Medycyna Wet. 2007, 63 (10) 1159
Artyku³ przegl¹dowy Review
Encefalopatie g¹bczaste
Pasa¿owalne encefalopatie g¹bczaste (Transmissible Spongiform Encephalopathies, TSE) stanowi¹ grupê kilkunastu spokrewnionych chorób neurozwyrodnienio-wych, wystêpuj¹cych zarówno u ludzi, jak i u zwierz¹t. Ich przebieg jest zwykle ró¿ny u poszczególnych ga-tunków. Natomiast wspóln¹ cech¹ jest etiologia, d³ugi okres inkubacji (od kilkunastu miesiêcy do kilkudzie-siêciu lat), letalnoæ oraz charakterystyczny dla ca³ej grupy chorobowej patomorfologiczny obraz zmian w mó¿d¿ku i korze mózgowej, przypominaj¹cy poro-wat¹ strukturê g¹bki, bêd¹cy nastêpstwem zaniku neu-ronów i gliozy (20). Ze wzglêdu na mo¿liwoæ przeno-szenia siê czynnika patogennego miêdzy osobnikami, a niekiedy te¿ pokonywania bariery miêdzygatunkowej przez niektóre jego warianty, neurozwyrodnienia te okrela siê jako pasa¿owalne, czyli zakane. Do grupy zwierzêcych TSE zalicza siê, miêdzy innymi: scrapie u owiec, kóz i muflonów, encefalopatiê g¹bczast¹ byd-³a (Bovine Spongiform Encephalopathy, BSE), prze-wlek³¹ chorobê wyniszczaj¹c¹ zwierzyny p³owej (Chro-nic Wasting Disease, CWD), encefalopatiê g¹bczast¹ kotów (Feline Spongiform Encephalopathy, FSE) oraz pasa¿owaln¹ encefalopatiê norek (Transmissible Minke Encephalopathy, TME) (4).
Podstawowe objawy zwierzêcych TSE s¹ podobne: dr¿enie i niedow³ad tylnych koñczyn, powoduj¹ce trud-noci w poruszaniu siê, niezbornoæ ruchowa oraz nad-pobudliwoæ przechodz¹ca w agresjê. Zwierzêta stop-niowo trac¹ kondycjê, odczuwaj¹ silny wi¹d i ocieraj¹
siê o pobliskie obiekty, co jest powodem licznych ska-leczeñ skóry. W koñcowej fazie dochodzi do pora¿eñ, zalegania i zejcia miertelnego (2).
W latach 1988-1997 odnotowano w Wielkiej Bryta-nii dziesi¹tki tysiêcy przypadków BSE rogacizny. BSE, jako samoistna choroba byd³a, mog³a istnieæ nieroz-poznawana przez wieki. Najprawdopodobniej to skar-mianie m¹czek pochodzenia zwierzêcego doprowadzi-³o do prze³amania bariery gatunkowej i przeniesienia czynnika patogennego z populacji owiec na byd³o i inne gatunki hodowlane. Znacznie bardziej niepokoj¹cy jest fakt wyró¿nienia w 1996 r. tzw. wariantu CJD (Creutz-feldt-Jakob Disease variant, vCJD), bêd¹cego wynikiem przepasa¿owania BSE na cz³owieka (26).
Bia³kowe cz¹steczki infekcyjne
Hipoteza Stanleya Pruisinera tylko bia³ko zak³ada, ¿e priony s¹ strukturami pozbawionymi kwasu nuklei-nowego, sk³adaj¹cymi siê wy³¹cznie ze zmodyfikowa-nej izoformy PrP (Prion Protein), okrelazmodyfikowa-nej jako PrPsc
(8). Za swoje nowatorskie badania oraz sformu³owanie teorii prionów jako zakanego bia³ka, Pruisiner zosta³ w 1997 r. uhonorowany Nagrod¹ Nobla (12).
PrP normalnie wystêpuj¹ce w komórkach ssaków jest zakotwiczon¹ w b³onie komórkowej monomeryczn¹ glikoprotein¹ PrPc (Prion Protein Cell), pe³ni¹c¹
naj-prawdopodobniej rolê w transdukcji sygna³ów oraz/lub utrzymaniu odpowiedniej koncentracji jonów miedzi. Ulega ono potranslacyjnej konwersji w PrPsc (Scrapie
Prion Protein) podczas procesu, w którym czêæ struk-tury a-helikalnej bia³ka ulega przemianie do postaci
Zastosowanie aptamerów w diagnostyce
encefalopatii g¹bczastych zwierz¹t
ADAM SZPECHCIÑSKI, ALEKSANDRA STÊPIEÑ, MAGDALENA IZDEBSKA, ALINA GRZANKA, JÊDRZEJ M. JAKOWSKI*
Katedra i Zak³ad Histologii i Embriologii Wydzia³u Lekarskiego UMK w Toruniu, Collegium Medicum w Bydgoszczy, ul. Kar³owicza 24
*Katedra Weterynarii Rolniczej Wydzia³u Hodowli i Biologii Zwierz¹t AR, ul. Wojska Polskiego 52, 60-625 Poznañ Szpechciñski A., Stêpieñ A., Izdebska M., Grzanka A., Jakowski J. M.
Implementation of aptamers in the diagnosis of prion diseases
Summary
Prion diseases are a group of neurodegenerative conditions affecting both humans and animals. Among the methods used in prion disease diagnosis, immunoenzymatic tests as well as immunohistochemic and fluorescence analisis are distinguished. Currently, aptamers, which are single-stranded RNA or DNA oligonucleotides, are implemented with the above-mentioned methods. They play the role of artificial ligands that may be applied instead of widely used antibodies.
Medycyna Wet. 2007, 63 (10) 1160
b-harmonijki. Ta przemiana konformacyjna zwi¹zana jest z ca³kowit¹ zmian¹ w³aciwoci fizykochemicznych PrP (3, 20). Jedn¹ z dwóch najistotniejszych jest czê-ciowa opornoæ PrPsc na dzia³anie proteaz, st¹d te¿
okrelane s¹ równie¿ mianem PrPres (protease-resistant)
(2). Traktowanie PrPc proteinaz¹ K powoduje
ca³kowi-te zniszczenie bia³ka, podczas gdy PrPsc jest jedynie
skracany w regionie aminoterminalnym, w wyniku cze-go powstaje cz¹steczka o masie 27-30 kD, zachowuj¹-ca zdolnoæ zaka¿ania. Jest ona charakterystyczna dla wszystkich chorób prionowych i z tego wzglêdu stoso-wana szeroko w diagnostyce (6).
Hipoteza tylko bia³ko jest wci¹¿ przedmiotem ¿y-wej dyskusji. Sugeruje siê, ¿e do zaka¿enia przez prio-ny niezbêdna jest dodatkowa informacja, której ród³em s¹ nie zidentyfikowane dotychczas cz¹steczki. Za je-den z dowodów podaje siê wyniki eksperymentu, w którym wykazano, ¿e BSE mo¿e byæ przeniesiona na myszy z wy³¹czeniem formowania PrPsc (14).
Za najczêciej wystêpuj¹c¹ drogê zaka¿enia siê cho-rob¹ prionow¹ (pasa¿owania) uwa¿a siê drogê pokar-mow¹. Po spo¿yciu zaka¿onego pokarmu priony do-staj¹ siê do wiat³a jelita, sk¹d s¹ wch³aniane do naczyñ limfatycznych, którymi docieraj¹ do ledziony, wêz³ów limfatycznych i migda³ków, gdzie ma miejsce ich re-plikacja. Ostatnim etapem jest tzw. neuroinwazja, czyli dotarcie szlakiem prowadz¹cym przez w³ókna ner-wowe do rdzenia krêgowego i mózgu, gdzie zachodzi kumulacja i tworzenie tzw. agregatów PrPSc (1).
Uwa-¿a siê, ¿e w rozprzestrzenianiu prionów w obrêbie uk³a-du limfatycznego oraz w ich neuroinwazji kluczow¹ rolê odgrywaj¹ limfocyty B (13). Istotny jest fakt, ¿e infek-cji prionowej nie towarzyszy odpowied uk³adu immu-nologicznego, gdy¿ chorobotwórcze PrPSc jest
rozpoz-nawane przez organizm jako w³asne (29).
Diagnostyka TSE
Ostateczna diagnoza choroby prionowej, zarówno u zwierz¹t, jak i u ludzi (CJD), oparta jest na wykrytej post mortem obecnoci PrPSc w preparatach
histologicz-nych z tkanki mózgowej zainfekowanego osobnika. U byd³a chorego na BSE akumulacja agregatów choro-botwórczych form PrP z regu³y ograniczona jest w³a-nie do obszaru CNS. Natomiast u owiec chorych na scrapie odk³adanie depozytów PrPSc ma miejsce
naj-pierw w tkance limfatycznej, a dopiero póniej w CNS. U tych zwierz¹t mo¿liwa jest zatem diagnostyka ante mortem w oparciu o materia³ biopsyjny pobrany przy-¿yciowo z migda³ków (29).
Detekcjê PrPSc w materiale tkankowym
przeprowa-dza siê najczêciej metod¹ immunohistochemiczn¹ (IHC), wykonuj¹c reakcje barwne na skrawkach, b¹d za pomoc¹ tzw. testów szybkich, bazuj¹cych na anali-zie western blotting (WB) lub tecie immunoenzyma-tycznym (ELISA). Bardzo przydatna jest równie¿ mikroskopia elektronowa (EM), stosowana do wykry-wania fibrylarnych z³ogów prionowych (scrapie-asso-ciated fibrils, SAF). Procedur¹ rutynowo wykonywan¹
w diagnostyce TSE jest histologiczna ocena mikrosko-powa tkanki mózgowej chorego osobnika pod k¹tem opisanych zmian patomorfologicznych. Obiecuj¹c¹ me-tod¹ diagnozowania TSE s¹ opracowywane obecnie testy wykorzystuj¹ce fluorescencjê jako kryterium roz-ró¿niania PrPC i PrPSc (7).
Badania ostatnich lat ujawni³y obecnoæ cz¹steczek PrPSc równie¿ w p³ynach ustrojowych cia³a, nawet
w stadiach przedobjawowych choroby. Trwaj¹ inten-sywne próby nad opracowaniem nieinwazyjnego testu na obecnoæ prionów we krwi i moczu, który móg³by byæ wykonywany przy¿yciowo. Jednak¿e iloæ PrPSc
poza CNS jest wielokrotnie mniejsza ni¿ w mózgu, za-tem konieczne mo¿e byæ stosowanie metod amplifika-cji in vitro PrPSc lub wprowadzenia nowych,
ultraczu-³ych technik detekcji biomoleku³ (3).
W okresie ostatnich 20 lat wyprodukowano bardzo wiele ró¿nych przeciwcia³ poliklonalnych i monoklo-nalnych, skierowanych przeciwko cz¹steczce PrP. Nie-stety, ¿adne z nich nie pozwala na skuteczne rozró¿nie-nie PrPC i PrPSc, pomimo tego, ¿e izoformy te maj¹
bar-dzo odmienne struktury przestrzenne i w zwi¹zku z tym powinny prezentowaæ ró¿ne epitopy. W konsekwencji, immunologiczne metody wykrywania prionów (western blotting i ELISA) wymagaj¹ czynnoci wstêpnych, maj¹cych na celu usuniêcie lub zniszczenie frakcji PrPC
w próbie. Koniecznoæ wstêpnego przygotowania pró-bek wyd³u¿a czas analizy i zwiêksza jej ogólne koszty, a co najwa¿niejsze, obni¿a dok³adnoæ pomiaru i unie-mo¿liwia stosowanie testów immunologicznych in vivo. W wietle ograniczonego zastosowania przeciwcia³ aptamery stanowi¹ alternatywne podejcie do proble-mu skutecznej detekcji prionów, opartej na wi¹zaniu specyficznego ligandu (7).
Definicja aptameru
Aptamery to kilkunasto- lub kilkudziesiêcionukleoty-dowe sekwencje RNA lub DNA, pe³ni¹ce rolê ligan-dów wi¹¿¹cych specyficznie inne moleku³y (16). Ich nazwa pochodzi od ³aciñskiego s³owa aptus, oznacza-j¹cego dos³ownie: dopasowany, przyczepiony. Zawdziê-czaj¹ j¹ niezwyk³emu dopasowaniu struktury prze-strzennej do budowy cz¹steczki docelowej, osi¹gane-mu w toku kombinatorycznego procesu syntezy i cyk-licznej selekcji in vitro. Wród cz¹steczek chemicznych, dla których wyselekcjonowano wi¹¿¹ce je aptamery, s¹ m.in.: jony metali, barwniki organiczne, aminokwasy, witaminy, antybiotyki, nukleotydy, lipidy, peptydy, a przede wszystkim bia³ka (10). Precyzyjne wi¹zanie siê aptameru ze cile okrelon¹ biomoleku³¹ mo¿liwe jest dziêki bardzo wysokiemu powinowactwu (od mikromolarnych do niskich pikomolarnych wartoci sta³ej Kd) i specyficznoci, które wynikaj¹ z
niepowta-rzalnej sekwencji nukleotydowej i konformacji prze-strzennej ka¿dego ligandu (11).
Aptamery pozwalaj¹ rozró¿niaæ nawet bardzo podob-ne strukturalnie moleku³y (11). Stosunkowo ³atwo, w porównaniu do przeciwcia³, podlegaj¹ chemicznym
Medycyna Wet. 2007, 63 (10) 1161 modyfikacjom, jak znakowanie radioaktywnymi
izo-topami (9), koniugowanie z barwnikami fluorescencyj-nymi (28) czy poprawianie biostabilnoci (18). Ze wzglêdu na swoje w³aciwoci aptamery mog¹ konku-rowaæ z przeciwcia³ami o miano uniwersalnych recep-torów i byæ powszechnie wykorzystywane jako narzê-dzie rozpoznania molekularnego w metodach diagnos-tycznych (10).
SELEX
Aptamery generuje siê w procesie okrelanym jako selekcja in vitro lub SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment). Polega on na identyfikacji i wybiórczej amplifikacji cz¹steczek o po¿¹danych w³aciwociach sporód bardzo licznej puli (1014-1015) krótkich, jednoniciowych sekwencji
DNA (27). Ka¿dy taki oligonukleotyd sk³ada siê z: (i) fragmentu rodkowego o przypadkowej sekwencji nukleotydów, (ii) fragmentów flankuj¹cych koñce 5 i 3 o sekwencjach sta³ych oraz (iii) regionu promo-torowego dla polimerazy RNA na koñcu 5. Do sekwen-cji sta³ych przy³¹czaj¹ siê startery w reaksekwen-cji PCR, wy-korzystywanej do amplifikacji biblioteki DNA. Zasto-sowanie polimerazy RNA umo¿liwia, na drodze enzy-matycznej transkrypcji, otrzymanie analogicznej biblio-teki oligonukleotydów RNA (30). Podczas selekcji ca³¹ pulê oligonukleotydów (DNA lub RNA) inkubuje siê z unieruchomion¹ na noniku cz¹steczk¹ docelow¹ w cile ustalonych warunkach pH, temperatury i sk³a-du buforu (27). Oligonukleotydy niezwi¹zane z cz¹s-teczk¹ docelow¹ wyp³ukuje siê z nonika. Z kolei populacjê aptamerów wykazuj¹cych powinowactwo do cz¹steczki docelowej amplifikuje siê metod¹ PCR (biblioteka DNA) lub PCR sprzê¿on¹ z reakcj¹ odwrot-nej transkrypcji (biblioteka RNA) w celu uzyskania dwuniciowego DNA, które pos³u¿y jako matryca do syntezy kolejnej, zawê¿onej puli oligonukleotydów.
W kolejnych cyklach selekcji stopniowo zaostrza siê warunki reakcji i powtarza siê opisan¹ wy¿ej procedu-rê, a stosunek sekwencji aktywnych, tj. wi¹¿¹cych cz¹s-teczkê docelow¹, do nieaktywnych w mieszaninie suk-cesywnie wzrasta (10). Po kilku lub kilkunastu cyklach osi¹ga siê stan, w którym populacja oligonukleotydów sk³ada siê w wiêkszej czêci z sekwencji najlepiej wi¹-¿¹cych cz¹steczkê docelow¹. Gdy to nast¹pi, aptamery klonuje siê w komórkach bakteryjnych i sekwencjonu-je, celem poznania unikalnej struktury ka¿dego z nich. Produkcja aptamerów o znanej sekwencji odbywa siê na drodze syntezy chemicznej (10). W ostatnich latach proces selekcji in vitro w pe³ni zautomatyzowano, co pozwoli³o zwiêkszyæ wydajnoæ i skróciæ czas genero-wania aptamerów do zaledwie kilku dni (5).
Generowane aptamerów niezale¿nie od organizmów ¿ywych lub jakichkolwiek warunków in vivo istotnie redukuje koszty ich produkcji. Szacuje siê, ¿e koszt wytworzenia 1 grama aptamerów wynosi 1000 dola-rów, podczas gdy produkcja 1 grama przeciwcia³a po-ch³ania od 1000 do 10 000 dolarów (15). Poza tym
manipulowanie warunkami selekcji in vitro umo¿liwia otrzymanie aptamerów o po¿¹danych w³asnociach, zdolnych do dzia³ania w danym rodowisku reakcji (10).
Aptamery wi¹¿¹ce PrP
Wród moleku³, dla których wyselekcjonowano wi¹-¿¹ce je aptamery, bez w¹tpienia, najwiêcej jest bia³ek, m.in. enzymatycznych, regulatorowych, b³onowych, czynników wzrostu i innych. Aptamery z powodzeniem wykorzystano zarówno do detekcji tych bia³ek, jak rów-nie¿ do modulowania b¹d blokowania ich funkcji in vivo (10). Bia³kowa natura prionów, a zw³aszcza ich unikalne w³asnoci fizykochemiczne, czyni¹ je wymie-nitym celem dla nukleinowych ligandów.
Pierwsze doniesienie naukowe o wyprodukowaniu aptamerów o strukturze RNA, skierowanych przeciw-ko bia³przeciw-kowej cz¹steczce infekcyjnej pochodzi z 1997 r. (19). Cz¹steczkê docelow¹ w procesie SELEX stano-wi³o rekombinowane bia³ko prionowe (rPrPC) z
cho-mika syryjskiego, inkubowane z mieszanin¹ oligome-rów RNA. Analiza sekwencyjna aptameoligome-rów (oznaczo-nych Ap1 i Ap2) wi¹¿¹cych specyficznie cz¹steczkê rPrPC ujawni³a obecnoæ tzw. kwartetów guaninowych
w ich strukturze, bior¹cych udzia³ w tworzeniu wi¹zañ aptamer-cz¹steczka docelowa. Podobne motywy struk-turalne posiadaj¹ m.in. ligandy wi¹¿¹ce siê z trombin¹ i integraz¹ HIV-1 (17). Natomiast region bia³kowy, aktywnie oddzia³uj¹cy z aptamerem zlokalizowano w aminoterminalnym odcinku rPrP: od 23 do 52 ami-nokwasu. Nale¿y podkreliæ, ¿e aptamery wykazywa³y wysok¹ specyficznoæ wi¹zania równie¿ wzglêdem na-tywnej formy rPrPC z homogenatów mózgowych
cho-mika, myszy i krowy. Fakt ten móg³by potwierdzaæ tezê o zachowawczej naturze N-koñcowej sekwencji rPrPC
wród ww. gatunków zwierz¹t (25).
Poniewa¿ PrP, poprzez koniec N, mo¿e oddzia³ywaæ z szeregiem innych moleku³, w tym kwasów nukleino-wych, specyficznoæ dzia³ania aptamerów Ap1 i Ap2 budzi³a w¹tpliwoæ. Z tego wzglêdu w nastêpnych ba-daniach zamiast rPrP, u¿yto do SELEXu fibrylarnych z³ogów prionowych (SAF), które teoretycznie zawie-raj¹ wszelkie warianty konformacyjne PrP (21). Wyse-lekcjonowany aptamer wi¹za³ siê zarówno z natywnym SAF, jak i z materia³em poddanym dzia³aniu proteina-zy K. Testy z u¿yciem rekombinowanych PrP wykaza-³y, ¿e powinowactwo aptameru SAF-93 do form b-fa³-dowych by³o niemal 10-krotnie wiêksze, ni¿ do form a-helikalnych bia³ka. Wskazuje to na istnienie dwóch miejsc wi¹zania w cz¹steczce PrP: pierwszego, znaj-duj¹cego siê w N-koñcowym odcinku ka¿dego PrP, odpowiedzialnego za niespecyficzne wi¹zanie RNA oraz drugiego, umiejscowionego w C-terminalnym, b-fa³dowym odcinku PrP, specyficznie rozpoznawanego przez SAF-93. Preferowanie przez aptamer bia³ek o strukturze b-fa³dowej, typowej dla PrPSc, pozwoli³o
na skuteczn¹ inhibicjê konwersji prionowej in vitro, w modelu bezkomórkowym (cell-free conversion of PrP) (21). Wydaje siê, ¿e SAF-93 bêd¹c istotnym
li-Medycyna Wet. 2007, 63 (10) 1162
gandem dla PrP mo¿e przyczyniæ siê do odkrycia nie-zidentyfikowanych dotychczas konformacji PrP. W jed-nej z najnowszych publikacji ten sam zespó³ badawczy informuje o syntezie nowej formy aptameru, która za-chowuj¹c specyficznoæ konformacyjn¹, zosta³a zredu-kowana do nadaj¹cej siê do syntezy chemicznej. Wy-daje siê, ¿e zastosowanie tej formy aptameru, nazwanej przez autorów SAF-93 (1-34, 35bioU, 36-60) umo¿li-wi detekcjê izoform PrP in vivo (24).
Aptamery w testach immunologicznych
Standardowe testy IHC, WB i ELISA w diagnostyce TSE przeprowadza siê wykorzystuj¹c istnienie fizyko-chemicznych ró¿nic pomiêdzy normaln¹ a chorobotwór-cz¹ form¹ PrP. Jedn¹ z najistotniejszych jest czêciowa opornoæ PrPSc na dzia³anie proteaz (PrPSc bywa
okre-lane tu mianem PrPres od protease-resistant).
Trak-towanie PrPC proteinaz¹ K powoduje ca³kowite
stra-wienie bia³ka, podczas gdy PrPSc jest jedynie skracany
w regionie aminoterminalnym, w wyniku czego powsta-je cz¹steczka o masie 27-30 kD (tzw. PrP27-30), za-chowuj¹ca zdolnoæ zaka¿ania (2).
Chocia¿ PrP27-30 jest markerem powszechnie sto-sowanym w diagnostyce TSE, pojêcie PrPSc nie mo¿e
byæ jednak definiowane jedynie na podstawie oporno-ci na trawienie proteaz¹ i nie jest ono równoznaczne z okreleniem PrPres. Wykazano, ¿e podczas choroby
cz¹steczki PrPC mog¹ ulegaæ takim modyfikacjom
struk-turalnym, które nie wywo³uj¹ zmiany w opornoci na trawienie proteaz¹ (23). W innym eksperymencie, u ponad 55% myszy, na które z powodzeniem przepa-sa¿owano BSE, nie wykryto PrPres (14). W wietle tych
doniesieñ najbardziej wiarygodnym wydaje siê test diagnostyczny wykrywaj¹cy niewielkie iloci patogen-nych form PrP bez koniecznoci dzia³ania proteinaz¹.
Ostatnio odkryto, ¿e cz¹steczki PrPC i PrPSc
odmien-nie reaguj¹ na dzia³aodmien-nie czynnika denaturuj¹cego, np. hydrochlorku guanidyny (Gdn-HCl). Wykorzystywane w tzw. tecie CDI (conformation-dependent immuno-assay) przeciwcia³o detektorowe rozpoznaje epitop, któ-ry w przypadku PrPC ods³oniêty jest w ka¿dych
warun-kach, natomiast w PrPSc eksponowany jest jedynie po
denaturacji. St¹d obecnoæ chorobotwórczej izoformy PrP w homogenacie tkankowym mo¿e byæ zidentyfi-kowana i zmierzona ilociowo poprzez porównanie wi¹zania przeciwcia³a do natywnej i zdenaturowanej formy bia³ka prionowego (22).
Podsumowanie
Wdro¿enie efektywnych metod w terapii chorób prio-nowch nastrêcza szereg trudnoci wynikaj¹cych z na-tury cz¹steczki infekcyjnej, jej strukna-tury, sposobu re-plikacji oraz mechanizmu patogenzy. Obecnie zainte-resowanie badaczy na wiecie wzbudzaj¹ aptamery, z którymi wi¹¿e siê du¿e nadzieje dotycz¹ce ich wyko-rzystania w celach diagnostycznych i terapeutycznych. Liczne publikacje na temat aptamerów wskazuj¹ na ich uniwersalizm, a jednoczenie na wysok¹ specyficznoæ
wi¹zanych cz¹stek docelowych. Najnowsze doniesie-nia ujawdoniesie-niaj¹ mo¿liwoæ zastosowadoniesie-nia tych struktur w rozpoznawaniu chorób prionowych ju¿ in vivo, redukuj¹c tym samym czas oraz koszt stosowanych dotychczas metod diagnostycznych.
Pimiennictwo
1.Aguzzi A.: Blood simple prion diagnostics. Nat. Med. 2001, 7, 289-290. 2.Aguzzi A., Heppner F. L.: Pathogenesis of prion diseases: a progress report. Cell
Death Differ. 2000, 7, 889-902.
3.Bennion B. J., Daggett V.: Protein conformation and diagnostic tests: the prion protein. Clin. Chem. 2002, 48, 2105-2114.
4.Chakraborty C., Nandi S., Jana S.: Prion disease: a deadly disease for protein misfolding. Cur. Pharm. Biotechnol. 2005, 6, 167-177.
5.Eulberg D., Buchner K., Maasch C., Klussmann S.: Development of an automa-ted in vitro selection protocol to obtain RNA-based aptamers: identification of a biostable substance P antagonist. Nucleic Acids Res. 2005, 33, e45. 6.Fournier J. G., Grigoriev B.: Prion diseases: contribution of high-resolution
immunomorphology. J. Cell. Mol. Med. 2001, 5, 367-377.
7.Gofflot S., El M. B., Zorzi D., Melen L., Roels S., Quatpers D., Grassi J., Vanop-denbosch E., Heinen E., Zorzi W.: Immuno-quantitative polymerase chain reac-tion for detecreac-tion and quantitareac-tion of prion protein. J. Immunoassay Immuno-chem. 2004, 25, 241-258.
8.Harris D. A.: Cellular biology of prion diseases. Clin. Microbio. Rev. 1999, 12, 429-444.
9.James W.: Aptamers, [w:] Meyers R. A. (red.): Encyclopedia of Analytical Che-mistry. John Wiley&Sons Ltd, Chichester 2000, 4848-4871.
10.Jayasena S. D.: Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clin. Chem. 1999, 45, 1628-1650.
11.Jenison R. D., Gill S. C., Pardi A., Polisky B.: Isozyme-specific inhibition of protein kinase C by RNA aptamers. J. Bio. Chem. 1994, 269, 32051-32054. 12.Kelly J. W.: The environmental dependency of protein folding best explains prion
and amyloid diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 930-932. 13.Klein M. A., Frigg R., Flechsig E., Raeber A. J., Kalinke U., Bluethmann H.,
Bootz F., Suter M., Zinkernagel R. M., Aguzzi A.: A crucial role for B cells in neuroinvasive scrapie. Nature 1997, 390, 687-690.
14.Lasmezas C. I., Deslys J. P., Robain O., Jaegly A., Beringue V., Peyrin J. M., Fournier J. G., Hauw J. J., Rossier J., Dormont D.: Transmission of the BSE agent to mice in the absence of detectable abnormal prion protein. Science 1997, 275, 402-405.
15.McCarthy A.: Archemix. Nucleic Acids platforms. Chem. Biol. 2002, 9, 663-665. 16.Maclean D., Baldwin J. J., Ivanov V. T., Kato Y., Shaw A., Schenider P., Gordon E. M.: Glossary of Terms Used in Combinatorial Chemistry. Pure Appl. Chem. 1999, 71, 2349-2365.
17.Phan A. T., Kuryavyi V., Ma J. B., Faure A., Andreola M. L., Patel D. J.: An interlocked dimeric parallel-stranded DNA quadruplex: a potent inhibitor of HIV-1 integrase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005, 102, 634-639.
18.Pieken W. A., Olsen D. B., Benseler F., Aurup H., Eckstein F.: Kinetic characteri-sation of ribonuclease-resistant 2-modified hammerhead ribozymes. Science 1991, 253, 314-317.
19.Proske D., Gilch S., Wopfner F., Schatzl H. M., Winnacker E. L., Famulok M.: Prion-protein-specific aptamer reduces PrPSc formation. Chembiochem. 2002, 3, 717-725.
20.Prusiner S. B.: Prions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 13363-13383. 21.Rhie A., Kirby L., Sayer N., Wellesley R., Disterer P., Sylvester I., Gill A., Hope J.,
James W., Tahiri-Alaoui A.: Characterization of 2-fluoro-RNA aptamers that bind preferentially to disease-associated conformations of prion protein and inhibit conversion. J. Biol. Chem. 2003, 278, 39697-39705.
22.Safar J. G., DeArmond S. J., Kociuba K., Deering C., Didorenko S., Bouza-mondo-Bernstein E., Prusiner S. B., Tremblay P.: Prion clearance in bigenic mice. J. Gen. Virol. 2005, 86, 2913-2923.
23.Safar J. G., Scott M., Monaghan J., Deering C., Didorenko S., Vergara J., Ball H., Legname G., Leclerc E., Solforosi L., Serban H., Groth D., Burton D. R., Prusiner S. B., Williamson R. A.: Measuring prions causing bovine spongiform encephalopathy or chronic wasting disease by immunoassays and transgenic mice. Nat. Biotechnol. 2002, 20, 1147-1150.
24.Sayer N. M., Cubin M., Rhie A., Bullock M., Tahiri-Alaoui A., James W.: Structu-ral determinants of conformationally selective, prion-binding aptamers. J. Biol. Chem. 2004, 279, 13102-13109.
25.Schatzl H. M., Da Costa M., Taylor L., Cohen F. E., Prusiner S. B.: Prion protein gene variation among primates. J. Mol. Biol. 1995, 245, 362-374.
26.Schonberger L. B.: New variant Creutzfeldt-Jakob disease and bovine spongi-form encephalopathy. Infec. Dis. Clin. North Am. 1998, 12, 111-121. 27.Tuerk C., Gold L.: Systematic evolution of ligands by exponential enrichment:
RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science 1990, 249, 505-510. 28.Unruh J. R., Gokulrangan G., Wilson G. S., Johnson C. K.: Fluorescence pro-perties of fluorescein, tetramethylrhodamine and Texas Red linked to a DNA aptamer. Photochem. Photobiol. 2005, 81, 682-690.
29.Weissmann C., Aguzzi A.: Approaches to therapy of prion diseases. Ann. Rev. Med. 2005, 56, 321-344.
30.Wilson D. S., Szostak J. W.: In vitro selection of functional nucleic acids. Ann. Rev. Biochem. 1999, 68, 611-647.
Adres autora: mgr in¿. Aleksandra Stêpieñ, ul. Kar³owicza 24, 85-092 Bydgoszcz; e-mail: a_stepien@cm.umk.pl
