wyklad 2 analizy wielkoskalowe 2013

(1)

(2)

Analizy wielkoskalowe wykorzystujące

mikromacierze

(3)

3

Komórka eukariotyczna

DNA

RNA

Genotypowanie: zróżnicowane wewnątrz genów

Ekspresja genów: Które geny? Poziom ekpresji?

(4)

Mikromacierze umożliwiają kompleksowe badanie

genomów

Zróżnicowanie na obszarze całego genomu

(SNP, CNV) Analiza zmian poziomów ekspresji

Analiza wariantów alternatywnego składania genów (ang. splicing)

Zmiany wzoru metylacji i analiza regulacji genów (zmiany epigenetyczne)

DNA

_RNA

Zmiany poziomu miRNA

(5)

Co to jest mikromacierz ?

Mikromacierz zawiera zestaw tysięcy różnych fragmentów DNA, o znanej sekwencji które umieszczone są w uporządkowany sposób na stałym podłożu

– najczęściej szklanym lub plastikowym

Umożliwia jednoczesną ocenę poziomu tysięcy cząsteczek DNA lub RNA

w badanej próbie (nie daje możliwości dokładnego pomiaru bezwzględnego poziomu zawartości poszczególnych cząsteczek w próbce)

Zasada działania mikromacierzy opiera się na hybrydyzacji komplementarnych do siebie cząsteczek kwasów nukleinowych

(6)

Typy Mikromacierzy – podział ze względu na budowę sond

Mikromacierze cDNA

Mikromacierze oligonukleotydowe

25 nukleotydowe sekwencje - Affymetrix 60 nukleotydowe sekwencje - Agilent

(7)

Mikromacierze - dwukolorowe i jednokolorowe

(8)

Affymetrix,

NimbleGen

Agilent

Illumina

(9)

GeneChip® System, the Affymetrix GeneChip® Scanner 3000

Targeted Genotyping (TG)

Dwie stacje płuczące Skaner z automatycznym odczytem 48 płytek

Programy do analizy danych Partek Genomics Suite

Ingenuity ChAS

Rozbudowa Laboratorium Projektowania Molekularnego oraz Zastosowań Genomiki i Proteomiki w Centrum Doskonałości BioExploratorium.

Projekt współfinansowany przez Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego.

Pracownia Analiz Mikromacierzy

(10)

10

Synteza oligonukleotydów sterowana światłem - Fotolitografia

Lamp

Mask

Feature

Chip

(11)

(12)

(13)

(14)

(15)

5 µm

Miliony kopii oligonukleotydu o określonej sekwencji

>6.500,000 różnych

komplementarnych sond

* * * *

*

1.28cm Mikromacierz typu GeneChip

Obszar, do którego hybrydyzują cząsteczki o komplementarnej sekwencji

1.28cm

(16)

(17)

Mikromacierze tilingowe

Exon B Exon A 35 bp spacing Genome 35 bp 10 bp gap

(18)

Sekwencjonowanie Nowej Generacji

NGS – Next Generation Sequencing

(19)

(20)

1. Losowa fragmentacja nici DNA,

dołączanie odpowiednich dla platformy „linkerów”

(konstrukcja biblioteki)

2. Amplifikacja biblioteki (na podłożu szklanym lub plastikowym)

3. Setki tysięcy reakcji sekwencjonowania przeprowadzone

równocześnie odczytywane przez instrument

(“massively parallel sequencing”)

4. Odczyty pozwalają na porównania ilościowe

5. Metody pozwlające na odczytywanie sekwencji z dwóch stron

cząsteczki

(21)

Roche 454

Konstrukcja biblioteki i emulsyjny PCR

Losowa fragmentacja Doligowanie adaptorów Biblioteka jednoniciowych fragmentów DNA z dołaczonymi adaptorami Emulsyjny PCR

(22)

Roche 454 - pyrosekwencjonowanie

Kulki zawierające miliony kopii pojedynczego

klonalnego

fragmentu DNA

Nałożenie kulek

na płytkę Dodanie złoża

zawierającego

(23)

Illumina

(24)

(25)

Modyfikacje histonów rdzeniowych • Fosforylacja (seryna, treonina)

• Acetylacja (lizyna)

• Metylacja (lizyna, arginina)

• ADP-rybozylacja

• Ubikwitynylacja (lizyna)

• Sumoilacja (lizyna)

Current Opinion in Cell Biology 2003, 15:172–183

monometylacja dimetylacja trimetylacja monometylacja asymetryczna dimetylacja symetryczna dimetylacja B.Turner, Cell 2002

(26)

Zmiana struktury chromatyny

Hamowanie oddziaływania czynników białkowych

(27)

Uzyskanie przeciwciał specyficznych w stosunku do,

poznanych potranslacyjnych modyfikacji histonów rdzeniowych zrewolucjonizowało naszą wiedzę o chromatynie

(28)

(29)

Immunoprecypitacja

Oczyszczanie DNA Amplifikacja

Hybrydyzacja do mikromacierzy

Mapowanie rejonów w genomie

Immunoprecypitacja Oczyszczanie DNA Dołączenie sekwencji adaptorowych Tworzenie zbiorów Sekwencjonowanie

ChIP–chip

ChIP– Seq

ChIP – chromatin immunoprecipitation

Mapowanie rejonów w genomie

(30)

Metody wielkoskalowe pozwoliły na lepsze zrozumienie roli

metylacji DNA, znaczenia lokalizacji nukleosomów i funkcji potranslacyjnych modyfikacji histonów dla regulacji transkrypcji genów

(31)

Przeciwciała specyficzne w stosunku do

potranslacyjnych modyfikacji histonów rdzeniowych

(32)

Rola modyfikacji potranslacyjnych histonów w regulacji procesu transkrypcji

(33)

Histon H3 H3K4me3 H3K4me2 H3K4me1 H3K4ac H3K27me3 H3K27me2 H3K27me1 H3K27ac H3K9me3 H3K9me2 H3K9me1 H3K9ac H3K79me3 H3K79me2 H3K79me1 H3R2me2 H3R2me1 H3K36me3 H3K36me1 H3K36ac H3K14ac H3K18ac H3K23ac Histon H4 H4K20me3 H4K20me1 H2BK5me1 H4K5ac H4K8ac H4K12ac H4K16ac H4K91ac Histon H2B H2BK12ac H2BK20ac H2BK120ac H2BK5ac H2BK5ac Histon H2A H2AK5ac H2AK9ac H2A.Z

Badanie kombinatoryczności wzoru 39 modyfikacji histonowych w limfocytach T CD4+ za pomocą metody ChIP-seq

(34)

Wzór modyfikacji histonowych w chromatynie genu ZMND8

(35)

17 modyfikacji histonowych zwykle obecnych w obszarach promotorów genów aktywnych transkrypcyjnie