14 Nr 1
P oczątk ow o uw ażano, że fum onizyny stanow ią problem przede wszystkim w U S A , w C hinach i w A fryce. O b ecn ie w iad om o już, że w ystępują on e w kukurydzy i w jej przetworach w w ielu krajach Europy, np. w e Francji [3].
N iez a le żn ie od prow adzonych badań toksykologicznych i chem icznych fum onizyn, na całym św iecie nieprzerw anie trwają prace w d ziedzinie ich analityki. W ykorzystyw a ne są takie techniki analityczne jak: chrom atografia cienkow arstw ow a (T L C ) [8 ], testy im m u n oen zym atyczn e [1], chrom atografia gazow a (G C ); rów nież p ołączon a ze sp ek trom etrią m as (G C -M S ) [7, 15] i w ysokosprawna chrom atografia cieczow a (H P L C ) [9, 13, 14, 16]. Ta ostatn ia jest ob ecn ie najchętniej stosow ana z p ow od u znanych p o w sz e ch n ie jej zalet.
Z e w zględu na brak chrom oforów w cząsteczce fum onizyn n ie absorbują o n e w U V i w zak resie widzialnym światła, a także n ie fluoryzują. U trudnia to d etek cję tych m ikotoksyn; k o n ieczn e jest zatem tw orzenie fluoryzujących p ochodnych w określonym zakresie w idm a U V . D o otrzymywania zw iązków o takim charakterze w ykorzystuje się reakcje z aldehydem naftaleno-2,3-dikarboksylow ym (N D A ), l-cyjan o-2-alk ilob en - zo (f)izo in d o lem (C B I) [16] oraz z dialdehydem o-ftalow ym (O P A ) [13] lub 4-flu oro- 7-n itro b en zo -2 -o x a -l,3 -d ia zo lem (N B D -F ) [9].
C h ociaż sp osób detekcji p osiada istotn e zn aczen ie m .in. dla sp ecyficzn ości i wykry w alności m etody, jed nak przygotow anie próbki i jej obróbka w celu w yodręb nien ia fum onizyn z b ad an ego m ateriału, decydują o p ow od zeniu całości p ostęp ow an ia z m ie rzającego do ich ilościow ego ozn aczen ia. P ostęp ow an ie to sprow adza się d o ekstrakcji fum onizyn z b ad an ego m ateriału, oczyszczenia ekstraktu i w końcow ej fazie ozn aczen ia jed n ą z w ym ienionych technik analitycznych.
D o ekstrakcji stosuje się przew ażnie m ieszaninę m etanolu z w od ą [9, 12, 13, 16], a d o oczyszczania ekstraktów kolum ny z w ypełn ien iem o silnych w łaściw ościach a n io n o wych [9, 12, 13] lub posiadające w ypełn ien ie typu O D S (ok tad ecylo silan ow e) [16].
W zależn ości od zastosow an ego typu kolum ny zanieczyszczenia o b ecn e w w yciągach wymywa się m etan olem [13] lub m etan olem z w odą w od p ow ied n im stosunku [9]. Fum onizyny eluu je się m etan olem z kwasem octow ym [9, 13] lub m ieszaniną ch lo r o form u, m etanolu i kwasu o ctow ego [16].
Kolejnym etap em analizy jest reakcja tw orzenia fluoryzujących p och odn ych z o d p o w iednim odczynnikiem , o czym w sp om n iano w cześniej.
W tej p ostaci fum onizyny są chrom atografow ane na kolum nach C-18. S tosow an e fazy ru chom e stanow ią kom binacje m etanolu , buforu fosforan ow ego, acetonitrylu z w od ą w różnych stosunkach lub z dodatkiem kwasów organicznych [9, 12, 13, 16].
D łu g o ść fali w zb ud zenia i em isji fluorescencji, w zależności od rodzaju fluoryzującej p och odn ej m ierzy się w zakresie od 3 3 5 -4 6 0 nm (w zb u d zen ie) i 4 4 0 -5 0 0 nm (em isja) [9, 13].
C elem niniejszej pracy było opracow anie, w zględn ie adaptacja m etod y ozn aczania fum onizyny Bi i B 2 w przetworach z kukurydzy techniką H PLC . U m ożliw i to w przy szłości b adan ie teg o typu produktów (n iektóre z nich reklam ow ane są jako tzw. „zdrowa żyw n ość”) na o b ecn o ść tych m ikotoksyn.
P rześled zo n o zatem w szystkie etapy p rocesu an alitycznego, a w ięc: ekstrakcję fum onizyn , oczyszczan ie ekstraktów oraz warunki reakcji tw orzenia fluoryzujących
16 Nr 1
— acetonitryl, metanol, woda, kwas octowy (1 4 + 4 9 + 3 6 + 1 ), (4 0 + 1 2 + 4 7 + 1 ),
— metanol, woda, kwas octowy (50+50+ 1), (70+ 28+ 2), (80+ 18+ 2), (7 5 + 2 3 + 2 ) oraz (75 + 24+1)
Prędkość przepływu fazy ruchomej zmieniano w zakresie od 0,9 do 1,5 ml/min, długości fali wzbudzenia i emisji detektora fluorymetrycznego wynosiły odpowiednio 370/440 nm.
Ustalenie warunków elucji fumonizyn z różnego typu kolumn K o l u m n a S P E - S A X
Kondycjonowanie: kolumnę przemywano 2,5 ml mieszaniny metanolu z wodą (3 + 1) z prędkością 2 ml/min. Następnie nanoszono 10 ml roztworu wzorcowego fumonizyn w miesza ninie metanolu z wodą (3 + 1) lub (w osobnym doświadczeniu) w mieszaninie acetonitrylu z wodą (3 + 1). Prędkość elucji ustalono na 2 ml/min. Eluaty odrzucano, a kolumnę przemywano ponownie 3 ml metanolu z prędkością jak poprzednio, eluat odrzucano. Fumonizyny eluowano 14 ml lub 20 ml mieszaniny metanolu z kwasem octowym (199+1) oraz (198+2).
W odrębnym wariancie badań kolumnę kondycjonowano 3 ml mieszaniny metanolu z wodą (3 + 1), a następnie 6 ml metanolu z kwasem octowym (199+1) i 8 ml metanolu z wodą (3 + 1). Po naniesieniu analizowanego roztworu, jak poprzednio, i przemyciu kolumny 2,5 ml metanolu, fumonizyny eluowano 14 lub 20 ml mieszaniny metanolu z kwasem octowym (199+1) lub w odzielnym doświadczeniach 14 ml mieszaniny acetonitrylu z wodą ( 4 + 1 ) 4
K o l u m n a z ż e l e m k r z e m i o n k o w y m
Przygotowanie kolumny: na dnie strzykawki jednorazowej Luer poj. 5 ml umieszczano zwitek waty, a następnie 0,5 g żelu krzemionkowego. Kolumnę kondycjonowano przemywając 10 ml chloroformu. Następnie nanoszono 2 ml roztworu chloroformowego zawierającego znaną ilość fumonizyn (wzorzec roboczy odparowywano, a pozostałość rozpuszczano w chloroformie), prędkość przepływu ustalono na 2 ml/min. Kolumnę przemywano 3 ml chloroformu i 4 ml n-heksanu z prędkością jak wyżej.
Fumonizyny eluowano 10 ml mieszaniny chloroformu z kwasem octowym (198+2) lub (190+10) ( w osobnym doświadczeniu).
K o l u m n a z c e l i t e m
Kolumnę (jak poprzednio) wypełniano mieszaniną 0,5 g celitu i 0,25 ml 0,5% roztworu wodorowęglanu sodowego. Bezpośrednio po wypełnieniu na kolumnę nanoszono 2 ml standar dowego roztworu chloroformowego fumonizyn. Kolumnę przemywano 3 ml chloroformu i 4 ml n-heksanu. Fumonizyny eluowano 15 ml mieszaniny metanolu z kwasem octowym (190+10). We wszystkich przypadkach prędkość przepływu rozpuszczalników wynosiła 1,5 ml/min. K o l u m n a z t l e n k i e m g l i n u
Kolumnę wypełniano 1,5 g tlenku glinu. Następnie nanoszono kolejno: 3 ml roztworu chlo roformowego fumonizyn, 3 ml chloroformu i 15 ml mieszaniny metanolu z kwasem octowym (190+10); prędkość przepływu, jak poprzednio.
Eluaty przeznaczone do analizy HPLC odparowywano do sucha w bloku grzejnym w strumieniu azotu, w temperaturze nie przekraczającej 60°C, do pozostałości dodawano kolejno: 50 /xl mieszaniny acetonitrylu z wodą i 200 fil roztworu OPA. Zawartość naczynek dokładnie mieszano w łaźni ultradźwiękowej. Następnie wykonywano analizę chromatograficzną, nanosząc
W pierwszej fazie opisanych badań, również w przypadku kolumn wymienionych w dalszych częściach pracy, wszystkie eluaty opuszczające kolumnę poddawano analizie chromatograficznej w celu ustalenia warunków w jakich fumonizyny opuszczają kolumnę.
na kolumnę Nova Pak C-18 przereagowaną mieszaninę (czas 0), stosując jako fazę rozwijające układy wymienione we wcześniejszym opisie metody.
Ustalenie warunków ekstrakcji fumonizyn z próbek przetworów kukurydzianych, oczyszczania ekstraktów oraz wysokosprawnej chromatografii cieczowej
E k s t r a k c j a i o c z y s z c z a n i e e k s t r a k t ó w
a) 25 g średniej próbki laboratoryjnej produktu (kaszka kukurydziana, kukurydza popcorn, płatki kukurydziane) wytrząsano 30 min. na wytrząsarce mechanicznej z 50 ml mieszaniny metanolu z wodą (3 + 1). W przypadku kukurydzy popcorn i płatków śniadaniowych stosowano uprzednie rozdrabnianie w młynku udarowym. Ekstrakty sączono przez sączek karbowany z bibuły, pH roztworów doprowadzano za pomocą 0,1 M KOH do wartości 6,9-7,1 (jedynie w przypadku płatków i kukurydzy popcorn). Do dalszej analizy pobierano 10 ml przesączu, który nanoszono na uprzednio kondycjonowane kolumny zgodnie z procedurą opisaną dla roztworów wzorcowych2*. Zagęszczone w wyparce próżniowej eluaty przenoszono ilościowo metanolem lub mieszaniną metanolu z kwasen octowym (199+1) (równoległe doświadczenie). Zawartość na czynek odparowywano w bloku grzejnym w temperaturze 50°C w strumieniu azotu.
b) 25 g średniej próbki laboratoryjnej produktu wytrząsano, jak poprzednio ze 100 ml mieszaniny acetonitrylu z wodą (1 + 1). Ekstrakty sączono przez sączek karbowany z bibuły. Do dalszej analizy pobierano 10 ml przesączu, który nanoszono na uprzednio kondycjonowane kolumny zgodnie z procedurą opisaną wcześniej. Zagęszczone w wyparce próżniowej eluaty przenoszono ilościowo metanolem lub mieszaniną metanolu z kwasen octowym (199+1) (równo ległe doświadczenie). Zawartość naczynek odparowywano w bloku grzejnym w temperaturze 50°C w strumieniu azotu.
R e a k c j a z O P A
Do pozostałości w naczynkach dodawano 200 /xl metanolu lub mieszaniny metanolu z kwa sem octowym (199+1) (równoległe doświadczenie). Do reakcji z OPA, po dokładnym wymie szaniu zawartości naczynek, pobierano 50 д1 powyższych roztworów dodając 200 д1 roztworu O P A jak opisano wcześniej (temp. 60°C, czas „0”). W analogiczny sposób wykonywano reakcję z OPA dla roztworów wzorcowych fumonizyn.
W y s o k o s p r a w n a c h r o m a t o g r a f i a c i e c z o w a
Stosowano kolumny chromatograficzne i układy rozwijające wymienione w punkcie doty czącym badań na roztworach wzorcowych. Równolegle chromatografowano roztwory standar dowe po reakcji z OPA. Zawartość fumonizyn obliczano za pomocą programu integrującego Axxiom na podstawie porównania powierzchni pików próbek i standardów. Zawartość fumoni zyn wyrażano w /xg/kg produktu.
WYNIKI I ICH OMÓWIENIE
S posób w ykonania reakcji fum onizyn z O P A zaczerp nięto z pracy S tack'd i E p p le y ’a [13]. Z b adan o przy tym stabilność powstających p ochodnych chrom atografując m iesza niny w zorców fum onizyn p od d an e reakcji z O P A po upływie czasu (licząc od chwili dodania reagen tów i w ym ieszania): 0; 5; 8; 10 i 16 minut. S tw ierdzono, że fluoryzujące p och od n e obu fum onizyn z O P A n ie należą do stabilnych (tab ela I).
18 N r 1
T a b e l a I . Wpływ czasu na przebieg reakcji fumonizyn Bi i B2 z OPA w temperaturze otocznia (ok. 20°C) (wielkości powierzchni pików stanowią średnie z 6 równo ległych pomiarów)
Influence of reaction time on derivatisation o f fumonizins Bi i B2 with OPA in ambient temperature
Jak wynika z danych zam ieszczonych w tabeli I n an iesien ie analizow anej próbki na k olu m n ę chrom atografu cieczow ego p ow inn o nastąpić w p rzedziale czasow ym 0 - 5 m in, b ow iem zm iany w ielkości pow ierzchni pików p och odn ych fum onizyny Bi i B 2 są w tedy n iezn aczn e, co um ożliw ia poprawne w ykonanie analizy.
D la ok reślen ia pow tarzalności reakcji w tych w arunkach w ykonano serię o zn aczeń chrom atograficznych ustalając czasy retencji p ochodnych obu fum onizyn i w ielk ości p ow ierzch ni pików (tab ela II).
D a n e w tabeli II wskazują na dobrą pow tarzalność reakcji - w spółczynnik zm ie n n ości V% 3,6 - 3,9, w opisanych warunkach.
P od czas ekstrakcji fum onizyn z próbek b ad an ego m ateriału (płatki kukurydziane, kaszka kukurydziana, kukurydza p opcorn) m etan olem z w od ą ( 3 + 1 ) w pierw szej fazie badań wystąpiły trudności zw iązane z otrzym aniem zad ow alającego odzysku; je g o w ar tości wahały się w granicach 15-30% . Badając przyczyny teg o zjawiska p rzeprow adzono badania na w zorcach i ekstraktach stosując w ym ywanie fum onizyn z k olum n różn ego typu stosując od p o w ied n ie układy elucyjne w ym ien ion e w części dośw iadczalnej pracy. W ykonano rów nież ekstrakcję fum onizyn z fortyfikow anych próbek badanych p ro duktów w g [6] acetonitrylem z w od ą (1 + 1). U zysk ane w artości śred n iego odzysku w e wszystkich przypadkach były poniżej 50%.
M o m en tem krytycznym procesu analitycznego okazała się słaba rozpu szczalność fum onizyn w m etanolu . W g bow iem m etody oryginalnej [13] w końcow ym eta p ie p ostęp ow an ia poprzedzającym analizę H P L C należy rozpuścić zagęszczon y elu at z kolum ny S A X w m etanolu i pobrać od p ow ied n ią ob jętość ekstraktu do w ykonania reakcji z O P A .
W pracy będącej przedm iotem niniejszej publikacji zastosow an o do rozpuszczania w sp om n ian ego zag ęszczo n eg o eluatu m ieszan in ę m etanolu z kwasem octow ym ( 1 9 9 + 1 ) poprawiając rozpuszczalność fum onizyn. W yelim inow an o d zięki tem u błąd gruby m etod y i wynikający stąd słaby odzysk; p obieran a d o dalszej analizy ob jętość ekstraktu zaw ierała proporcjonalnie m niejszą zaw arość fum onizyn w stosunku d o ich zaw artości w ogóln ej ob jętości k oń cow ego ekstraktu (1:4).
W dalszych badaniach na ekstraktach stw ierdzono rów nież, że istotny wpływ na od zysk iw alność fum onizyn wywiera w artość pH ekstraktu przed n a n iesien iem na
ko-T a b e l a I I . Powtarzalność reakcji tworzenia pochodnych fumonizyn z OPA Repeatability of derivatisation reaction fumonisins with OPA
Powierzchnia piku (mV)
20 Nr 1
dopuszczalnych i n ie wpływają ujemnie na wynik analizy chromatograficznej, w ydłu żając jed ynie n iec o czas jej trwania.
Ryc. 1. Chromatogram ekstraktu kaszki kukurydzianej fortyfikowanej fumonizynami i roztworu standardowego. Układ rozwijający: metanol, woda, kwas octowy (75 + 2 4 + 1 ).
Objaśnienia: FBi - fumonizyna Bi FB2 - fumonizyna B2
U k ład w g S tack'd i E p p le y ’a [13] złożon y z acetonitrylu, w ody i kwasu o cto w eg o ( 5 0 + 5 0 + 1 ) o g E A 365 p ow od ow ał nadm ierne w ydłużenie czasów retencji (o ok o ło 30% w stosunku do układu p op rzed n iego), a piki fum onizyn, zw łaszcza fum onizyny B 2 były rozm yte. Jet to zrozu m iałe ze w zględu na znacznie w yższe w artości k ’. Z w ięk szen ie prędkości przepływu do 1,5 m l/m in, usuw ało radykalnie tę n ied o g o d n o ść, jed nak podczas analizy ekstraktów obserw ow ano n ied ostateczny rozdział fum onizyny Bi od substancji balastowych (zd o ln o ść rozdzielcza R s < 1). N ależy zaznaczyć, że w spom n iani autorzy stosow ali k olum nę R P -18 o n ieco innej charakterystyce (/iB on d ap ak 3,9x150 m m ), co tłum aczy pow yższe różnice.
N a p odstaw ie przeprow adzonych, szczegółow o opisanych powyżej badań, przyjęto następujący schem at ozn aczania fum onizyn w przetworach kukurydzianych: 1) ekstrak cja m ieszaniną m etanolu z w od ą (3 + 1), 2) oczyszczanie na k olum nie S A X p o u p rze dnim doprow ad zeniu p H ekstraktu do ok. 6,9 -7 ,1 (wariant z przem yw aniem k olum ny 2,5 ml m etan olu i elucja fum onizyn 14 ml m ieszaniny m etanolu z kwasem octow ym /1 9 9 + 1 /), 3) rozpu szczanie suchej p ozostałości eluatu z kolum ny w m ieszan in ie m eta nolu z kwasem octow ym (1 9 9 + 1 ), 4) reakcja z O P A (wariant „0”) , 5 )H P L C na
22 Nr 1
k olu m n ie N ova Pak R P -18 z fazą ruchomą: m etanol, w oda, kwas octow y ( 7 5 + 2 4 + 1 ) , przy prędkości przepływu 0,9 m l/m in z detekcją fluorym etryczną przy 370/440 nm.
W celu ok reślen ia podstaw owych param etrów statystycznych m etody, próbki kaszki kukurydzianej, p łatków kukurydzianych i kukurydzy popcorn fortyfikow ano fum onizy- nami na p oziom ie: 100; 200; 400; 800 i 1600 Mg/kg.
W artości śred n iego odzysku b ęd ącego m iarą błędu b ezw ględ n ego m etody, o d ch y le n ie standardow e i przedział ufności śred niego odzysku p rzedstaw ion o w tabeli III.
O k reślon o rów nież granicę wykrywalności m etody (średnia w artość sygnału próbki ślepej plus trzy od ch ylen ia standardow e), która w ynosiła 15 /ig/kg produktu dla każdej z oznaczanych fum onizyn. Jako granicę ozn aczaln ości obrano 4-krotną w artość granicy wykrywalności, co stanow i 60,0 /ig/kg.
U zysk an e p odstaw ow e param etry analityczne m etody są porów nyw alne do cytow a nych p rzez niektórych autorów. Jedynie w przypadku kukurydzy p opcorn w artość śred n iego odzysku - ok. 6 6 % obu fum onizyn, była niższa w porów naniu z pozostałym i produktam i będącym i p rzedm iotem niniejszej pracy.
S tack i wsp. [13] w m eto d zie oznaczania fum onizyn w kukurydzy i jej przetw orach odzyskiw ali o k o ło 67 -7 1 % dodanych m ikotoksyn. Z akres zbadanych stężeń w ynosił od 250 do 2000 Mg/kg. W spółczynnik zm ienn ości V% w ahał się w granicach od 3 d o 5% , granica wykrywalności m etod y w ynosiła 10 /ug/kg.
S cott i L aw ran ce [9] oznaczając fum onizyny w przetworach z kukurydzy za p o m o cą techniki H PLC , p o reakcji z N B D -F osiągnęli wartości śred niego odzysku 94% dla fum onizyny Bi i 80% dla fum onizyny B 2. Zakres p oziom ów fortyfikacji zbadanych przez tych autorów zaw ierał się w przedziale od 125 do 5000 /xg/kg, a granica wykrywalności w ynosiła 100 Mg/kg.
N ależy podkreślić, że uzyskana w artość tego param etru, w pracy będącej p rzed m io tem niniejszej publikacji, jest prawie 6 -krotnie niższa.
R ów n ież S hepard i Sydenham [12] opisali m etod ę ozn aczania fum onizyn w p ostaci p ochodnych z aldehydem o-diftalow ym (O P A ). A utorzy odzyskiw ali śred n io 99,5 i 85,9% fum onizyny Bi i B 2 odpow iednio; granica wykrywalności m etod y była rzędu 5 0 -1 0 0
11
g/kg.Jak wynika z przedstaw ionych badań, m etod a oznaczania fum onizyn b ęd ąca p rzed m iotem niniejszej pracy, charakteryzuje się dobrymi param etram i śred n iego odzysku i bardzo dobrą wykrywalnością.
WNIOSKI
1. O pisana m etod a oznaczania fum onizyn w przetworach z kukurydzy m o że być wykorzystana w rutynowych badaniach produktów na ob ecn o ść tych m ikotoksyn.
2. P ostuluje się rozszerzen ie zastosow ania m etody, po przeprow adzeniu stosow nych badań, do ozn aczania fum onizyn w kukurydzy.
L . C z e r w i e c k i
DETERMINATION OF SELECTED MYCOTOXINS IN FOOD
PART II.: SELECTION OF OPTIMISED CONDITIONS FOR THE DETERMINATION OF FUM ONIZYN Bi A N D B2 IN CORN PRODUCTS BY MEANS OF
HIGH-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY
Summary
The aim of this study was to perform a optimised method for determination o f fumonisins Bi and B2 in corn products. The manner of extraction and clean-up of com products extracts as well conditions of reaction of fumonisins with OPA was described. The main steps of optimised analytical procedure were: extraction of sample with methanol and water (3+1), clean-up of extracts on SAX column, derivatisation with OPA, and determination by means of RP-HPLC. The mobile phase was a mixture of methanol, water and acetic acid (75+ 24+ 1). Fluorometric detection was made at 370/440 nm. The mean recovery of fumonisins dependent on fortification level and product was 64-95%, limit of detection for each of fumonisins was 15 /xg/kg.
PIŚMIENNICTWO
1. Azkona-Olivera J.I., Abouzied M.M., Plattner R.D. i in.: Production o f monoclonal antibo dies to the mycotoxins fumonisins Bi, B2, B3. J. Agr. Food Chem., 1992, 40, 531-534.
2. Bullerman L.B., Tsai W-Y.J.\ Incidence and levels of Fusarium moniliforme, Fusarium proliferatum and fumonisins in corn and corn-based foods and feeds. J. Food Prot., 1994, 57, 541- 546.
3. Dragoni /., Piantanida L., Trilly Y.: Occurrence of fumonisins in corn feedstuffs intended for pig consuption. IX International IUPAC Symposium on Mycotoxins and Phycotoxins, Rome, 27-31 May, 1996, 39.
4. Kellerman T.S., Marasas W.F.O., Thiel P.G. i in.: Leukoencephalomalacia in two horses induced by oral dosing of fumonisin Bi . Onderpoort. J. Vet. Res., 1990, 57, 269-275.
5. Osweiler G.D., Kehrli M.E., Stabel J.R. i in.: Effects o f fumonisin-contaminated corn srceenings on growth and health o f feeder calves. J. Anim. Sci., 1993, 71, 459-466.
6. Pascale M , Visconti A.: Improvement o f recoveries in the extraction of fumosins Bi and B2 from maize. Int. Seminar on Fusarium Mycotoxins, Taxonomy and Phatogenicity, Martina Franca, May, 9-13, 33, 1995.
7. Pestka J.J., Azcona-Olivera J.I., Plattner R.D. i in.: Comparative assessment of fumonisin in grain-based foods by ELISA, GC-MS, and HPLC. J. Food Prot., 1994, 57, 169-172.
8. Rice L.G ., Ross P.F.: Methods for detection and quantitation o f fumonisins in corn, cereal products and animal excrecta. J. Food. Prot., 1994, 57, 536-540.
9. Scott P.M., Lawrance G A .: Liquid chromatographic determination o f fumonisins with 4- fluoro-7-nitrobenzofurazan. J. Ass. Anal. Chem. Int., 1992, 75, 829-834.
10. Scott P.M., Delgado T.,Prelusky D.D. i in.: Determination of fumonisins in milk. J. Environ. Sci. Health. B., 1994, 29, 989-998.
11. Shephard G.S., Thiel P.G., Sydenham E.W.: Liquid chromatographic determination o f the mycotoxin fumonisin B2 in physiological samples. J. Chrom. A., 1995, 692, 39- 43.
12. Shephard G.S., Sydenham E.W., Thiel P.G. i in.: Quantitative determination o f fumonisins 1 and B2 by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. J. Liq. Chrom., 1990, 13, 2077-2087.
13. Stack M.E., Eppley R.M.: Liquid chromatographic determination of fumonisins B2 and B2 corn and com products. J. Ass. Off. Anal. Chem. Int., 1992, 75, 835-837.
24 Nr 1 14. Sydenham E.W., Shephard G.S., Thiel P.G.: Liquid chromatographic determination of fumonisins Bi, B2, and B3 in foods and feeds. J. Ass. Off. Anal. Chem. Int., 1992, 75, 313-318.
15. Sydenham E.W., Glederblom W .CA., Thiel P.G. i in.: Evidence for the natural occurrence o f fumonisin Bi mycotoxin produced by Fusarium moniliforme, in com. J. Agr. Food Chem., 1990, 38, 285-289.
16. Ware G.M., Francis O., Knan S.S. i in.: Determination o f fumonisin Bi in corn by high performance liquid chromatography with fluorescence detection. Anal. Lett., 1993, 26, 1751-1764.
