Medycyna Weterynaryjna - Summary Medycyna Wet. 62 (7), 840-841, 2006

Medycyna Wet. 2006, 62 (7) 840

Praca oryginalna Original paper

Nosówka psów (febris catarrhalis infectiosa canum) jest wysoce zaraŸliw¹, ogólnoustrojow¹, gor¹czkow¹ chorob¹ wirusow¹, przebiegaj¹c¹ z objawami nie¿ytu b³on œluzo-wych przewodu pokarmowego i uk³adu oddechowego, któ-rym towarzysz¹ komplikacje neurologiczne i wtórne zaka-¿enia bakteryjne (1, 4, 9, 13).

Na chorobê tê najbardziej wra¿liwe s¹ szczeniêta w wieku 3-6 miesiêcy, po zaniku odpornoœci biernej. G³ówn¹ bram¹ wejœcia dla wirusa jest nab³onek uk³adu oddechowego. St¹d dostaje siê on do uk³adu limfatycznego, a dalej do krwi, gdzie za poœrednictwem makrofagów i leukocytów roz-przestrzenia siê po ca³ym organizmie (1, 9-12).

Wirus zwykle eliminowany jest z organizmu w ci¹gu 14 dni po zaka¿eniu. W niektórych przypadkach, w zale¿noœ-ci od zjadliwoœzale¿noœ-ci szczepu zaka¿aj¹cego, mo¿e utrzymywaæ siê od 1 do 2 tygodni d³u¿ej (5).

Nosówkê nale¿y podejrzewaæ u psów w ka¿dym przy-padku pojawienia siê gor¹czki i nie¿ytu b³on œluzowych. Niemniej jednak pewne rozpoznanie postawiæ mo¿na w oparciu o wyniki badañ laboratoryjnych. Najczêœciej w diagnostyce stosowane s¹: odczyn immunofluorescen-cji, testy immunocytochemiczne, badanie histopatologicz-ne oraz próba biologiczna. W ostatnich latach coraz wiêk-sze znaczenie zyskuje reakcja PCR.

Celem badañ by³o okreœlenie przydatnoœci metody PCR w wykrywaniu materia³u genetycznego wirusa CD w leu-kocytach krwi psów.

Materia³ i metody

Badania przeprowadzono na grupie 4 psów (trzy samce i jed-na samica), mieszañców, w wieku 5-7 miesiêcy, klinicznie zdro-wych, szczepionych przeciwko nosówce ¿ywym, atenuowanym wirusem CD (Canivac F Biowet Pu³awy) oraz na grupie 14 psów, chorych z objawami nasuwaj¹cymi podejrzenie nosówki, a mia-nowicie: leukopeni¹, gor¹czk¹, brakiem apetytu, zapaleniem spo-jówek, u jednego z psów wystêpowa³y wymioty, u jednego bie-gunka, zaœ u trzech objawy nerwowe w postaci tików. Grupê tê

tworzy³o: 5 samic i 9 samców, 11 mieszañców, 1 owczarek nie-miecki, 1 doberman i 1 pekiñczyk w wieku od 6 tygodni do 7 mie-siêcy. ¯aden z psów nie by³ szczepiony przeciwko nosówce.

Materia³em do badañ by³y próbki krwi obwodowej stabilizo-wanej EDTA. Od psów szczepionych pobierano je: 1., 2., 6., 10., 14., 19., 24., 28. i 35. dnia po szczepieniu, natomiast od psów chorych w trakcie pierwszego badania klinicznego.

Izolacja leukocytów z pe³nej krwi. Leukocyty izolowano z pe³nej krwi przy u¿yciu odczynnika Histopaque (Sigma). Krew w iloœci 3 ml nawarstwiano na 3 ml odczynnika po czym wirowa-no przez 30 minut przy 1490 obrotów/min., w temperaturze 20°C. Frakcjê leukocytów przep³ukiwano 3-krotnie buforem PBS i osa-dzano przy 1178 obrotów/min. przez 10 min. (Sigma 3 K 15, rotor Nr.11133). Osad leukocytów zawieszano w 500 µl PBS.

Izolacja RNA z leukocytów. Do izolacji ca³kowitego RNA z leukocytów wykorzystano odczynnik Trizol LS (Invitrogen). Do 250 µl zawiesiny limfocytów wprowadzono 750 µl trizolu. Po 5-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej do próbek do-dawano 200 µl chloroformu, wirowano 15 min. przy 10 000 ob-rotów/min., w temperaturze 4°C. Powsta³¹ fazê wodn¹ przeno-szono do 500 µl izopropanolu i inkubowano w temperaturze –20°C przez 24 godziny. Nastêpnie próbki wirowano w 4°C, przy 14 000 obrotów/min. przez 45 min. Wirusowe RNA wytr¹cano 70% etanolem, a uzyskany precypitat zawieszano w 20 µl wody. Startery reakcji PCR. W badaniach wykorzystano, zalecane w piœmiennictwie, dwie pary starterów swoistych dla genu bia³ka nukleoproteiny (NP nucleocapsid gen) CDV (3). Startery ze-wnêtrzne P3 (5’-CAAAGACGTGTGGTCGGAGAA-3’) i P4 (5’CTTAGTAAGCATCCTCATCTTGGC-3’) u¿ywane do reak-cji RT-PCR, pozwala³y na amplifikacjê fragmentu genu NP o d³u-goœci 900 par zasad, natomiast startery wewnêtrzne P1 (5-’ACAG-GATTGCTGAGGACCTAT-3’) i P2 (5-’CAAGATAACCATG-TACGGTGC-3’) umo¿liwia³y amplifikacjê odcinka genu o d³u-goœci 287 par zasad.

Reakcja odwrotnej transkrypcji. Mieszaninê sk³adaj¹c¹ siê z 5 µl wyizolowanego ca³kowitego RNA, 9,5 µl H2O i 1 µl p(dN)6 denaturowano w temperaturze 65°C przez 5 minut, po czym umieszczono w ³aŸni lodowej na okres 5 minut. Nastêpnie doda-wano: 5 µl buforu dla odwrotnej transkryptazy, 2,5 µl dNTPs (koñcowa koncentracja 2 mM), 1 µl inhibitora RNA-zy (10 u/µl),

Zastosowanie reakcji PCR w diagnostyce nosówki psów

ZBIGNIEW GR¥DZKI, JACEK MADANY*, MACIEJ SKRZYPCZAK**

Zak³ad Epizootiologii i Klinika Chorób ZakaŸnych,*Katedra i Klinika Chorób Wewnêtrznych Zwierz¹t Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej AR, ul. G³êboka 30, 20-612 Lublin

**Katedra Po³o¿nictwa i Chorób Kobiecych AM, ul. Jaczewskiego 8, 20-090 Lublin

Winiarczyk S., Adaszek £., Dziduszko A., Gr¹dzki Z., Madany J., Skrzypczak M.

Applying the PCR method in diagnosing canine distemper virus

The aim of the study was to estimate the utility of the PCR method in diagnosing canine distemper. A group of 4 healthy, vaccinated dogs (Canivac F Biowet Pu³awy) and a group 14 sick animals having symptoms of distemper were included in the experiment. Specimens of blood from all dogs were collected and leucocytes were isolated, RNA extracted and reverse transcription carried out. The obtained c DNA was used in RT-PCR. Genetic material of the virus in the leucocytes of all the vaccinated animals was detected using RT-PCR between day 6-19 and by nested PCR between days 2-24 following immunization. RT-PCR was positive in 3 dogs of the group of sick animals and nested PCR in 9 additional dogs.

Medycyna Wet. 2006, 62 (7) 841

1 µl odwrotnej transkryptazy (200 u/µl). Syntezê cDNA przepro-wadzano w temperaturze 50°C przez 30 minut. Mieszaninê reak-cyjn¹ inkubowano w 94°C przez 5 minut.

Reakcja PCR. Amplifikacjê uzyskanego cDNA przeprowa-dzono w 50 µl mieszaniny reakcyjnej zawieraj¹cej: 31,5 µl wody, 5 µl buforu dla Taq polimerazy, 1 µl dNTP (10 mM), po 1 µl ka¿dego ze starterów P3 i P4 (koñcowa koncentracja 0,2 µM), 5 µl MgCl2 (25 mM), 0,5 µl Taq DNA Polimerase w stê¿eniu 5 u/µl (Fermentas) oraz 5 µl matrycy (zsyntetyzowanej wczeœniej nici cDNA). Pierwsza reakcja PCR sk³ada³a siê z 40 cykli: de-naturacji nici w 94°C przez 30 sekund, przy³¹czenia starterów w 55°C przez 30 sekund i wyd³u¿enia nici w 68°C przez 1 minu-tê. Drug¹ reakcjê PCR przeprowadzono wed³ug takiej samej pro-cedury, zastêpuj¹c startery zewnêtrzne P3 i P4 starterami we-wnêtrznymi P1 i P2.

Elektroforeza. Uzyskane produkty reakcji RT-PCR i nested PCR by³y analizowane metod¹ elektroforezy w 1% ¿elu agarozo-wym, w buforze TBE przy 10 V/cm przez 50 minut. Wielkoœæ produktów amplifikacji okreœlano w odniesieniu do wzorca ma-sowego DNA ladder 100 bp (Gibco BRL).

Wyniki i omówienie

U wszystkich czterech immunizowanych psów materia³ genetyczny wirusa CDV stwierdzono w leukocytach krwi metod¹ RT-PCR od 6. do 19. dnia po podaniu szczepionki. Okres wykrywania wirusa by³ d³u¿szy po zastosowaniu drugiej reakcji PCR na matrycy produktu reakcji RT-PCR. Fragment genu NP o d³ugoœci 287 pz. uda³o siê uzyskaæ ju¿ drugiego dnia po szczepieniu, a jego amplifikacja by³a jeszcze mo¿liwa 24. dnia. Grupa ta stanowi³a odniesienie i jednoczeœnie kontrolê czu³oœci i swoistoœci u¿ytego testu. W grupie psów chorych podejrzanych o nosówkê obec-noœæ wirusa potwierdzono metod¹ RT-PCR tylko w trzech przypadkach. Natomiast reamplifikacja amplikonów RT--PCR w drugiej reakcji PCR pozwoli³a na potwierdzenie rozpoznania klinicznego u kolejnych dziewiêciu zwierz¹t. Komórki nab³onkowe i leukocyty krwi s¹ najczêœciej wykorzystywanym materia³em do wykrywania obecnoœci wirusa nosówki. Wybór leukocytów w badaniach w³asnych by³ podyktowany tym, ¿e szczepy atenuowane CDV nie rozprzestrzeniaj¹ siê z tkanki limfoidalnej do komórek na-b³onkowych i w zwi¹zku z tym nie s¹ w nich wykrywalne (6). Analiza wyników uzyskanych w badaniach w³asnych stanowi potwierdzenie danych piœmiennictwa, ¿e druga reakcja PCR – tak zwany nested-PCR – podnosi czu³oœæ wykrywania materia³u genetycznego przez pierwsz¹ reak-cjê PCR, a w przypadku amplifikacji RNA reakreak-cjê RT-PCR (8, 12). Niemniej jednak rezultaty podobnych badañ prze-prowadzonych przez innych autorów ró¿ni¹ siê od naszych w zakresie d³ugoœci czasu, w którym mo¿na wykrywaæ wi-rusa w leukocytach krwi psów poddanych szczepieniu pro-filaktycznemu. Kim i wsp. (8) pos³uguj¹c siê drug¹ reakcj¹ PCR, wykrywali materia³ genetyczny CDV w 2. i 7. dniu po immunizacji, natomiast 14. dnia wyniki amplifikacji by³y ju¿ negatywne. W badaniach, które przeprowadzili Rze-¿utka i Mizak (12), okres detekcji wirusa ³añcuchow¹ re-akcj¹ polimerazy w tkankach i narz¹dach wewnêtrznych po doœwiadczalnym zaka¿eniu psów by³ d³u¿szy i wynosi³ maksymalnie 19 dni, pomiêdzy 3. a 21. dniem po zaka¿e-niu. Jednak u dwu spoœród piêciu badanych psów w ogóle nie mo¿na by³o wykazaæ materia³u genetycznego wirusa, a u pozosta³ych trzech okres wykrywania wirusa by³ zró¿-nicowany i wynosi³ 19, 15 i 9 dni.

W badaniach w³asnych zastosowano równie¿ metodê PCR do diagnostyki klinicznych przypadków nosówki. Tylko u 2 spoœród 14 chorych psów z objawami

nasuwa-j¹cymi podejrzenie tej choroby nie wykazano materia³u ge-netycznego wirusa CDV w drugiej reakcji PCR. Podobne wyniki w tym zakresie uzyskali inni autorzy. Frisk i wsp. (3) stosuj¹c startery, które zosta³y u¿yte w badaniach w³as-nych, wykaza³ obecnoœæ kwasu nukleinowgo wirusa no-sówki w leukocytach krwi u 14 spoœród 17 psów, w organi-zmie których potwierdzono poœmiertnie wystêpowanie an-tygenu wirusa w narz¹dach wewnêtrznych metod¹ immu-nohistochemiczn¹. Z kolei JóŸwik (7) przy pomocy drugiej reakcji PCR potwierdzi³a infekcjê zaledwie u 12 spoœród 23 psów wykazuj¹cych kliniczne objawy nosówki. Warto nadmieniæ, ¿e 6 spoœród wspomnianych 12 psów by³o do-datnich w teœcie immunofluorescencji, a tylko 2 w badaniu RT-PCR.

Porównanie wyników metody PCR i immunofluorescen-cji koresponduje do pewnego stopnia z wynikami uzyska-nymi przez Bixenkrone-Moller i wsp. (2), którzy wykazali obecnoœæ antygenu CDV w teœcie poœredniej IF u 27 psów choruj¹cych z objawami nasuwaj¹cymi podejrzenie nosów-ki. Wed³ug tych samych autorów, antygen wirusa nosówki w komórkach nab³onkowych spojówki i innych b³on œlu-zowych mo¿na wykrywaæ do 3. tygodnia od momentu za-ka¿enia.

Na podstawie analizy prezentowanych wyników w kon-tekœcie przytoczonych danych piœmiennictwa mo¿na stwier-dziæ, ¿e aktualnie technika RT-PCR jest najczulsz¹ i naj-bardziej swoist¹ metod¹ wykrywania obecnoœci wirusa CDV w organizmie. Wprawdzie wykazanie antygenu me-tod¹ immunofluorescencji poch³ania mniej czasu w porów-naniu do detekcji kwasu nukleinowego reakcj¹ PCR, nie-mniej jednak obarczone jest subiektywn¹ ocen¹ preparatu mikroskopowego. Niezale¿nie od zastosowanej metody (PCR, IF) okres wykrywania antygenów i kwasów nuklei-nowych nie przekracza 24 dni od momentu zaka¿enia. W zwi¹zku z tym ujemny wynik tych badañ w podostrej, a zw³aszcza w przewlek³ej postaci nosówki nie wyklucza tej choroby.

Piœmiennictwo

1.Appel M.: Virus Infection of Carnivores. Elsevier Science Publishers B. V., Am-sterdam-Oxford 1987, 133-159.

2.Blixenkrone-Moller M., Svansson V., Have P., Orvell C, Appel M., Pedersen I., Diez H., Henriksen P.: Studies on manifestations of canine distemper virus infec-tion in an urban dog populainfec-tion. Vet. Microbiol. 1993, 37, 137-163.

3.Frisk A. L., Konig M., Moritz A., Baumgartner W.: Detection of canine distemper virus nucleoprotein RNA by reverse transcription-PCR using serum, whole blood, and cerebrospinal fluid from dogs with distemper. J. Clin. Microbiol. 1999, 37, 3634-3643.

4.Frymus T.: Choroby zakaŸne psów. Wydawnictwo Si-ma, Warszawa 1999. 5.Greene C. E.: Infectious Diseases of the Dog and Cat. Saunders W. B. Company

Philadelphia 1998, 9-22.

6.Hoskins J. D.: Canine Viral Diseases, [w:] Ettinger S. J., Feldman E. C. (red.): Textbook of Veterinary Internal Medicine. Saunders W. B. Company, Philadel-phia 2000, 418-423.

7.JóŸwik A.: Badania nad wystêpowaniem nosówki psów, jej rozpoznawaniem me-tod¹ RT-PCR oraz odpornoœci¹ populacji przeciw tej chorobie. Praca dokt. Wydz. Med. Wet. SGGW, Warszawa 2002.

8.Kim Y. H., Cho K. W., Youn H. Y., Yoo H. S., Han H. R.: Detection of canine distemper virus (CDV) through one step RT-PCR combined with nested PCR. J. Vet. Sci. 2001, 2, 59-63.

9.Klimentowska I., Klimentowski S., Kolbl S., Rypu³a K.: Zaka¿enia wirusowe psów z objawami biegunki. Medycyna Wet. 1998, 54, 395-401.

10.Rze¿utka A., Mizak B.: Epizootiologia zaka¿eñ wirusem nosówki. Medycyna Wet. 2002, 58, 323-326.

11.Rze¿utka A., Mizak B.: Wirus nosówki jego struktura i genetyczny mechanizm replikacji. Medycyna Wet. 2001, 57, 870-873.

12.Rze¿utka A., Mizak B.: Wystêpowanie wirusa nosówki w limfocytach i tkankach psów zaka¿onych doœwiadczalnie. Medycyna Wet. 2004, 60, 1287-1290. 13.Winiarczyk S., Gr¹dzki Z., Wo³oszyn S., Pejsak Z., ¯mudziñski J. F., Gund³ach J.,

Sadzikowski A., Osek J.: Choroby zakaŸne zwierz¹t domowych z elementami zoonoz. Dzia³ Wydawnictw Pañstwowego Instytutu Weterynaryjnego w Pu³awach, Lublin 2001, 381-387.

Adres autora: prof. dr hab. Stanis³aw Winiarczyk, ul. G³êboka 30, 20-612 Lublin; e-mail: genp53@interia.pl