Artyku³ przegl¹dowy Review
W ostatnich latach obserwuje siê na wiecie, w tym w Polsce, szczególne zainteresowanie naukowe zagad-nieniami rozrodu kotowatych (2, 15). Jest to spowo-dowane rosn¹c¹ od wielu lat populacj¹ wartociowych pod wzglêdem hodowlanym kotów rasowych i w zwi¹zku z tym rosn¹cym zapotrzebowaniem na sto-sowanie u tego gatunku technik wspomaganego roz-rodu, wzorem psa domowego. Kojarzenie osobników dobranych pod wzglêdem hodowlanym, konserwacja i transport gamet oraz tworzenie rezerwy genetycznej cennych samców to wymogi dzisiejszych czasów, po-dyktowane zapotrzebowaniem ze strony ogromnej rze-szy hodowców kotów.
Z drugiej strony, wyniki prac dotycz¹cych rozrodu kota domowego (Felis domesticus) stanowi¹ cenn¹ bazê naukow¹, mo¿liw¹ do aplikacji w dziedzinie roz-rodu dzikich kotowatych (4, 26). Warto przypomnieæ, i¿ populacja dzikich kotowatych jest alarmuj¹co nis-ka, a wszystkie gatunki przedstawicieli rodziny Feli-dae zagro¿one s¹ wyginiêciem. Prace dotycz¹ce prak-tycznych metod wspomagania rozrodu kota domowe-go s¹ niezwykle cenne z punktu widzenia mo¿liwoci wdro¿enia biotechnik rozrodu celem ratowania popu-lacji zwierz¹t dzikich. Prowadzenie badañ na zwie-rzêtach dzikich jest bardzo trudne ze wzglêdu na wspo-mnian¹ wczeniej nisk¹ liczebnoæ ich populacji. Kot domowy jest bardzo dobrym i ³atwo osi¹galnym
mo-delem biomedycznym do badañ nad dzikimi kotowa-tymi, choæ z punktu widzenia techniki badawczej nie jest gatunkiem ³atwym. Wiele zespo³ów badawczych na ca³ym wiecie prowadzi badania nad rozrodem kota domowego (1, 3, 10, 12, 24, 29), aby póniej wpro-wadzaæ wypracowane procedury u zwierz¹t dzikich, ¿yj¹cych w naturze lub utrzymywanych w ogrodach zoologicznych. W Polsce tego rodzaju badania w od-niesieniu do omawianego gatunku prowadzone by³y niezwykle rzadko (11, 26).
Podstawowymi biotechnikami rozrodu, znajduj¹cy-mi w perspektywie zastosowanie zarówno w zakresie potrzeb dotycz¹cych hodowli kota domowego, jak i ratowania populacji zwierz¹t dzikich zagro¿onych wyginiêciem, s¹: pobieranie i konserwacja nasienia, sztuczna inseminacja, pobieranie i dojrzewanie oocy-tów in vitro, zap³odnienie pozaustrojowe, transfer zarodków oraz konserwacja komórek jajowych (24, 31).
Pobieranie i konserwacja nasienia
Najwiêksz¹ przeszkod¹ metodyczn¹ od pocz¹tku zainteresowania naukowego omawian¹ dziedzin¹ by³a niezwykle trudna technika pobierania nasienia od sam-ców kota domowego. Stosowano w tym celu elektro-ejakulacjê, sztuczn¹ pochwê lub pobieranie nasienia naj¹drzowego po zabiegu usuniêcia gonad mêskich (1, 4, 31-34). Niestety, ¿adna z powy¿szych technik nie jest wolna od wad. Elektroejakulacja jest metod¹
trud-Biotechniki w rozrodzie kotowatych
stan wiedzy, perspektywy i wyzwania*
)
WOJCIECH NI¯AÑSKI, NATALIA MIKO£AJEWSKA, AGNIESZKA PARTYKA, MA£GORZATA OCHOTA
Katedra Rozrodu z Klinik¹ Zwierz¹t Gospodarskich Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej UP, pl. Grunwaldzki 49, 50-366 Wroc³aw
Ni¿añski W., Miko³ajewska N., Partyka A., Ochota M.
Biotechnologies in the reproduction of felines: State of knowledge, prospects and challenges
Summary
Owing to a drastic decline in the population of wild cats and a growing interest among cat breeders, the development of assisted reproductive techniques for felines has been an important subject of research over the last decade. In this paper we describe the present state of knowledge and prospects for development in this field. The paper is divided into sections dealing with the collection and preservation of semen, artificial insemination, oocyte collection, in vitro fertilization and cryopreservation of eggs. The paper also discusses the apoptotic events occurring in gametes, which are crucial for the development of assisted reproductive techniques.
Keywords: assisted reproductive techniques, cryopreservation, domestic cat, wild felids
*) Opracowanie wykonane w ramach projektu finansowanego przez MNiSW/
n¹, wymaga pe³nego znieczulenia, stoi w sprzeczno-ci z szeroko pojêtym dobrostanem zwierz¹t i nie jest akceptowana z powodów etycznych przez wielu ba-daczy i hodowców. Ponadto nie zawsze jakoæ nasie-nia uzyskanego t¹ metod¹ jest zadowalaj¹ca. Pobiera-nie przy u¿yciu sztucznej pochwy jest bardzo trudne technicznie i wymaga obecnoci samicy w okresie rui. Ponadto metoda ta nie mo¿e byæ zastosowana u dzi-kich kotowatych. Pobieranie nasienia naj¹drzowego jest mo¿liwe do przeprowadzenia z istoty rzeczy jedy-nie jeden raz w ¿yciu samca. Plemniki uzyskuje siê poprzez wykonanie wielu naciêæ w okolicy ogona na-j¹drza i zanurzenie tkanki w medium zoptymalizowa-nym dla plemników, np. w rozrzedzalniku opartym na buforze Tris. Plemniki wykazuj¹ce ruch postêpowy uwalniaj¹ siê do medium i mog¹ byæ bezporednio lub po oczyszczeniu metod¹ migracji wstêpuj¹cej swim up poddane dalszym procedurom. Ze wzglê-du na mo¿liwoæ tylko jednokrotnego wykorzystania tej techniki w ¿yciu samca nie nadaje siê ona do wy-korzystania u zwierz¹t hodowlanych. Stosowana mo¿e byæ jednak u dzikich kotowatych w celu stworzenia rezerwy genetycznej pad³ych lub kastrowanych sam-ców. W tym zakresie jest ona niezwykle cenn¹ meto-d¹ biotechniczn¹ i bêdzie prawdopodobnie wykorzy-stywana w dalszym ci¹gu w du¿ym zakresie w odnie-sieniu do tej grupy zwierz¹t.
W ostatnich latach opracowano nowatorsk¹, niezwy-kle prost¹ i atraumatyczn¹ metodê pobierania nasie-nia od samców kota domowego z cewki moczowej (4, 34). Metoda ta polega na podaniu medetomidyny rodka z grupy alfa-mimetyków stosowanych do bez-piecznego znieczulania zwierz¹t. Leki alfa-mimetycz-ne wywieraj¹ wp³yw kurcz¹cy na miêniówkê g³adk¹ dróg wyprowadzaj¹cych nasienie, powoduj¹c uwolnie-nie pozaj¹drowych rezerw plemników. Stwierdzono, ¿e dawka ok. 150 mcg/kg m.c. powoduje wyrzut plem-ników do cewki moczowej w iloci odpowiedniej do pozyskania nasienia i jego konserwacji. Metoda ta mo¿e stanowiæ doskona³¹ technikê pobierania nasie-nia od kotów hodowlanych i dzikich kotowatych. Jest mo¿liwe wielokrotne jej stosowanie u zwierz¹t hodow-lanych, co daje sposobnoæ wielokrotnej konserwacji dawek inseminacyjnych pochodz¹cych od danego osobnika celem tworzenia banków nasienia cennych genetycznie samców. Metodê tê mo¿na zastosowaæ u dzikich kotowatych, u których wspó³czenie poda-nie rodka zpoda-nieczulaj¹cego poda-nie stanowi w praktyce ¿adnej przeszkody. Stwarza zatem mo¿liwoæ przygo-towywania dawek inseminacyjnych równie¿ od cen-nych samców zwierz¹t dzikich w aspekcie tworzenia ich rezerwy genetycznej.
Przeprowadzono pierwsze prace dotycz¹ce oceny w³aciwoci pobranego w ten sposób nasienia za po-moc¹ metod mikroskopowej oceny konwencjonalnej, dokonano prób mro¿enia tego rodzaju nasienia oraz porównano jego jakoæ z nasieniem pozyskanym za pomoc¹ elektroejakulacji (31, 32).
U kotowatych stosuje siê zwykle procedury krio-konserwacji nasienia oparte o technologie stosowane równie¿ u psowatych. Pierwsze próby mro¿enia na-sienia kota przewidywa³y wykorzystanie rozrzedzal-nika laktozowego (15). Najczêciej wykorzystywane rozrzedzalniki oparte s¹ na buforze Tris lub TEST (15, 34). Najkorzystniejsze wyniki jakoci porozmro-¿eniowej stosuje siê przy dodatku do rozrzedzalnika 20% (obj.) ¿ó³tka jaja kurzego, 4-8% (obj.) glicerolu i 1% (obj.) substancji zawieraj¹cych laurylosiarczan sodu, takich jak Equex STM lub Orvus ES Paste (1, 22, 28, 33). Nasienie zwykle konfekcjonowane jest w 0,25 ml s³omkach i mro¿one w statycznych parach azotu lub urz¹dzeniu do programowanego zamra¿a-nia (15). Na podstawie analizy dostêpnego pimien-nictwa mo¿na sformu³owaæ konkluzjê, i¿ najlepsze wyniki jakoci porozrmo¿eniowej in vitro oraz najlep-sze wyniki prób biologicznych uda³o siê uzyskaæ przy zastosowaniu rozrzedzalnika Triskwas cytrynowy glukoza/fruktoza¿ó³tko jaja kurzegoglicerol z do-datkiem Equex STM i konfekcjonowaniu w s³omkach (1, 8, 33).
Sztuczna inseminacja
Pierwsze zabiegi sztucznej inseminacji u kotów przeprowadzono ponad 30 lat temu (31). Niestety, jak dot¹d biotechniki rozrodu u tego gatunku mia³y cha-rakter eksperymentalny, a ich wykorzystanie w prak-tyce jest niezwykle ograniczone (28, 31). Pomimo licz-nych badañ w tym zakresie i ogromnego zaintereso-wania wielu rodowisk hodowlanych i naukowych aplikacja powy¿szych prac w odniesieniu do kotów rasowych i dzikich kotowatych jest niewielka. Proce-dury biotechniczne stosowane s¹ w praktyce rzadko i w sposób przypadkowy. Jest to spowodowane fak-tem, i¿ zabieg sztucznej inseminacji jest technicznie niezwykle trudny. Dotyczy to zw³aszcza inseminacji domacicznej. Wykorzystanie nasienia poddanego kon-serwacji wymaga zastosowania domacicznego zdepo-nowania nasienia. Trudnoæ ta zosta³a czêciowo opa-nowana dziêki opracowaniu skutecznej metody kate-teryzacji szyjki macicznej przez Chatdaronga i wsp. (2). Zaproponowana technika inseminacji domacicz-nej wymaga jednak du¿ych umiejêtnoci manualnych, co ka¿e patrzeæ z pesymizmem na szybk¹ perspekty-wê upowszechnienia tej procedury. W tym zakresie atrakcyjn¹ alternatyw¹ sztucznej inseminacji jest lapa-roskopowy transfer zarodków po przeprowadzeniu procedury pozyskania, dojrzewania oocytów i zap³od-nienia in vitro. Nale¿y mieæ na wzglêdzie doæ wyso-k¹ skutecznoæ tego rodzaju zabiegu notowan¹ ju¿ od wielu lat (24).
Pozyskiwanie komórek jajowych, dojrzewanie i zap³odnienie pozaustrojowe
Badania dotycz¹ce pozyskiwania oocytów u koto-watych, ich dojrzewania (in vitro maturation IVM) i zap³odnienia in vitro (in vitro fertilization IVF)
pro-wadzone s¹ od wielu lat. Prace maj¹ce na celu okre-lenie optymalnych mediów s³u¿¹cych dojrzewaniu oocytów i rozwojowi zarodków kota domowego w wa-runkach pozaustrojowych trwaj¹ nieprzerwanie w wie-lu jednostkach badawczych na wiecie (4, 24, 34). Wród warunków dojrzewania autorzy proponuj¹ ro-dowisko powietrza z 5% zawartoci¹ CO2 lub rodo-wisko 90% N2 z 5% zawartoci¹ CO2 i 5% zawarto-ci¹ O2 oraz temperaturê od 38°C do 38,5°C. Hodowle prowadzi siê w medium do dojrzewania, np. TCM 199 lub SOF z dodatkiem gonadotropin (5, 11, 23). Inku-bacja oocytów w tych warunkach przez okres 24 go-dzin pozwala uzyskaæ oko³o 50-70% mejotycznie kom-petentnych oocytów w metafazie II podzia³u mejotycz-nego. Po 18-godzinnej inkubacji z plemnikami oko³o 30-50% oocytów ulega zap³odnieniu. W czasie dal-szej inkubacji trwaj¹cej do 7 dni stadium blastocysty osi¹ga maksymalnie do 20% zarodków (4, 12, 26, 30). Inn¹, coraz czêciej stosowan¹ w badaniach nad roz-rodem kotowatych, technik¹ zap³odnienia pozaustro-jowego jest ICSI (intracytoplasmic sperm injection). Polega ona na wstrzykniêciu plemnika do komórki ja-jowej w stadium metafazy II. Uzyskiwane przy u¿yciu tej metody odsetki zap³odnieñ s¹ nieco wy¿sze ni¿ w przypadku IVF (oko³o 40-60% zap³odnieñ, 25% blastocyst) (18), lecz do wykonania iniekcji niezbêd-ne jest posiadanie kosztowniezbêd-nego sprzêtu do mikroma-nipulacji. Do technik IVM/IVF/ICSI selekcjonuje siê jedynie najlepszej jakoci oocyty posiadaj¹ce ciemn¹, jednorodn¹ cytoplazmê, otoczone kilkoma warstwa-mi komórek wzgórka jajononego, poniewa¿ w takiej sytuacji istnieje najwy¿sza szansa na prawid³owy ich rozwój (18). Skutecznoæ zap³odnienia in vitro oce-niana jest zwykle poprzez ocenê zmian morfologicz-nych zachodz¹cych podczas bruzdkowania (podzia³ na 2 lub wiêcej blastomerów). Dodatkowo ocenê skutecz-noci dojrzewania i zap³odnienia pozaustrojowego mo¿na przeprowadziæ przy u¿yciu metod fluorescen-cyjnych z u¿yciem barwników typu: DAPI, Hoechst lub jodek propidyny. W zabarwionych komórkach jajowych lub zarodkach oceniamy obecnoæ cia³ka kie-runkowego, wiadcz¹cego o dojrza³oci j¹drowej oocy-tu, dwóch przedj¹drzy lub podzia³u na blastomery (4). Ponadto zap³odnione i podlegaj¹ce podzia³om komór-kowym zarodki mo¿na oceniaæ przy u¿yciu mikrosko-pu odwróconego lub utrwalaæ, barwiæ i oceniaæ przy u¿yciu mikroskopu fluorescencyjnego na dowolnym etapie rozwoju. Ocena odsetka zarodków, które roz-winê³y siê do stadium moruli lub blastocysty, jest nie-zwykle istotna z punktu widzenia badañ zwi¹zanych z transferem zarodków (4, 34).
Kriokonserwacja komórek jajowych
Bardzo istotn¹ czêci¹ technik wspomaganego roz-rodu jest kriokonserwacja komórek jajowych. Mo¿-liwoæ czasowego rozdzielenia procesu pobierania komórek jajowych od procesu zap³odnienia by³aby znacznym u³atwieniem w pracach nad zap³odnieniem
pozaustrojowym dzikich kotowatych. Niestety, ze wzglêdu na budowê komórki jajowej osobników ro-dziny Felidae charakteryzuj¹c¹ siê du¿¹ zawartoci¹ lipidów w ooplazmie, zdekondensowan¹ chromatyn¹ oraz stosunkowo du¿ym pêcherzykiem zarodkowym w porównaniu z innymi gatunkami, komórki te s¹ trud-nym materia³em do kriokonserwacji (14). Poród technik kriokonserwacji stosowanych u kotowatych wyró¿nia siê wolne mro¿enie programowane oraz wi-tryfikacjê. Pierwsza metoda polega na stopniowym, kontrolowanym obni¿aniu temperatury w urz¹dzeniu do programowanego zamra¿ania, po uprzedniej inku-bacji oocytów w mediach z kilkuprocentowym dodat-kiem substancji krioochronnych. Druga polega na za-nurzeniu komórek jajowych w ciek³ym azocie, po krót-kotrwa³ej inkubacji w wysoko stê¿onych (oko³o 30--40%) substancjach krioochronnych. Ka¿da z powy¿-szych metod posiada zarówno swoich zwolenników, jaki i przeciwników, a odsetki zap³odnieñ uzyskanych po ich zastosowaniu s¹ w obu przypadkach nadal niskie w porównaniu z innymi gatunkami zwierz¹t lub cz³owiekiem, dlatego konieczne s¹ dalsze badania w tej dziedzinie (15).
Zjawiska apoptotyczne w gametach zwierz¹t kotowatych
W komórkach gametogenicznych obserwowany jest ró¿ny stopieñ nasilenia zjawisk peroksydacji lipidów i apoptozy. Zjawiska apoptotyczne podczas procesu spermatogenezy uzale¿nione s¹ od wielu czynników, m.in. oddzia³ywania reaktywnych form tlenu, pory roku u zwierz¹t z wyra¿on¹ sezonowoci¹ rozrodu, zmian zwyrodnieniowych w gonadach, oddzia³ywania sub-stancji toksycznych, stanu zdrowia zwierzêcia, obec-noci procesów patologicznych w narz¹dzie p³ciowym, np. zapalenia itp. (7, 9, 27). W nasieniu poddanym procedurom biotechnicznym nasilenie procesów pro-apoptotycznych uzale¿nione jest od wyjciowej jako-ci pobranego nasienia, warunków postêpowania z na-sieniem w warunkach in vitro, metody konserwacji, optymalizacji procesu mro¿enia-rozmra¿ania, oddzia-³ywania reaktywnych form tlenu (7, 20, 27). Peroksy-dacja lipidów i bia³ek, uszkodzenia b³on i kwasów nukleinowych, do których dochodzi podczas pobiera-nia i konserwacji nasiepobiera-nia pod wp³ywem niekorzyst-nych warunków rodowiska w warunkach in vitro, w tym oddzia³ywania wolnych rodników, prowadzi do uruchomienia zjawisk prowadz¹cych do destrukcji komórek w sposób nasuwaj¹cy przypuszczenie uru-chomienia przemian analogicznych do apoptozy. Pro-cesy te prowadziæ mog¹ do powolnej dezintegracji komórek i utraty ich prawid³owej funkcji w stopniu uniemo¿liwiaj¹cym zdolnoæ do zap³odnienia. Ocena nasilenia powy¿szych zjawisk w nasieniu kotów pod-danym procedurom biotechnicznym poruszana by³a dotychczas w dostêpnym pimiennictwie niezwykle rzadko (26). Jest powszechnie wiadome, ¿e ród³em czynników ochronnych, dekapacytacyjnych i
chroni¹-cych plemniki przed peroksydacj¹ lipidów jest plazma nasienia. Plemniki stanowi¹ce rezerwy pozaj¹drowe i pozyskane za pomoc¹ cewnikowania, jak i pozyska-ne bezporednio z naj¹drzy pozbawiopozyska-ne s¹ niemal zupe³nie plazmy. St¹d odpowiedzi wymaga pytanie, czy potencjalnie wiêksze nara¿enie gamet na oddzia-³ywanie czynników proapoptotycznych i ograniczenie oddzia³ywania czynników antyapoptotycznych nie po-woduje nasilenia procesów destrukcyjnych i nie unie-mo¿liwia wykorzystania plemników do celów biotech-nicznych. Z drugiej strony, jeli nasilenie powy¿szych zjawisk powoduj¹cych zmiany w komórkach podob-ne do obserwowanych podczas apoptozy jest szcze-gólnie du¿e, nale¿a³oby podj¹æ pracê nad ich ograni-czeniem w nasieniu pobranym omawianymi metoda-mi. Procesy apoptotyczne zwi¹zane s¹ z uwolnieniem cytochromu c z b³on mitochondrialnych. Uruchamia to szlak aktywacji kaspaz. Udzia³ w programowanej mierci komórki bior¹ m.in. kaspazy 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9. Wród efektów uruchomienia szlaku apoptotycznego naj³atwiejsze do detekcji s¹: przesuniêcie fosfatydy-loseryny na zewn¹trz plazmolemy, fragmentacja DNA i zmiany potencja³u mitochondrialnego. Wród naj-wa¿niejszych czynników reguluj¹cych nasilenie pro-cesów apoptotycznych s¹ bia³ka grupy Bcl-2 pro- i an-tyapoptotyczne. Bia³ka proapoptotyczne, m.in. Bax, Bad, Bak, indukuj¹ kaspazozale¿ny rozpad struktury DNA. Bia³ka hamuj¹ce powy¿sze procesy, tzw. bia³ka antyapoptotyczne, to m.in. Bcl-2l i Bcl-xl (9, 19). Okrelenie stopnia ekspresji genów bia³ek pro- i anty-apoptotycznych uzupe³nione o ocenê markerów apo-ptozy i aktywnoæ kaspaz daje mo¿liwie komplemen-tarny i miarodajny obraz nasilenia procesów apopto-tycznych i dzia³ania systemu regulacji tych zjawisk.
Kontrowersje budzi twierdzenie, i¿ w transkryp-cyjnie nieaktywnych ejakulowanych plemnikach pod-danych konserwacji, szczególnie kriokonserwacji, za-chodzi klasyczny szlak apoptotyczny. W plemnikach ejakulowanych bowiem wykryto obecnoæ tylko nie-których substancji bior¹cych udzia³ w procesie pro-gramowanej mierci komórki. Z drugiej strony, po-twierdzono, i¿ kriokonserwacja powoduje wiele zmian destrukcyjnych gamet, które s¹ specyficzne dla apop-tozy i jako takie ³atwo mog¹ byæ wykrywane za po-moc¹ stosowanych doæ powszechnie testów in vitro s³u¿¹cych ocenie nasilenia procesu apoptotycznego. Udowodniono, ¿e mro¿enie-rozmra¿anie mêskich ga-met indukuje procesy, takie jak: spadek potencja³u transb³onowego mitochondrium, wzrost przepuszczal-noci b³on i aktywacjê kaspaz (16, 17). Zaproponowa-no, aby zjawiska te obj¹æ nazw¹ zmiany podobne do apoptozy (apoptosis-like changes). Zmiany te przy-pominaj¹ nastêpstwa mechanizmów zachodz¹cych podczas fazy wykonawczej (efektorowej) i wczesnej fazy degradacyjnej (zniszczenia) apoptozy komórek so-matycznych. Obni¿enie potencja³u transb³onowego mi-tochondrium prawdopodobnie powoduje uwalnianie czynników proapoptotycznych w gametach (16, 25).
W plemnikach buhajów potwierdzono obecnoæ czyn-nika proapoptycznego Bax, jednak iloci czynczyn-nika antyapoptotycznego Bcl-2 s¹ ladowe lub ich brak. Podobnie okaza³o siê, ¿e plemniki ejakulowane zawie-raj¹ cytochrom c oraz czynnik indukuj¹cy apoptozê AIF (apoptosis inducing factor), który zaanga¿owany jest w aktywacjê kaspazy 9. Natomiast w ejakulowa-nych plemnikach buhaja nie wykryto kaspazy 8 zaan-ga¿owanej w szlak b³onowy oraz kaspazy 3 niezwy-kle istotnego czynnika fazy efektorowej apoptozy (16, 17). Rozwa¿a siê zatem, i¿ byæ mo¿e szlak zjawisk podobnych do apoptozy, obserwowowany jako wynik kriokonserwacji, jest szlakiem alternatywnym, w któ-rym zaanga¿owane s¹: kaspaza 7 i kaspaza 10 (17). Kluczowy dla powy¿szych rozwa¿añ wydaje siê fakt, ¿e w plemnikach ejakulowanych wykryto prokaspa-zê 9 i aktywn¹ formê kaspazy 9 zaanga¿owane w szlak mitochondrialny apoptozy. Co wiêcej, kriokonser-wacja plemników powoduje dalsze zwiêkszenie puli aktywnej kaspazy 9, co pozwala wysun¹æ hipotezê, i¿ prawdopodobnie kriokonserwacja nasila mitochon-drialny szlak apopotozy (35). Godny podkrelenia jest fakt, ¿e proces mro¿enia-rozmra¿ania przyczynia siê do aktywacji kaspazy 3 i kaspazy 8 w plemnikach cz³o-wieka (21).
Reasumuj¹c nale¿y stwierdziæ, ¿e proces kriokon-serwacji plemników indukuje wiele zjawisk typowych dla apoptozy i wzmaga aktywnoæ czynników proapop-tycznych. Istniej¹ przes³anki nasuwaj¹ce przypuszcze-nie uruchomienia szlaku mitochondrialnego progra-mowanej mierci komórek w wyniku konserwacji na-sienia. Z drugiej strony, dotychczas nie potwierdzono w ejakulowanym nasieniu wielu czynników niezbêd-nych dla prawid³owego przebiegu apoptozy. Przy-chyliæ siê zatem mo¿na do ostro¿nego twierdzenia, ¿e pojedyncze specyficzne przejawy apoptozy wykry-wane doæ ³atwo w plemnikach poddanych kriokon-serwacji za pomoc¹ testów in vitro, traktowaæ nale¿y nie jako dowód uruchomienia pe³nego szlaku progra-mowanej mierci komórki, a raczej jako wskaniki przydatne w ocenie zmian jakoci nasienia w trakcie konserwacji.
Podsumowanie
Od 1979 r., kiedy grupa Kraemer i wsp. (13) do-kona³a skutecznego embriotransferu zarodków kota domowego, poczyniono du¿y postêp w dziedzinie technik wspomaganego rozrodu zwierz¹t kotowatych. W 1988 r. (6) uda³o siê uzyskaæ pierwszy miot uzy-skany po embriotransferze zarodków zap³odnionych pozaustrojowo. Ponadto uda³o siê uzyskaæ mioty 9 ga-tunków dzikich kotowatych po embriotransferze za-rodków zap³odnionych pozaustrojowo, co potwierdza zasadnoæ prac nad technikami wspomaganego rozro-du jako narzêdzia w walce o ratowanie populacji gi-n¹cych gatunków (23). Nadal istnieje wiele niewiado-mych oraz wyzwañ zwi¹zanych z opisan¹ w powy¿-szej pracy dziedzin¹, dlatego zarówno ze wzglêdu na
ochronê gin¹cych gatunków, jak i postêp hodowlany, badania nad rozwojem technik wspomaganego rozro-du zwierz¹t kotowatych powinny byæ istotnym celem nauk weterynaryjnych w XXI wieku.
Pimiennictwo
1.Axner E., Hermansson U., Linde-Forsberg C.: The effect of Equex STM paste and sperm morphology on post-thaw survival of cat epididymal sper-matozoa. Anim. Reprod. Sci. 2004, 84, 179-191.
2.Chatdarong K., Axner E., Manee-In S., Thuwanut P., Linde-Forsberg C.: Pregnancy in the domestic cat after vaginal or transcervical insemination with fresh and frozen semen. Theriogenology 2007, 68, 1326-1333. 3.Filliers M., Rijsselaere T., Bossaert P., Causmaecker V. de, Dewulf J., Pope
C. E., Van Soom A.: Computer-assisted sperm analysis of fresh epididymal cat spermatozoa and the impact of cool storage (4°C) on sper quality. Therio-genology 2008, 70, 1550-1559.
4.Filliers M., Rijsselaere T., Bossaert P., Zambelli D., Anastasi P., Hooge-wijs M., Van Soom A.: In vitro evaluation of fresh sperm quality in tomcats: A comparison of two collection techniques. Theriogenology 2010, 74, 31-39. 5.Freistedt P., Stojkovic P., Wolf E., Stojkovic M.: Energy status of nonmatured and in matured domestic cat oocytes and of different stages of in vitro--produced embryos: enzymatic removal of the zona pellucida increases adenosine triphosphate content and total cell number of blastocysts. Biol. Reprod. 2001, 65, 793-798.
6.Goodrowe K. L., Wall R. J., OBrien S. J., Schmidt P. M., Wildt D. E.: Deve-lopmental competence of domestic cat follicular oocytes. Biol. Reprod. 1988, 39, 355-372.
7.Grunewald S., Reinhardt M., Blumenauer V., Hmeidan A. F., Glander H.-J., Paasch U.: Effects of post-density gradient swim-up on apoptosis signaling in human spermatozoa. Andrologia 2010, 42, 127-131.
8.Hermansson U., Axner E.: Epididymal and ejaculated cat spermatozoa are resistant to cold shock but egg yolk promotes sperm longevity during cold storage at 4°C. Theriogenology 2007, 67, 1239-1248.
9.Jeong Y.-J., Kim M.-K., Song H.-J., Kang E.-J., Ock S.-A., Kumar B. M., Balasubramanian S., Rho G.-J.: Effect of alfa-tocopherol supplementation during boar semen cryopreservation on sperm characteristics and expression of apoptosis related genes. Cryobiology 2009, 58, 181-189.
10.Jewgenow K., Neubauer K., Blottner S., Scon J., Wildt D. E., Pukazhenthi B. S.: Reduced germ cell apoptosis during spermatogenesis in the teratospermic domestic cat. J. Andrology 2009, 30, 460-468.
11.K¹tska-Ksi¹¿kiewicz L., Ryñska B., Kania G., Smor¹g Z., Gajda B., Pieñ-kowski M.: Timing of nuclear maturation of nonstored and stored domestic cat oocytes. Theriogenology 2003, 59, 1567-1574.
12.Karja N. W. K., Otoi T., Murakami M., Fahrudin M., Suzuki T.: In vitro maturation, fertilization and development of domestic cat oocytes recovered from ovaries collected at three stages of the reproductive cycle. Theriogeno-logy 2002, 57, 2289-2298.
13.Kraemer D. C., Flow B. L., Schriver M. D., Kinney G. M., Pennycook J. W.: Embryo transfer in the nonhuman primate, feline and canine. Theriogenology 1979, 11, 51-62.
14.Luvoni G. C.: Current progress on assisted reproduction in dogs and cats: in vitro embryo production. Reprod. Nutr. Dev. 2000, 40, 505-512.
15.Luvoni G. C.: Gamete cryopreservation in the domestic cat. Theriogenology 2006, 66, 101-111.
16.Martin G., Cagnon N., Sabido O., Sion B., Grizard G., Durand P., Levy R.: Kinetics of occurrence of some features of apoptosis during the cryopreser-vation process of bovine spermatozoa. Hum. Rep. 2007, 22, 380-388. 17.Martin G., Sabido O., Durand P., Levy R.: Cryopreservation induces an
apop-totic-like mechanism in bull sperm. Biol. Reprod. 2004, 71, 28-37. 18.Opiela J., K¹tska-Ksi¹¿kiewicz L.: Charakterystyka zdolnoci rozwojowej
oocytów ssaków w aspekcie zap³odnienia i rozwoju zarodkowego. Cz. II. Regulacja dojrza³oci cytoplazmatycznej i genomowej. Biotechnologia 2005, 69, 151-162.
19.Opiela J., K¹tska-Ksi¹¿kiewicz L.: Rola bia³ek rodziny BCL-2 w kontroli apoptozy w pêcherzykach jajnikowych. Biotechnologia 2006, 72, 90-96. 20.Ortega-Ferusola C., Garcia B. M., Gallardo-Bolanos J. M.,
Gonzales--Fernandez, Rodriguez-Martinez H., Tapia J. A., Pena F. J.: Apoptotic markers can be used to forecast the freezability of stallion spermatozoa. Anim. Reprod. Sci. 2009, 114, 393-403.
21.Paasch U., Sharma R. K., Gupta A. K., Grunewlad S., Mascha E. J., Thomas A. J. Jr, Glander H. J., Agarwal A.: Cryopreservation and thawing is associa-ted with varying extent of activation of apoptotic machinery in subsets of ejaculated human spermatozoa. Biol. Reprod. 2004, 71, 1828-1837.
22.Ponglowhapan S., Chatdarong K.: Effects of Equex STM paste on the quality of frozen-thawed epididymal dog spermatozoa. Theriogenology 2008, 69, 666-672.
23.Pope C. E.: Embryo technology in conservation efforts for endangered felids. Theriogenology 2000, 53, 163-174.
24.Pope C. E., McRae M. A., Plair B. L., Keller G. L., Dresser B. L.: In vitro and in vivo development of embryos produced by in vitro maturation and in vitro fertilization of cat oocytes. J. Repord. Fert. 1997, 51, 69-82.
25.Ravagnan L., Roumier T., Kroemer G.: Mitochondria, the killer organelles and their weapons. J. Cell Physiol. 2002, 192, 131-137.
26.Siemieniuch M., Dubiel A.: Preservation of tomcat (Felis catus) semen in variable temperatures. Anim. Reprod. Sci. 2007, 99, 135-144.
27.Thuwanut P., Chatdarong K., Techakumphu M., Axner E.: The effect of antioxidants on motility, viability, acrosome integrity and DNA integrity of frozen-thawd epididymal cat spermatozoa. Theriogenology 2008, 70, 233--240.
28.Tsutsui T.: Artificial insemination in the domestic cats (Felis catus). Therio-genology 2006, 66, 122-125.
29.Vilaverde A. I. S. B., Melo C. M., Martin I., Ferreira T. H., Papa F. O., Taconeli C. A., Lopes M. D.: Comparison of efficiency between two artificial insemination methods using frozen-thawed semen in domestic cat (Felis catus) Anim. Repord. Sci. 2009, 114, 434-442.
30.Wood T. C., Wildt D. E.: Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro. J. Reprod. Fertil. 1997, 110, 355-360.
31.Zambelli D.: Feline semen collection, freezing and insemination. Proc. 7th EVSSAR Congress, Louvain Le Neueve, 14-15 May 2010, s. 26-28.
32.Zambelli D., Cunto M., Prati F., Merlo B.: Effects of ketamine or medeto-midine administration on quality of electroejaculated sperm and on sperm flow in the domestic cat. Therigenology 2007, 68, 796-803.
33.Zambelli D., Iacono E., Raccagni R., Merlo B.: Quality and fertilizing ability of elektroejaculated cat spermatozoa frozen with or without Equex STM Paste. Theriogenology 2010, 74, 886-892.
34.Zambelli D., Prati F., Cunto M., Iacono E., Merlo B.: Quality and in vitro fertilizing ability of cryopreserved cat spermatozoa obtained by urethral catheterization after medetomidine administration. Theriogenology 2008, 69, 485-490.
35.Zou H., Li Y., Liu X., Wang X.: An APAF-1 cytochrome c multimeric com-plex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. J. Biol. Chem. 1999, 274, 11549-11556.
Adres autora: dr hab. Wojciech Ni¿añski prof. nadzw., pl. Grunwaldzki 49, 50-366 Wroc³aw; e-mail: wojciech.nizanski@up.wroc.pl
