwo ulega polimeryzacji po podgrzaniu powyżej temperatury topnienia (47,5°C, Tab. 1) lub pod wpływem światła po roz-puszczeniu w obojętnych rozpuszczalnikach [5]. Jest rozpuszczalny zarówno w śro-dowisku wodnym, jak i tłuszczowym, dlatego może jednocześnie chronić błony lipidowe komórek skóry, jak i przestrzenie międzykomórkowe, do których przeni-kają składniki rozpuszczalne w wodzie. Zdolność do rozpuszczania LA w obydwu środowiskach tkwi w chemicznej strukturze cząsteczki. Zarówno LA, jak i DHLA zawierają niepolarny łańcuch alifatyczny, którego obecność sprzyja rozpuszczaniu w rozpuszczalnikach organicznych. Niewielka długość tego łańcucha oraz obecność polarnej grupy karboksylowej powoduje natomiast, że obydwa te związki wyka-zują ograniczoną rozpuszczalność w wodzie. Jest ona jednak mniejsza niż w roz-puszczalnikach niepolarnych [3, 7] (Tab. 1). Stosunkowo mała masa molowa LA (206,33 g mol–1), większa niż kwasu askorbinowego (176,12 g mol–1), ale znacznie
mniejsza niż tokoferolu (430,69 g mol–1) sprawia, że LA wykazuje większą
rozpusz-czalność w wodzie niż TOH. LA i DHLA mają jednocześnie więcej atomów węgla niż kwas askorbinowy, co sprawia, że są lepiej od niego rozpuszczalne w lipofilo-wych błonach komórkolipofilo-wych [3].
Tabela1. Podstawowe właściwości fizykochemiczne kwasu α-liponowego Table 1. The main physico-chemical properties of α-lipoic acid
Postać Żółte ciało stałe
Temperatura topnienia, °C 47,5 [9] Temperatura wrzenia, °C 162,5 [9, 10] Rozpuszczalność w wodzie, g L−1 0,127 [9] Rozpuszczalność w etanolu, g L−1 50 [11] log Kow 3,40 [9] pKa 4,70 [2, 9, 13]4,52 [10, 12],
Molowy współczynnik absorpcji ε, (λ = 332 nm), L mol–1 cm–1 150 [14–16]
LA wykazuje właściwości słabego kwasu. Jego moc jest porównywalna z mocą kwasu octowego (pKa = 4,75 [17]).
Cząsteczka kwasu α-liponowego posiada w swojej strukturze asymetryczny atom węgla w pozycji 6 łańcucha węglowego (Rys. 1). Może więc też występować w postaci dwóch stereoizomerów: R-LA i S-LA [5, 8]. Tylko izomer R-LA jest synte-zowany endogenicznie i może być kowalencyjnie przyłączony przez wiązanie
ami-dowe do lizyny oraz może działać jako kofaktor wspomagający enzymy katalizujące reakcje chemiczne w organizmie [8].
2. KWAS α-LIPONOWY – WŁAŚCIWOŚCI BIOCHEMICZNE
Kwas α-liponowy jest bardzo rozpowszechniony w organizmach żywych. Występuje w komórkach prokariotycznych i eukariotycznych. Jest istotnym elemen-tem łańcucha oddechowego, ważnym i zasadniczym substraelemen-tem w metabolizmie energetycznym i w tworzeniu aminokwasów, a także koenzymem w wieloenzyma-tycznych kompleksach katalizujących oksydacyjną dekarboksylację α-ketokwasów [7]. Literatura podaje wiele zastosowań leczniczych LA. Podstawową właściwością kwasu α-liponowego jest działanie przeciwutleniające. Według Packera i współ-pracowników [18] przeciwutleniacz stosowany w terapii powinien spełniać szereg kryteriów: reagować z wolnymi rodnikami, mieć możliwość chelatowania jonów metali, współdziałać z innymi antyutleniaczami, uczestniczyć w ekspresji genów, a także powinien być łatwo absorbowany z diety oraz koncentrować się w tkankach, komórkach i płynach ustrojowych. Takie właśnie cechy wykazuje LA.
Zarówno kwas α-liponowy, jak i dihydroliponowy, działają jako zmiatacze wolnych rodników. Reaktywne formy tlenu (ROS), które występują w organizmie w stanie homeostazy odgrywają rolę obronną przed patogenami. Będąc w nadmia-rze reagują one jednak z podstawowymi strukturami organizmu: białkami, lipidami i DNA. Reakcje te mogą powodować ich uszkodzenia i wywoływać groźne skutki prowadzące do powstawania wielu chorób [19] oraz przyspieszać proces starze-nia się organizmu [20]. LA reaguje z tlenem singletowym (1O
2), natomiast DHLA
z rodnikiem ponadtlenkowym (O2–•) oraz peroksylowym (LOO•). Obydwa związki
skutecznie unieszkodliwiają rodniki hydroksylowe (OH•) oraz kwas chlorowy(I)
(HOCl) [18, 21].
Wchodząc w reakcję z rodnikowymi i nierodnikowymi ROS, kwas α-liponowy przekształca się w kationorodnik LA+• według równania:
LA + OH• → LA+• + OH– (1)
Kationorodnik ten jest znacznie mniej reaktywny niż ROS i nie stwarza już tak dużego zagrożenia dla komórek, oraz jest łatwo przekształcany ponownie w LA przy udziale innych antyutleniaczy wewnątrzkomórkowych (Asc, TOH) (Rys. 3).
Dzięki niewielkim rozmiarom cząsteczek, kwas α-liponowy potrafi szybko penetrować w głąb komórek ludzkich gdzie przez redukcję grupy ditiolowej jest przekształcany w kwas dihyhroliponowy (DHLA):
S S OH O S H OH O S H + 2H+ + 2e- (2)
Niski ujemny potencjał redoks (E0’ = –0,29V [22] lub –0,32V [3, 23, 24])
powo-duje, że DHLA jest silnym reduktorem. Dzięki temu potrafi skutecznie regenero-wać i przedłużać efektywność witaminy C i E. Wzmacnia działanie innych ważnych przeciwutleniaczy, takich jak koenzymu Q10, glutationu i kwasu dehydroaskorbino-wego (DHAA) poprzez redukcję ich postaci rodnikowych i form utlenionych:
DHLA + GSSG → LA + 2GSH (3) DHLA + DHAA → LA + Asc (4) Procesy te zachodzą zarówno w membranach, jak i fazie wodnej [3, 25, 26] (Rys. 3). Synergistyczne oddziaływanie z innymi przeciwutleniaczami powoduje, że LA zyskuje miano „antyutleniacza antyutleniaczy” [4]. Wpływa on ponadto na obniżenie poziomu NADH, który pełni istotną rolę w procesach oddychania komórkowego [26] (Rys. 3).
Rysunek 3. Interakcje kwasu α-liponowego i dihydroliponowego z innymi przeciwutleniaczami [7] Figure 3. Interactions of lipoic and dihydrolipoic acid with other antioxidants [7]
Zapobieganie stresowi oksydacyjnemu przez kwas α-liponowy i dihydrolipo-nowy wiąże się również z ich zdolnością do chelatowania jonów metali. Jony żelaza, miedzi czy kobaltu jako katalizatory biorą udział w reakcjach enzymatycznych będąc przenośnikami elektronów. W postaci niezwiązanej z białkami mogą jednak przyczyniać się do generowania wolnych rodników. Zarówno LA jak i DHLA two-rzą w roztworach trwałe związki kompleksowe z jonami metali przejściowych, np. Fe2+, Cu2+, Zn2+, Pb2+ eliminując je w ten sposób ze środowiska. DHLA kompleksuje
dodatkowo jony Fe3+, a także Co2+, Ni2+ i Hg2+. Kompleksowanie jonów metali przez
obydwie postaci kwasu α-liponowego zachodzi z udziałem grupy karboksylowej. DHLA wiąże jony metali silniej niż LA, chociaż reakcje te mogą być powodem jego
właściwości prooksydacyjnych, czyli zdolności do uszkadzania innych związków chemicznych i ich zamiany w wolne rodniki. Zaobserwowano, np. że w obecności jonów Fe3+ i Cu2+ może wzrastać stężenie rodnika hydroksylowego. Właściwości
przeciwutleniające przeważają jednak nad niepożądanym działaniem prooksy-dacyjnym [7, 25]. Właści wości chelatujące kwasu α-liponowego chronią ponadto przed konsekwencjami zatruć rtęcią, arsenem, ołowiem i innymi metalami ciężkimi [27–30].
Ze względu na właściwości hepatoprotekcyjne i lipotropowe, LA jest często stosowany także w zatruciach grzybami oraz w leczeniu chorób wątroby powodo-wanych nadużywaniem alkoholu [6].
Kwas α-liponowy wpływa regulująco na metabolizm węglowodanów i lipi-dów co umożliwia stosowanie go przy ograniczeniu przyrostu masy ciała i otyłości, redukcji poziomu lipoprotein o niskiej gęstości (LDL), całkowitego cholesterolu i triglicerydów [31]. Szczególne zastosowanie lecznicze ma w przypadku neuropa-tii cukrzycowej [6, 7]. Wynika to z hamowania akumulacji kwasów tłuszczowych, zwiększając wrażliwość na insulinę u pacjentów chorych na cukrzycę typu dru-giego. Wzrasta tym samym wychwyt glukozy przez wątrobę i mięśnie, a tym samym zmniejsza się jej stężenie we krwi. LA korzystnie wpływa na metabolizm komórek trzustki oraz ułatwia wytwarzanie insuliny, co jest związane ze współdziałaniem tego związku z kompleksem dehydrogenazy pirogronianowej [5, 7, 32].
Właściwości terapeutyczne LA przejawiają się również w zapobieganiu między innymi skutkom starzenia, w leczeniu chorób związanych ze stresem oksydacyjnym. Należą do nich choroby sercowo-naczyniowe [33], stwardnienie rozsiane [8, 34, 35] oraz choroba Alzheimera [36]. Ważną i cenną cechą kwasu α-liponowego jest moż-liwość jego migracji przez barierę krew-mózg, co jest pomocne w przypadku cho-rób neurologicznych. Może on docierać do wszystkich komórek nerwowych gdzie zwiększa poziom glutationu, który pełni rolę swoistego neuroprzekaźnika i niweluje skutki stresu oksydacyjnego powstającego np. w trakcie udarów czy innych chorób mózgowo-naczyniowych. LA może także łagodzić skutki terapii przeciwnowotwo-rowej. W badaniach nad zwierzętami stwierdzono, że w trakcie podawania che-mioterapeutyków zmniejszała się aktywność enzymów antyoksydacyjnych, obniżał poziom przeciwutleniaczy wewnątrzkomórkowych (GSH, TOH i Asc) oraz nasi-lała się peroksydacja lipidów. Suplementacja LA w dużym stopniu zapobiegała tym skutkom [5, 7]. Jest on także pożądanym składnikiem ergogenicznym, czyli dopro-wadzającym do wzrostu sprawności, szybszej regeneracji oraz lepszej wydajności całego organizmu.
Prowadzone są też badania dotyczące wpływu LA na przebieg AIDS, cho-roby wywoływanej przez wirus HIV, który uszkadza i niszczy limfocyty TH. Kwas
α-liponowy przerywa replikację tego wirusa przez całkowite blokowanie aktywacji czynnika jądrowego NF-κB, który jest odpowiedzialny za ekspresję genów wirusa [6, 37].
Zalety terapeutyczne kwasu α-liponowego sprawiają, że wzrasta zainteresowa-nie jego źródłami zewnętrznymi. W układach biologicznych występuje w postaci związanej jako lipolizyna (Rys. 2). Nie wiadomo jednak, czy kompleks ten sam może działać jako przeciwutleniacz, czy służy jako źródło wolnego LA. Dlatego też ostatnie badania skupiają się na określeniu ilości endogennego kwasu α-liponowego w postaci LLys w tkankach roślinnych i zwierzęcych, które są typowymi składni-kami diety człowieka [23, 38].
Rysunek 4. Średnia zawartość lipolizyny w suchej pozostałości wybranych roślin i tkanek zwierzęcych [38]. * – sproszkowana tkanka bydlęca, # – liofilizowana tkanka szczurza
Figure 4. The mean lipoyllysine content of various plant and animal tissues [38]. * – powdered bovine tissue, # – lyophilized rat tissue
Bardzo bogatym źródłem lipolizyny w diecie człowieka są: szpinak, brokuły, pomidory, zielony groszek, brukselka, otręby ryżowe (Rys. 4), a także czerwone mięso i podroby zwierzęce (nerki, serce, wątroba i in.). Stwierdzono jednocześnie, że spożywanie kwasu α-liponowego jedynie wraz z naturalnymi składnikami jest wystarczające do procesów metabolicznych, ale niedostateczne do celów leczni-czych. Spowodowane jest to faktem, że LA jest przyswajany w formie LLys, która następnie ulega hydrolizie we krwi z uwolnieniem kwasu α-liponowego według równania:
(5)
Braki LA mogą być z powodzeniem uzupełniane w postaci syntetycznych suplementów. Przyjmowanie ich z posiłkami zmniejsza jednak biodostępność kwasu. Można temu zapobiec spożywając go na 30 minut przed lub 2 godziny po posiłku [5, 7].
Wiele komercyjnie dostępnych suplementów diety zawiera mieszaninę race-miczną enencjomerów R i S. Badania dowiodły, że łatwiej przyswajalny jest enan-cjomer R-LA (40–50% większe stężenie w osoczu niż S-LA). Może to sugerować, że R-LA jest bardziej odpowiedni do doustnej suplementacji, obecność formy S-LA może jednakże zapobiegać polimeryzacji związku, a tym samym zwiększać jego bio-dostępność [39, 40].
Kwas α-liponowy przejściowo gromadzi się głównie w wątrobie, sercu i mię-śniach szkieletowych, ale także znajduje się w innych tkankach, takich jak jelita czy żołądek. Bardzo szybko jest usuwany z krwioobiegu, co jest wynikiem metabolizo-wania go w wątrobie. Główne ścieżki metabolityczne to β-oksydacja i S-metylacja. W wyniku β-oksydacji, która zachodzi w obszarze łańcucha węglowego bez naru-szenia pierścienia ditiolowego, powstają kwasy: bisnorliponowy i tetranorliponowy (Rys. 5a, 5b). Natomiast produktami S-metylacji (redukcja pierścienia ditiolowego i podstawienie grup metylowych) zidentyfikowanymi we krwi człowieka są kwas 4,6-bismetylotioheksanowy i kwas 2,4-bismetylotiobutanowy (Rys. 5c, 5d) [7, 39, 41]. Większość metabolitów jest usuwana z moczem. Mogą one także uczestniczyć w reakcjach kompleksowania jonów metali. Kwasy bisnorliponowy i tetranorlipo-nowy tworzą kompleksy między innymi z Cd2+ i Cu2+, które są bardziej stabilne niż
z kwasem α-liponowym. Może to być skutkiem mniejszej odległości między grupą karboksylową i pierścieniem ditiolowym [7].
Rysunek 5. Główne metabolity kwasu α-liponowego, kwasy: a – bisnorliponowy, b – tetranorliponowy, c – 4,6bismetylotioheksanowy, d – 2,4-bismetylotiobutanowy
Figure 5. The main metabolites of α-lipoic acid, acids: a – bisnorlipoic, b – tetranorlipoic, c – 4,6-bismethyl-thiohexanoic, d – 2,4-bismethylthiobutanoic
