Artyku³ przegl¹dowy Review
Rozwój biologii molekularnej i bioinformatyki stwo-rzy³ nowe mo¿liwoci poznania mechanizmów rz¹-dz¹cych procesem ekspresji informacji genetycznej. W ostatnich latach nast¹pi³ bardzo burzliwy rozwój badañ molekularnych u ró¿nych gatunków zwierz¹t. Dziêki takim badaniom uda³o siê poznaæ, miêdzy in-nymi, genom psa i ustaliæ, ¿e zawiera on ponad 19 tysiêcy genów (16, 18), podczas gdy ludzki genom za-wiera oko³o 25 tysiêcy genów. Ka¿da komórka wyko-rzystuje tylko niewielk¹ czêæ tych genów, a sekwen-cje koduj¹ce bia³ka stanowi¹ jedynie niewielk¹ czêæ materia³u genetycznego. O tym, który z genów wy-tworzy swoje bia³ko, decyduje proces transkrypcji, czyli prze³o¿enie informacji z DNA na matrycowy RNA (mRNA messenger RNA), w wyniku czego powsta³a cz¹steczka mRNA jest komplementarna do jednej nici DNA. Laureaci Nagrody Nobla z 1962 r., Francis Crick i James Watson, taki przep³yw informa-cji genetycznej od DNA przez mRNA do bia³ka na-zwali podstawowym dogmatem biologii molekularnej. W artykule omówiono zjawisko interferencji RNA w aspekcie teorii i praktyki. I choæ wiêkszoæ badañ zmierza do wykorzystania zjawiska interferencji RNA w terapii chorób u ludzi, to ze wyglêdu na podobieñ-stwo genomów ssaków, np. genomu psa i cz³owieka 80%, genomu myszy i cz³owieka 85-90% (18), ba-dania te mog¹ przybli¿yæ pod³o¿e genetyczne wielu chorób wystêpuj¹cych tak¿e u zwierz¹t, takich jak: nowotwory, alergie, infekcje wirusowe.
Mechanizm interferencji RNA
Pocz¹tki odkrycia zjawiska interferencji RNA (RNAi RNA interference) siêgaj¹ 1990 r., kiedy to grupa badaczy z Uniwersytetu w Arizonie przeprowa-dzaj¹c eksperyment, maj¹cy na celu wyhodowanie odmiany petunii ogrodowej (Petunia hybryda) o kwia-tach ciemniejszych od odmiany pospolitej poprzez wprowadzenie do komórek rolinnych dodatkowej kopii genu koduj¹cego enzym odpowiedzialny za syn-tezê fioletowego barwnika, otrzymali petunie o kwia-tach barwy janiejszej od pospolitej (24). Tak wiêc, w niezrozumia³y (w tamtym czasie) sposób dosz³o do zahamowania syntezy barwnika. Postanowiono wiêc zmierzyæ w komórce petunii poziom mRNA genu, koduj¹cego pigment i okaza³o siê, ¿e by³ on bardzo niski. Zaobserwowane wówczas zjawisko wyciszania genu okrelono kosupresj¹ (24), jednak sam mecha-nizm tego zjawiska w tym czasie pozosta³ zagadk¹. Dopiero na pocz¹tku 1998 r. na ³amach czasopisma Nature (11) Andrew Z. Fire i Craig C. Mello opisali molekularny mechanizm tego efektu, nazwany inter-ferencj¹ RNA (RNAi), za co uhonorowano ich w 2006 r. Nagrod¹ Nobla w zakresie biologii i medy-cyny. W wyjanieniu zas³ug obu nagrodzonych Komi-sja Noblowska pokreli³a, ¿e dziêki ich badaniom i odkryciom poznano fundamentalny mechanizm kon-troli przep³ywu informacji genetycznej. Amerykañscy noblici odkrycia zjawiska interferencji dokonali pra-cuj¹c nad regulacj¹ ekspresji genów u nicienia
Caenor-Teoretyczne i praktyczne aspekty
zjawiska interferencji RNA
BEATA HUKOWSKA-SZEMATOWICZ, WIES£AW DEPTU£A
Katedra Mikrobiologii i Immunologii Wydzia³u Nauk Przyrodniczych Uniwersytetu Szczeciñskiego, ul. Felczaka 3c, 71-412 Szczecin
Hukowska-Szematowicz B., Deptu³a W.
Theoretical and practical aspects of the RNA interference phenomenon
Summary
The discovery of the RNA interference phenomenon proved to be a significant breakthrough in determining the mechanism in which the flow of genetic information is controlled. Apart from dsRNA and siRNA, also microRNA molecules are involved in the process. Current data prove that the phenomenon of RNA inter-ference will open new perspectives in the therapy of numerous diseases, including metabolic, cancer, neurodegenerative and viral ones.
Keywords: RNA interference phenomenon, double-stranded RNA (dsRNA), microRNA (miRNA), small interfering RNA (siRNA)
habditis elegant (11). Zaobserwowali oni, ¿e wprowa-dzenie dwuniciowego RNA (dsRNA double-stran-ded RNA) o d³ugoci 20 nukleotydów do komórek nicienia wycisza ekspresjê genu, którego mRNA za-wiera sekwencjê komplementarn¹ do wprowadzone-go dsRNA, co w konsekwencji wywo³uje taki sam efekt, jak wprowadzenie do komórek rolinnych do-datkowych kopii RNA, powoduj¹c wyciszenie genu. Okaza³o siê, ¿e u pod³o¿a tych obu zjawisk le¿y ten sam mechanizm, a dsRNA jest w stanie wyciszyæ geny (6, 11). St¹d interferencjê RNA (RNAi) zdefiniowano jako wyciszanie, wy³¹czenie ekspresji genu za pomo-c¹ dwuniciowego RNA (6) i okrelono, ¿e jest to pro-ces, w którym dochodzi do degradacji w komórkach organizmów (zwierz¹t, rolin) wybranych cz¹steczek RNA (17). W przypadku ssaków efekt interferencji nie rozprzestrzenia siê na ca³y organizm, a pozwala jedy-nie na wyciszejedy-nie okrelonego genu w hodowli tkan-kowej komórek ssaczych, za u rolin i nicieni obej-muje ca³y organizm i mo¿e byæ przekazywany potom-stwu.
Omawiaj¹c procesy sk³adaj¹ce siê na mechanizm interferencji RNA nale¿y stwierdziæ, ¿e dzieli siê on na dwa etapy: inicjacyjny oraz efektorowy (6, 13, 33). W inicjacyjnym, przebiegaj¹cym w cytoplazmie cz¹s-teczka dsRNA zostaje pociêta przez enzym o nazwie Dicer na fragmenty o d³ugoci 21-23 nukleotydów, nazwane ma³ymi interferuj¹cymi RNA (siRNA small interfering RNA). W etapie drugim efektorowym, przebiegaj¹cym w cytoplazmie lub j¹drze siRNA, przy-³¹czaj¹ siê do kompleksu bia³ek RISC (RNA-Indu-ced Silencing Complex) i ulegaj¹ rozpleceniu do jed-noniciowych siRNA, gdy¿ jedna niæ jest eliminowa-na, a druga niæ siRNA pozostaje w kompleksie RISC i s³u¿y jako sonda rozpoznaj¹ca komplementarne cz¹s-teczki RNA (6, 13, 33). Je¿eli aktywny kompleks RISC, z³o¿ony z jednoniciowego siRNA i bia³ka po-zostaje w cytoplazmie, to wi¹¿e siê na zasadzie regio-nów komplementarnych z mRNA i je¿eli ta komple-mentarnoæ jest pe³na, to dochodzi do ciêcia tego kom-pleksu w po³owie utworzonego dukom-pleksu mRNA/siRNA (13). W efekcie ca³a pula mRNA zostaje eliminowa-na, jako ¿e stan taki uniemo¿liwia dalszy przep³yw informacji genetycznej z mRNA do bia³ka i proces ten nazwano potranskrypcyjnym wyciszaniem genów (PTGS Post-Transcriptional Gene Silencing) (6, 13). Je¿eli jednak mRNA jest tylko czêciowo komplemen-tarny do nici siRNA, zwi¹zanej z kompleksem RISC, wtedy nie ulega on zniszczeniu, ale pozostaje zwi¹za-ny z kompleksem RISC, co stanowi swojego rodzaju blokadê dla mRNA, które nie mo¿e s³u¿yæ jako ma-tryca do syntezy bia³ka (6, 13). W takiej sytuacji do-chodzi do wyciszenia genów na poziomie translacji. Trzeci z kolei mechanizm z udzia³em kompleksu RISC mówi, ¿e mo¿e siê on przedostaæ do j¹dra komór-kowego i oddzia³ywaæ z komplementarnymi do nici siRNA fragmentami genomu, w wyniku czego docho-dzi do zale¿nej od RNA metylacji DNA. Efektem tego
jest przekszta³cenie euchromatyny w heterochromaty-nê i zablokowanie aktywnoci genu, co nazywano transkrypcyjnym wyciszaniem genów (TGS Trans-criptional Gene Silencing) (6, 13).
Cz¹steczki RNA uczestnicz¹ce w interferencji Pocz¹tkowo wszystkie zidentyfikowane krótkie cz¹steczki RNA odpowiedzialne za regulacjê procesu ekspresji informacji genetycznej okrelano mianem krótkich interferuj¹cych RNA (siRNA small inter-fering RNA) (31). Jednak szczegó³owe analizy wy-kaza³y, ¿e siRNA ró¿ni¹ siê miêdzy sob¹ biogenez¹ i sposobem dzia³ania i st¹d wród siRNA wyodrêb-niono: mikroRNA (miRNA) ma³e fragmenty RNA kodowane w genomie, pe³ni¹ce funkcje regulatorowe, wystêpuj¹ce u rolin i zwierz¹t; rasiRNA (rasiRNA repeat-associated small interfering RNA) krótkie interferuj¹ce RNA, zwi¹zane z sekwencjami powtó-rzeniowymi, wystêpuj¹ce tylko u rolin oraz tasiRNA (tasiRNA transacting small interfering RNA) krót-kie interferuj¹ce RNA dzia³aj¹ce in trans oraz egzo-genne siRNA (31).
MikroRNA stanowi¹ najliczniejsz¹ grupê krótkich regulatorowych RNA i s¹ to cz¹steczki okrelane jako elementy do zadañ specjalnych (2, 5, 6, 20). S¹ to krótkie jednoniciowe cz¹steczki RNA o d³ugoci 21-23 nukleotydów, wystêpuj¹ce u zwierz¹t krêgowych i bezkrêgowych oraz rolin, jednak ich proces dojrze-wania jest ró¿ny i zale¿y od typu komórek (5). Rola miRNA polega na obni¿eniu ekspresji genów na eta-pie translacji (20). U ludzi wyró¿niæ mo¿na trzy etapy tworzenia miRNA, gdzie w ostatnim etapie, podobnie jak w przypadku siRNA, udzia³ bierze bia³ko Dicer, a miRNA jest tak¿e w³¹czany do kompleksu RISC i hamuje translacjê lub degraduje docelowe mRNA. Wykazano, ¿e oko³o 2% znanych genów ludzkich ko-duje miRNA (2). U rolin miRNA bierze udzia³ w re-gulacji podstawowych procesów ¿yciowych, jak roz-wój kwiatów, nadawanie liciom odpowiedniego kszta³tu (34). U zwierz¹t miRNA bierze udzia³ w wie-lu wa¿nych procesach (tab. 1) (2). Pierwsz¹ i najlepiej poznan¹ cz¹steczk¹ miRNA by³a ta, któr¹ poznano u nicienia (Caenorhabditis elegant) i nazwano lin-4 miRNA (2, 5). Nastêpnie cz¹steczki te poznano tak¿e u muszki owocowej (Drosophila melanogaster), ryby (Danio rerio) oraz myszy (Mus musculus) (2, 5). U muszki owocowej miRNA stymuluje proliferacjê apoptozy poprzez blokowanie ekspresji proapopto-tycznego genu hid (2). Podwy¿szona ekspresja miRNA u muszki owocowej prowadzi do przerostu skrzyde³ i oczu, natomiast brak ekspresji tej cz¹steczki powo-duje powstanie osobników o zredukowanej liczbie ko-mórek (2).
Udowodniony we wczeniejszych badaniach udzia³ cz¹steczek miRNA w wielu wa¿nych procesach ¿y-ciowych sta³ siê przyczyn¹ do rozpoczêcia poszu-kiwania powi¹zania miRNA z patogenez¹ chorób nowotworowych (20). Badania wykaza³y, ¿e miRNA
maj¹ zdolnoæ regulowania ekspresji licznych onko-genów i onko-genów supresorowych, ale, co bardzo wa¿ne, same tak¿e mog¹ dzia³aæ jako onkogeny i supresory (20).
Na temat kolejnych klas cz¹steczek uczestnicz¹cych w interferencji RNA rasiRNA, tasiRNA oraz egzo-gennych siRNA wiemy niewiele. Opisano je u roli-ny Arabidopsis thaliana (12, 25, 30, 31). Cz¹steczki rasiRNA bior¹ udzia³ w obronie przeciwwirusowej u rolin, prowadz¹c do wyciszenia genów wirusowych (12), za tasiRNA u rolin funkcjonuj¹ podobnie jak miRNA u zwierz¹t, pe³ni¹c funkcjê negatywnych regulatorów ekspresji genów, w szczególnoci tych, których produkty uczestnicz¹ w ró¿nych procesach rozwojowych oraz w sytuacjach stresu u rolin (31).
Terapeutyczne aspekty zjawiska interferencji RNA Ze zjawiskiem interferencji RNA od momentu jego odkrycia wi¹zano bardzo du¿e nadzieje, poniewa¿ terapia oparta na tym zjawisku wykorzystywa³aby naturalne procesy komórkowe (6). Wykazano, ¿e zja-wisko interferencji RNA pozwala broniæ siê przed infekcjami wirusowymi u ludzi, zwierz¹t i rolin (10, 17). Za silnych induktorów tego zjawiska uwa¿a siê wirusy RNA np.: wirusa zapalenia w¹troby typu C, wirusa zapalenia w¹troby typu B, retrowirusy oraz wirusy DNA np.: wirus cytomegalii, wirus Epstein--Barr (10). Jednak, jak siê okazuje, zjawisko interfe-rencji RNA w zainfekowanej komórce ssaka nie daje gwarancji jej obrony przed infekcj¹ wirusow¹. Dzieje siê tak, poniewa¿ wirusy w toku ewolucji wykszta³ci-³y w sobie liczne mechanizmy chroni¹ce wirusowe RNA przed degradacj¹. Dowiedziono, ¿e wirusy mog¹,
z jednej strony, zapanowaæ nad procesami komórko-wymi produkuj¹c w³asne miRNA, z drugiej strony w genomie gospodarza mo¿e byæ kodowane miRNA, które hamuje replikacjê wirusa (10). Opisano kilka przypadków obrazuj¹cych takie strategie dzia³ania wirusa z udzia³em miRNA, np. miRNA ludzkiego her-peswirusa KSHV (Kaposis sarkoma-associated virus wirus miêsaka Kaposiego) odgrywa istotn¹ rolê w powstaniu i utrzymaniu utajonej infekcji oraz in-dukuje ontogenezê; z kolei wirus HCV (hepatitis C virus wirus zapalenia w¹troby typu C) do swojej replikacji wymaga tkankowo-specyficznego miRNA (mir-122), który wystêpuje w komórkach w¹troby (10). Ostatni z wymienionych przyk³adów ma ogromne zna-czenie dla lepszego poznania molekularnych uwarun-kowañ procesu replikacji i opracowania skutecznych sposobów leczenia HCV i HBV. W przypadku wirusa HBV (hepatitis B virus wirus zapalenia w¹troby typu B) oprócz hamowania inicjacji replikacji tego wirusa w zaka¿onych liniach komórkowych (22), uda³o siê ju¿ opracowaæ (35) metody hamowania jego replika-cji w komórkach ssaczych przy zastosowaniu rekom-binowanych siRNA.
Jak wykaza³y najnowsze badania, mechanizmy zwi¹zane z wyciszaniem RNA maj¹ udzia³ w pato-fizjologii zaka¿eñ wirusowych wywo³ywanych przez wirusy z rodziny Retroviridae, co obrazuj¹ wirus HIV-1 (human immunodeficiency virus type 1 wirus ze-spo³u nabytego braku odpornoci) oraz wirus PFV-1 (primate foamy virus type 1 spumawirus naczelnych typu 1) (2, 29). Wykazano, ¿e miRNA hamuje repli-kacjê wirusa HIV-1 w obwodowych jednoj¹drzastych komórkach krwi ludzkiej pochodz¹cej od zainfekowa-nych wirusem HIV-1 dawców oraz w przetrwale za-ka¿onych liniach komórkowych. Z drugiej strony, do-wiedziono, i¿ wirus HIV-1 ma zdolnoæ hamowania ekspresji miR-17/92, a supresja taka jest niezbêdna do jego efektywnej replikacji (29). W przypadku wirusa PFV-1 (2) wykazano, ¿e ludzkie komórkowe miRNA (miRNA-32) efektywnie ogranicza replikacjê tego re-trowirusa w zaka¿onych nim liniach komórkowych HeLa. Z drugiej jednak strony, wirus ten naby³ zdol-noæ blokowania wyciszania genów na drodze inter-ferencji RNA, co realizuje poprzez kodowanie bia³ka TAS, które jest supresorem miRNA w komórkach ssa-ków. Rolê dwuniciowych cz¹steczek RNA (dsRNA) w indukcji odpornoci przeciwwirusowej opisano u krewetek (Litopenaeus vannamei) (26). Bezkrêgow-com tym podano cztery ró¿ne typy sekwencji dsRNA pochodz¹ce od kaczki, wini, ryby i bakterii, a nastêp-nie zaka¿ono je wirusem z rodziny Nimaviridae WSSV (White spot syndrome virus) i wirusem z rodziny Di-cistroviridae TSV (Taura syndrome virus). Wyniki badañ wykaza³y, ¿e ka¿da u¿yta w dowiadczeniu sekwencja dsRNA skutecznie indukowa³a u krewetek ochronê przeciwko wirusom WSSW i TSV (26). Ko-lejny przyk³ad zastosowania zjawiska interferencji RNA w zapobieganiu chorobom wirusowym zapre-Tab. 1. Funkcja mikroRNA (miRNA) in vivo u cz³owieka
i zwierz¹t (2) m zi n a g r O miRNA FunkcjamiRNA k e i w o ³ z C e n l e z c a n e n n i i miRNA-32 obronaprzeciwwriusowa ñ e i c i N (Caenorhabdiits t n a g e l e ) , A N R i m 4 -n il , A N R i m 7 -t e l , 4 8 -A N R i m , 8 4 -A N R i m 4 8 -A N R i m , 1 4 2 -A N R i m a i n p k e r ó m o k e i n a w o c i n ¿ ó r 3 7 2 -A N R i m , A N R i m 6 -y s l rcóia¿³naicowanielewejczêci a k z s u M a w o c o w o (Drosophlia r e t s a g o n a l e m ) A N R i m m a t n a b porrgolafineziramcuja,pkoromgóraremkowana i k r ó m o k æ r e i m 4 1 -A N R i m pkoromgórarkmiowanamieræ , 6 -A N R i m , 2 -A N R i m 3 1 -A N R i m , 1 1 -A N R i m embirogeneza o i n a D y n a w o g ê r p (Danioreiro) miRNA-430 neurogeneza a w o m o d z s y M (Musmusculus) 1 -A N R i m angiogeneza 1 8 1 -A N R i m hematopoeza 5 7 3 -A N R i m egzocytoza
zentowa³ w 2005 r. zespó³ Bai (7). W swoich bada-niach wykazali, ¿e siRNA hamuj¹ in vitro replikacjê mysiego wirusa zachodniego Nilu WNV (West Nile Virus) (7). Jak uwa¿aj¹ autorzy, wyniki tych badañ s¹ bardzo obiecuj¹ce i rokuj¹ nowe strategie w walce z wirusem Zachodniego Nilu. Miêdzy innymi z tego tak¿e powodu g³ównym celem trwaj¹cych aktualnie badañ jest opracowanie jak najbardziej efektywnych sposobów podawania cz¹steczek dsRNA chorym pa-cjentom. W przypadku chorób wirusowych, dsRNA wprowadzone we wczesnym etapie infekcji mog³yby skutecznie redukowaæ iloæ cz¹steczek wirusa w za-infekowanym organizmie do momentu, w którym od-powied immunologiczna gospodarza mog³aby sku-tecznie niszczyæ wirusa i zapobiegaæ rozwojowi cho-roby (1, 7). Równie¿ metodê tê jako now¹ strategiê w walce z wirusem grypy typu A (podtyp H5N1, H7N7 i H9N2) przedstawi³ zespó³ Epstein (28). Wykazano, ¿e ma³e interferuj¹ce cz¹steczki RNA s¹ w stanie sku-tecznie obni¿aæ poziom wirusa grypy w p³ucach zaka-¿onych myszy, a ponadto cz¹steczki te s¹ zdolne do skutecznej ochrony myszy przed wysoce patogennym wirusem ptasiej grypy typu A (podtyp H5 i H7).
Prowadzone badania nad zastosowaniem interferen-cji RNA wskazuj¹, ¿e w przysz³oci interferencja RNA mo¿e staæ siê obiecuj¹cym narzêdziem tak¿e w kon-troli wielu infekcji wirusowych u zwierz¹t domowych i hodowlanych o bardzo du¿ym znaczeniu ekonomicz-nym. Wirusowo specyficznego siRNA u¿yto do hamo-wania replikacji takich wirusów, jak: ptasiego herpes-wirusa AHV-1 (Anatid herpes virus-1) (21), kociego wirusa niedoboru immunologicznego FIV (Feline im-munodeficiency virus) (4), wiñskiego wirusa powo-duj¹cego zespó³ rozrodczo-oddechowy PRRS (Porci-ne reproductive and respiratory syndrome) (14), wiru-sa biegunki byd³a i choroby b³on luzowych BVDV (Bovine viral diarrhea virus) (8) oraz wirusa prysz-czycy FMDV (Foot-and-mouth disease virus) (15, 32). Ze wzglêdu na fakt, ¿e nowotwory stanowi¹ bardzo istotny problem nie tylko u ludzi, ale i u licznych zwie-rz¹t, takich jak: pies, kot, koñ, mysz, chomik, szczur, winka morska, zastosowanie zjawiska interferencji RNA w terapii tych chorób otwiera nowe mo¿liwoci zapobiegania im poprzez wykorzystanie siRNA do wyciszania ekspresji genów nowotworowych oraz za-stosowanie miRNA w terapii chorób nowotworowych (19, 20, 27). Wykazano, ¿e inhibicja miRNA prowa-dzi³a in vitro do obni¿enia proliferacji komórek no-wotworowych w przypadku raka prostaty (w liniach komórkowych PC-3) oraz raka szyjki macicy (w li-niach komórkowych HeLa) (20). Na podstawie pozio-mu ekspresji miRNA mo¿na diagnozowaæ inne liczne choroby nowotworowe. W przypadku glejaków obser-wowano wzrost ekspresji miRNA-21, przy nowotwo-rach p³uc wzrost ekspresji 155 i miRNA--17-92, rak jelita grubego powodowa³ obni¿enie ekspresji miRNA-143 i miRNA-145, za w przy-padku raka piersi stwierdzono obni¿enie ekspresji
miRNA125-1, miRNA125-2, miRNA-145, a wzrost miRNA-21. W chorobach nowotworowych, takich jak ch³oniak Burkitta i ch³oniak Hodgkina rejestrowano wzrost ekspresji miRNA-155 (20). Dodaæ nale¿y tak¿e, ¿e dziêki odkryciu zjawiska interferencji RNA u myszy uda³o siê wyciszyæ gen odpowiedzialny za podwy¿szony poziom cholesterolu, a rokowania s¹ na tyle optymistyczne, ¿e, byæ mo¿e, w przysz³oci uda siê wprowadziæ je u ludzi, zapobiegaj¹c w ten sposób chorobom serca. Ponadto trwaj¹ intensywne badania nad zastosowaniem zjawiska interferencji RNA w te-rapii chorób uk³adu oddechowego oraz chorobach im-munologicznych u ludzi i zwierz¹t (9, 33).
Wyciszanie genów za pomoc¹ zjawiska interferen-cji RNA mo¿e znaleæ równie¿ zastosowanie w kse-notransplantologii (23). W zwi¹zku z ustawicznym brakiem narz¹dów do przeszczepów alogenicznych prowadzi siê próby wykorzystania narz¹dów wini domowej, która mo¿e byæ idealnym ród³em obcopo-chodnych narz¹dów. Jednak istotn¹ przeszkodê w tej kwestii stanowi¹ endogenne patogeny wirusowe by-tuj¹ce w organizmie wini. Do takich wirusów nale¿¹, miêdzy innymi, retrowirusy wiñ PERV (Porcine en-dogenous retrovirus), które ulegaj¹ ekspresji i wyka-zuj¹ zdolnoæ do infekowania komórek cz³owieka w warunkach in vitro, wirus PLHV (Porcine lympho-tropic herpesvirus), wirus PCMV (Porcine cytomega-lovirus) oraz wirus PCV (Porcine circovirus) (23). St¹d te¿ w ostatnim czasie oprócz prób selekcji osobników nie bêd¹cych nosicielami PERV, siêgniêto do rozwi¹-zania tego problemu przy zastosowaniu zjawiska in-terferencji RNA. W wyniku badañ (23) otrzymano siRNA, które eliminowa³y cz¹steczki wirusowe PERV w zaka¿onej nimi hodowli komórkowej, a rezultaty badañ potwierdzaj¹ skutecznoæ zastosowania inter-ferencji RNA w rozwi¹zywaniu problemów zaka¿eñ wirusowych w ksenotransplantacji.
Ponadto trwaj¹ badania nad ewentualnym wyko-rzystaniem siRNA do produkcji farmaceutyków do le-czenia starczego zwyrodnienia plamki, grypy, astmy, przewlek³ych infekcji p³uc, idiomatycznego zw³ók-nienienia p³uc, syndromu AIDS, choroby Parkinsona, choroby Huntingtona, mukowiscydozy oraz chorób skóry (3).
Podsumowanie
Ju¿ od momentu odkrycia zjawiska interferencji RNA wi¹zano z nim du¿e nadzieje. Dzi ju¿ wiado-mo, ¿e ten sposób wyciszania genów ma ogromne znaczenie, a dok³adne poznanie jego mechanizmów w przysz³oci mo¿e pozwoliæ na kontrolowanie roz-woju infekcji lub modulowanie ich przebiegu g³ów-nie w zaka¿eniach wirusowych u ludzi i zwierz¹t. Po-nadto zjawisko to bêdzie mo¿na wykorzystaæ w tera-pii chorób metabolicznych, nowotworowych i neuro-degeneracyjnych. Cz¹steczki dsRNA, siRNA i miRNA s¹ obecnie uwa¿ane za materia³ o ogromnym poten-cjale aplikacyjnym, a, jak wypowiadaj¹ siê badacze,
dowiadczenia zwi¹zane z wykorzystaniem ich w prak-tyce zmierzaj¹ we w³aciwym kierunku.
Pimiennictwo
1.Aigner A.: Delivery systems for the direct application of siRNAs to induce RNA interference (RNAi) in vivo. J. Biomed Biotechnol. 2006, 71659, 1-15. 2.Alvarez-Garcia I., Miska E. A.: MicroRNA functions in animal development
and human disease. Development 2005, 132, 4653-4662.
3.Appasahi K.: RNA Interference Technology: From basic science to drug development. Cambridge University Press, Cambridge 2005.
4.Baba K., Mizukoshi F., Goto-Koshino Y., Setoguchi-Mukai A., Fujino Y., Ohno K., Tsujimoto H.: Application of RNA interference for inhibiting the replication of feline immunodeficiency virus in chronically infected cell lines. Vet. Microbiol. 2007, 120, 207-216.
5.Bartel D. P.: MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism and function. Cell 2004, 116, 281-297.
6.B¹k D.: RNAi interferenacja RNA skuteczny sposób na ciszê. Post. Bioch. 2003, 49, 136-146.
7.Bai F., Wang T., Pal U., Bao F., Gould L. H., Fikrig E.: Use of RNA inter-ference to prevent lethal murine West Nile Virus infection. J. Infect. Dis. 2005, 191, 1148-1154.
8.Daisuke Y., Kentaro K., Yukinobu T., Hiroomi A.: The double-stranded RNA-induced apoptosis pathway is involved in the cytopathogenicity of cythopathogenic Bovine viral diarrhea virus. J. Gen. Virol. 2006, 87, 2961--2970.
9.Dreyfus D. H., Ghoda L.: A review of recent patents concerning therapy of respiratory diseases using gene silencing by RNAi (RISC) and EGS (RNAse P). Recent Pat. Inflammation Allergy Drug Discovery 2007, 1, 49-55. 10.Figlarowicz M., Tyczewska A., Figlarowicz M.: Wp³yw ma³ych
regulatoro-wych RNA na przebieg zaka¿eñ wirusoregulatoro-wych nowe strategie leczenia zaka-¿eñ HCV. Przegl. Epidemiol. 2006, 60, 693-700.
11.Fire A., Xu S., Montgomery M. K., Kostas S. A., Driver S. E., Mello C. C.: Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenor-habditis elegans. Nature 1998, 391, 806-811.
12.Hamilton A., Voinnet O., Chappell L., Baulcombe D.: Two classes of short interfering RNA in RNA silencing. EMBO J. 2002, 21, 4671-4679. 13.Hannon G. J.: RNA interference. Nature 2002, 11, 244-251.
14.He Y. X., Hua R. H., Zhou Y. J., Qiu H. J., Tong G. Z.: Interference of porcine reproductive and respiratory syndrome virus replication on MARC-145 cells using DNA-based short interfering RNAs. Antiviral Res. 2007, 74, 83-91. 15.Kahana R., Kuznetzova L., Rogel A., Shemesh M., Hai D., Yadin H., Stram Y.:
Inhibition of foot-and mouth disease virus replication by small interfering RNA. J. Gen. Virol. 2004, 85, 3213-3217.
16.Kirkness E. F., Bafna V., Halpern A. L.: The dog Genome: Survey Sequen-cing and comparative analysis. Science 2003, 301, 1898-1903.
17.Lehmann P.: Wyciszanie RNA; naturalny sposób obrony rolin przeciw in-fekcji wirusowej. Post. Biol. Komórki 2003, 30, 75-86.
18.Lindbland-Toh K., Wade C. M., Mikkelsen T. S.: Genome sequence, compa-rative analysis and haplotype structure of the domestic dog. Nature 2005, 438, 803-819.
19.Majorek M., Guzenda P., Lamparska-Przybysz M., Wieczorek M.: Krótkie interferuj¹ce RNA w onkologii. Wspó³czesna Onkologia 2006, 10, 367-371. 20.Majorek K., Krzy¿osiak W. J.: Rola mikroRNA w patogenezie, diagnostyce
i terapii nowotworów. Wspó³czesna Onkologia 2006, 10, 359-366. 21.Mallanna S. K., Rasool T. J., Sahay B., Aleyas A. G., Ram H., Mondal B.,
Nautiyal B., Premraj A., Sreekumar E., Yadav M. P.: Inhibitions of Anatid Herpes Virus-1 replication by small interfering RNAs in cell culture system. Virus Res. 2006, 115, 192-197.
22.McCaffrey A. P., Nakai H., Pandey K., Huang Z., Salazar F. H., Xu H., Wieland S. F., Marion P. L., Kay M. A.: Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference. Nat. Biotechnol. 2003, 21, 639-644.
23.Miyagawa S., Nakatsu S., Nakagawa T., Kondo A., Matsunami K., Haza-ma K., Hamada J., Tomonaga K., Miyazawa T., Shirakura R.: Prevention of PERV infections in pig to human xenotransplantation by the RNA inter-ference silences gene. J. Biochem. 2005, 137, 503-508.
24.Napoli C., Lemieux C., Jorgensen R.: Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-supression of homologous genes in trans. Plant Cell 1990, 2, 279-289.
25.Peragine A., Yoshikawa M., Wu G., Albrecht H. W., Poethig R. S.: SGS3 and SGS2/SDE1/RDR6 are required for juvenile development and the produc-tion of trans-acting siRNAs in Arabidopsis. Genes Dev. 2004, 18, 2368-2379. 26.Robalino J., Browdy C. L., Priori S., Metz A., Parnell P., Gross P., Warr G.: Induction of antiviral immunity by double-stranded RNA in a marine inver-tebrate. J. Virol. 2004, 78, 10442-10448.
27.Takeshita F., Ochiya T.: Therapeutic potential of RNA interference against cancer. Cancer Sci. 2006, 97, 689-696.
28.Tompkins S. M., Lo Ch. Y., Tumpey T. M., Epstein L.: Protection against lethal influenza virus challenge by RNA interference in vivo. PNAS 2004, 101, 8682-8686.
29.Triboulet R., Mari B., Lin Y. L.: Suppression of microRNA-Silencing path-way by HIV-1 during virus replication. Science 2007, 315, 1579-1582. 30.Vasquez F., Vaucheret H., Rajagopalan R., Lepers C., Gasciolli V.,
Mal-lory A., Hilbert J. L., Bartel D. P., Crete P.: Endogenous trans-acting siRNAs regulate the accumulation of Arabidopsis miRNAs. Mol. Cell. 2004, 16, 69-79.
31.Warkocki Z., Figlarowicz M.: Krótkie interferencyjne RNA dzia³aj¹ce in trans. Post. Bioch. 2006, 52, 253-259.
32.Weizao Ch., Weiyao Y., Du Q., Liang F., Mingqiu L., Zheng N., Zutian S., Zhaoxin Z.: RNA interference targeting VP1 inhibit Foot-and Mouth disease virus replication in BHK-21 cells and suckling mice. J. Virol. 2004, 78, 6900--6907.
33.Weso³owska A.: Wykorzystanie ma³ych interferuj¹cych RNA do hamowania ekspresji genów w komórkach ssaków. Post. Biol. Komórki 2004, 31, 35-46. 34.Winiewska A., Filipecki M.: Wyciszanie genów jako strategia badania ich
funkcji w rolinach. Post. Biol. Komórki 2003, 30, 339-358.
35.Wu K., Gong Y., Zhang X., Zhang Y., Mu Y., Liu F., Song D., Zhu Y., Wu J.: Inhibition of hepatitis B virus replication by recombinant small interfering RNAs. Acta Virol. 2005, 49, 235-241.
Adres autora: dr Beata Hukowska-Szematowicz, ul. Z. Felczaka 3c, 71-412 Szczecin; e-mail: beatahukowska@poczta.onet.pl
