Medycyna Weterynaryjna - Summary Medycyna Wet. 62 (7), 807-810, 2006

Medycyna Wet. 2006, 62 (7) 807

Praca oryginalna Original paper

Wystêpuj¹ce od 1980 r. w wielu krajach Europy przypadki masowych padniêæ zaj¹ca szaraka roz-poznano w nastêpnych latach jako zaka¿enie wiruso-we, analogiczne do zdiagnozowanej wczeœniej u kró-lików wirusowej choroby krwotocznej RHD (Rabbit Haemorrhagic Disease) (3, 10, 12). Czynnikiem etio-logicznym obserwowanych przypadków okaza³ siê pokrewny antygenowo wirus z rodziny Caliciviridae rodzaju Lagovirus (1, 7, 15, 22, 24). Chorobotwórczy dla zaj¹ca szaraka zarazek, znany w piœmiennictwie jako wirus EBHS (European Brown Hare Syndrome – wirus choroby krwotocznej zajêcy), podobnie jak wirus RHD, posiada jedno³añcuchowy RNA (ssRNA) oraz nagi kapsyd wielkoœci oko³o 30-38 nm zbudo-wany z 32 kapsomerów. Zarazek jest replikozbudo-wany w cytoplazmie i uwalnia siê z komórek drog¹ lizy (2, 19).

Wirus EBHS jest patogenny dla zajêcy z gatunku Lepus europeus i Lepus timidus. Do zaka¿enia docho-dzi drog¹ alimentarn¹, kropelkow¹ przez uk³ad odde-chowy i spojówki oraz przez uszkodzon¹ skórê. Cho-roba charakteryzuje siê nadostrym i ostrym przebie-giem oraz gwa³townymi padniêciami (do 24 godzin), które obejmuj¹ od 90% do 100% zaka¿onych zwie-rz¹t (3, 23). Klinicznie postaæ ostra cechuje siê go-r¹czk¹ (powy¿ej 41°C), trudnoœciami w oddychaniu, drgawkami oraz niedow³adem koñczyn tylnych. Do charakterystycznych zmian anatomopatologicznych

nale¿¹: du¿a wybroczynowoœæ w narz¹dach wewnêtrz-nych, obrzêk œledziony, nerek, a tak¿e zwyrodnienie w¹troby (9, 12, 17).

Brak odpowiedniego systemu komórkowego in vit-ro do izolacji wirusów EBHS i RHD utrudnia (szcze-gólnie w stosunku do wirusa EBHS) szybki postêp badañ dotycz¹cych zarazka i opracowanie skutecznych metod profilaktyki. W diagnostyce laboratoryjnej tes-ty HA, ELISA i PCR znalaz³y zastosowanie w identes-ty- identy-fikacji antygenów wirusowych w w¹trobie, œledzionie i nerkach. Du¿a koncentracja antygenów wirusa RHD w w¹trobie pozwoli³a na przygotowanie dla królików skutecznej szczepionki (6).

Problem ten nie zosta³ dotychczas rozwi¹zany w sto-sunku do zaka¿eñ wirusem EBHS. Spadek populacji zaj¹ca szaraka, tak¿e na skutek tych zaka¿eñ, zaob-serwowany w Europie w koñcu lat 70. trwa do chwili obecnej. W Polsce z 3 milionów zajêcy w latach sie-demdziesi¹tych do 2001 r. zosta³o oko³o 450 tysiêcy sztuk (5). W 2004 r. pojawi³y siê wnioski o objêcie zaj¹ca szaraka ochron¹ gatunkow¹, a jednym ze spo-sobów na odnowê stad s¹ hodowle zamkniête, w tym kwaterowa.

Celem badañ by³o rozpoznanie przyczyny padniêæ zajêcy z hodowli kwaterowej oraz próba profilaktyki poprzez immunizacjê stada szczepionk¹ w³asn¹, przy-gotowan¹ we w³asnym zakresie z pozyskanego do ba-dañ materia³u.

Przypadki choroby krwotocznej zajêcy

w hodowli kwaterowej – próby profilaktyki

Zak³ad Mikrobiologii Weterynaryjnej Instytutu Chorób ZakaŸnych i Inwazyjnych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej AR, ul. Akademicka 12, 20-033 Lublin

*Zak³ad Mikrobiologii Uniwersytetu w Bia³ymstoku, ul. Œwierkowa 20, 15-950 Bia³ystok

**Katedra Ekologii i Hodowli Zwierz¹t £ownych Wydzia³u Biologii i Hodowli Zwierz¹t AR, ul. Akademicka 13, 20-950 Lublin

Majer-Dziedzic B., Buczek J., Dziedzic R., Ziêtek J.

Viral hemorrhage disease in hares (European Brown Hare Syndrome) in breeding farms – prophylactic measures

Summary

The viral etiology of the disease was established on the basis of virological, anatomopathological, and bacteriological examinations. The isolated aetiological agent of the European Brown Hare Syndrome virus (EBHS; Calicivirdae, Logovirus) was used to produce its own vaccine against EBHS. The vaccine was used to immune 82 hares and eliminated the mortality rate of EBHS infected hares under controlled conditions. The study confirmed the minor pathogenicity of the EBHS virus for rabbits and indicated the presence of cross--immune reactions between the EBHS and RHD viruses.

Medycyna Wet. 2006, 62 (7) 808

Materia³ i metody

Materia³ do badañ pochodzi³ z fermy kwaterowej pro-wadzonej na 20 ha ogrodzonego terenu. Stado podstawo-we w liczbie 60 zró¿nicowanych wiekowo zajêcy o struk-turze p³ci 1 : 1,7 (samce–samice) pozyskano z od³owów styczniowych. Pierwsze gwa³towne zejœcia œmiertelne bez widocznych uprzednio objawów chorobowych mia³y miej-sce w miesi¹cach wczesnowiosennych (marzec-kwiecieñ). Dotyczy³y one zarówno zwierz¹t doros³ych, jak i przychów-ku (ryc. 1).

Badanie anatomopatologiczne. Sekcje kilkunastu zajêcy przeprowadzono wed³ug powszechnie przyjêtych zasad, dokumentuj¹c obserwowane zmiany zapisem foto-graficznym (ryc. 2-4). Jednoczeœnie pobrano materia³

(wy-cinki p³uc, w¹troby, œledziony, nerek) do badañ laborato-ryjnych.

Badanie bakteriologiczne. Wszystkie próbki pobranych narz¹dów wysiano na agar z krwi¹, pod³o¿e McConkeya, pod³o¿e Sabourauda i inkubowano w temp. 37°C, w wa-runkach tlenowych 24-48 godzin.

Badanie wirusologiczne. Próbki narz¹dów mi¹¿szo-wych (w¹troba, œledziona, p³uca) przebadano w mikrosko-pie elektronowym Tesla BS-500. Utrwalony czterotlenkiem osmu materia³ barwiono negatywnie octanem uranylu wg rutynowej techniki badañ.

Odczyn hemaglutynacji (HA). Odczyn wykonywano zgodnie z procedur¹ opisan¹ dla wirusa RHD, stosuj¹c krwinki ludzkie grupy 0. Do badañ przygotowano 10% homogenizaty w PBS z w¹troby, p³uc, œledziony oraz ne-rek wszystkich poddanych sekcji zajêcy (8).

Odczyn hamowania hemaglutynacji (HI). Badanie miana przeciwcia³ w surowicach królików wykonywano standardowym odczynem HI podanym w podrêczniku Lar-skiego (14).

Próba biologiczna. Cztery króliki rasy mieszanej w wie-ku oko³o 2 miesiêcy zaka¿ano 10% homogenizatem

w¹tro-Ryc. 1. Zaj¹ce pad³e w wyniku zaka¿enia wirusem EBHS

Ryc. 2. Wybroczyny w p³ucach zaj¹ca zaka¿onego wirusem EBHS

Medycyna Wet. 2006, 62 (7) 809 by pad³ych zajêcy (miano HA wirusa 256) 1 ml podskórnie

(2 zwierzêta) i 1 ml domiêœniowo (2 zwierzêta). Po 14 dniach zwierzêtom podano podskórnie 1 ml wirusa RHD (miano HA 5120). Po kolejnych 7 dniach pobierano krew i zbadano miano przeciwcia³ hamuj¹cych hemaglutynacjê (HI) w stosunku do wirusa RHD i EBHS.

Przygotowanie szczepionki produkcji w³asnej. Szcze-pionkê przygotowywano z w¹trób pad³ych zajêcy wed³ug metody podanej przez Fitznera dla szczepionki RHD (6). 10% homogenizaty z w¹troby, reaguj¹ce dodatnio w od-czynie HA, inaktywowano formalin¹ i przetrzymywano w 37°C przez 24 h, czêsto mieszaj¹c. Po sprawdzeniu na ja³owoœæ (posiewy na pod³o¿a bakteriologiczne, inkubacja w 37°C w warunkach tlenowych i beztlenowych) oraz tok-sycznoœæ (próba na myszach), szczepionkê przekazano do stosowania.

Immunizacja królików. Do badañ u¿yto 10 królików 2-miesiêcznych o masie cia³a ok. 2 kg, którym podano pod-skórnie (5 zwierz¹t) i domiêœniowo (5 zwierz¹t) po 1 ml przygotowanego preparatu. Po 7, 14 i 21 dniach pobierano krew z ¿y³y brze¿nej ucha, oddzielano surowice i badano je na obecnoœæ przeciwcia³ HI w stosunku do wirusa EBHS. Badanie odpornoœci krzy¿owej wirusów RHD-EBHS. W celu zbadania skutecznoœci ochronnej szczepionki w od-niesieniu do wirusa RHD, 3 króliki immunizowano pod-skórnie. W 14. dniu po podaniu preparatu zwierzêta zaka-¿ano podskórnie 1 ml wirusa RHD o mianie HA 5120. Po 7 dniach pobierano krew i w surowicach okreœlono poziom przeciwcia³ odczynem HI.

Wyniki i omówienie

U wszystkich sekcjonowanych zajêcy stwierdzono charakterystyczne zmiany w narz¹dach mi¹¿szowych. Wystêpowa³ obrzêk, wybroczynowoœæ i drobne ognis-ka martwicowe, szczególnie w w¹trobie (ryc. 3). Stan ten wskazywa³ na nadostry przebieg zaka¿enia, co po-twierdza³y gwa³towne padniêcia zwierz¹t (do 24 go-dzin). Podobny typ zmian opisano jako charakterys-tyczny dla krwotocznej choroby zajêcy (EBHS) (9, 12, 17). Zbli¿one symptomy kliniczne oraz zmiany ana-tomopatologiczne towarzysz¹ chorobie krwotocznej królików (RHD). Autorzy t³umacz¹ to œcis³ym pokre-wieñstwem antygenowym miêdzy wirusami

wywo³u-j¹cymi wymienione jednostki kliniczne (1, 3, 15, 22, 24). Potwierdzenie wirusowego procesu chorobowe-go w badanych przypadkach uzyskano tak¿e na pod-stawie negatywnego wyniku badañ bakteriologicznych i mikologicznych. Jednoczeœnie badania w mikrosko-pie elektronowym wykaza³y obecnoœæ nieos³oniêtych sferycznych wirionów œrednicy ok. 35 nm, charakte-rystycznych dla wirusów rodziny Caliciviridae z ro-dzaju Lagovirus (ryc. 5) (2, 19). Próba biologiczna wy-konana na królikach zaka¿onych homogenizatem w¹t-roby pad³ych zajêcy spowodowa³a wyst¹pienie (po 48 godz. od zaka¿enia) objawów ogólnych (osowia³oœæ, brak apetytu, wzmo¿one pragnienie). Symptomy te ust¹pi³y samoistnie po 2 dniach. Po wykonaniu próby challenge wirusem RHD zwierzêta nie wykazywa³y ¿adnych objawów chorobowych, a w ich surowicach miano przeciwcia³ HI w odniesieniu do wirusa EBHS wynosi³o 160, a w odniesieniu do wirusa RHD 1260 (tab. 1). Zaka¿one jednoczeœnie wirusem RHD króli-ki kontrolne pad³y po 48 godz. wœród typowych obja-wów posocznicy krwotocznej. Króliki immunizowa-ne szczepionk¹ w³asn¹ i zaka¿oimmunizowa-ne wirusem RHD rów-nie¿ nie zachorowa³y, uzyskuj¹c w surowicy podobny poziom przeciwcia³ (tab. 2). Wielu autorów (1, 11, 13) podaje, ¿e doœwiadczalne próby krzy¿owego zaka¿e-nia królików i zajêcy heterogennym wirusem nie wy-wo³ywa³y choroby. Badania w³asne potwierdzaj¹ ma³¹ patogennoœæ wirusa EBHS dla królików, ale jedno-czeœnie wskazuj¹ na wystêpowanie odpornoœci krzy-¿owej miêdzy tymi zarazkami (tab. 1, 2). Spostrze¿e-nia te zgodne s¹ z wynikami badañ Morrise (18), Di Modugno (4) czy Nardellego (20). Z kolei inni auto-rzy (1, 3, 16, 21) uwa¿aj¹, ¿e wirusy EBHS i RHD nie wykazuj¹ krzy¿owej ochrony po immunizacji zwie-rz¹t. Przypuszczaæ mo¿na, ¿e te rozbie¿ne wyniki ba-dañ mog¹ byæ spowodowane ró¿nicami w immuno-gennoœci izolowanych zarazków. W odczynie

hema-wirion

wirion

Ryc. 5. Obraz elektronomikroskopowy w¹troby zaj¹ca zaka-¿onego wirusem EBHS – widoczne wiriony – powiêkszenie oko³o 100 000 i k il ó r K Czaswdniach 0 14 7dnipochallenge 3 <5 160* ₁1₂6₆₀0*_**

Tab. 2. Miano przeciwcia³ HI w surowicy królików szczepio-nych, po dawce challenge wirusem RHD

Objaœnienia: * jak w tab. 1.

t n a ir a W a i n e ¿ a k a z h c a i n d w s a z C 0 14 14dnipochallenge e n r ó k s d o P <5 80 ₁1₂6₆0₀*_** e w o i n œ ê i m o D <5 80 ₁1₂6₆0₀*_**

Tab. 1. Miano przeciwcia³ HI w surowicy królików zaka¿o-nych homogenizatem z w¹troby pad³ych zajêcy, po dawce challenge wirusem RHD

Objaœnienia: * wartoœci œrednie w odniesieniu do wirusa EBHS; ** wartoœci œrednie w odniesieniu do wirusa RHD

Medycyna Wet. 2006, 62 (7) 810

glutynacji z homogenizatami narz¹dów mi¹¿szowych poszczególnych zajêcy najwy¿sze miana HA obser-wowano w materiale z w¹troby (miano 256), a nastêp-nie ze œledziony, nerek (miano 128) oraz p³uc (miano 64) (tab. 3). Najwy¿sza koncentracja wirusa w w¹tro-bie pozwoli³a na u¿ycie tego materia³u do przygoto-wania inaktywowanej szczepionki przygotowanej we w³asnym zakresie. Immunogennoœæ preparatu spraw-dzano na królikach, okreœlaj¹c miano przeciwcia³ HI. Droga podania szczepionki (podskórna lub domiêœnio-wa) nie wywiera³a wp³ywu na wysokoœæ miana bada-nych przeciwcia³, a ich wartoœci nie przekracza³y 160 (tab. 4).

Przygotowan¹ szczepionkê, jako preparat w³asny, podano w formie iniekcji podskórnej (dawka 1 ml) 82 zaj¹com. Zabieg ten, jak siê wydaje, mo¿na oceniæ pozytywnie, gdy¿ wyeliminowa³ padniêcia spowodo-wane przez wirus EBHS w kontrolospowodo-wanej przez auto-rów hodowli. Badañ serologicznych nie przeprowa-dzono ze wzglêdu na trudnoœci z uzyskaniem krwi od immunizowanych zwierz¹t. Zaprezentowane wyniki wskazuj¹ na zasadnoœæ i koniecznoœæ kontynuacji ba-dañ zmierzaj¹cych do opracowania szczepionki prze-ciw chorobie krwotocznej zajêcy. Szczepionka taka mog³aby znaleŸæ zastosowanie w hodowlach kwate-rowych lub fermowych zajêcy. Opracowanie nauko-we programu profilaktyki dla tego gatunku mo¿e umo¿-liwiæ rekonstrukcjê populacji.

Piœmiennictwo

1.Capucci L., Scicluna M., Lavazza A.: Diagnosis of viral haemorrhagic di-sease of rabbits and the European brown hare syndrome. Rev. Sci. Off. Int. Epiz. 1991, 10, 347-370.

2.Chasey D., Duff P.: European brown hare syndrome and associated virus particles in the UK. Vet. Rec. 1990, 126, 623-624.

y c ê j a z a b z c i L MianoHAwriusaw10%homogenziacienarz¹du a b o rt ¹ w p³uca œledizona nerki 3 256 32 128 1281 2 128 32 164 64 5 256 64 128 64 4 128 32 164 64

Tab. 3. Miano HA wirusa w homogenizatach narz¹dów

pad-³ych zajêcy 3.Chasey D., Lucas M., Westcott D., Williams M.: European brown haresyndrome in the UK; a calicivirus related to but distinct from that of viral hemorrhagic disease in rabbits. Arch. Virol. 1992, 124, 363-370.

4.Di Modugno G., Nasti R.: Viral haemorrhagic disease in Puglia. Experimen-tal contribution. Riv. Coniglicol. 1990, 1, 25-32.

5.Dziedzic R.: Przyczyny spadku populacji zaj¹ca szaraka w Polsce. Monogra-fia. Ministerstwo Œrodowiska, Warszawa 2000.

6.Fitzner A.: Wirus krwiotocznej choroby królików (VHD) i jego w³aœciwoœci immunogenne. Praca doktorska, Zduñska Wola 1994.

7.Fitzner A.: Kaliciwirusy patogeny zwierz¹t i ludzi. Medycyna Wet. 2002, 59, 905-908.

8.Fitzner A., Kêsy A., Chrobociñska M.: Porównanie zdolnoœci aglutynowania erytrocytów cz³owieka grupy O, A, B, AB przez wirus krwotocznej broncho-pneumonii królików (RHDV) Medycyna Wet. 1992, 48, 89-90.

9.Fuchs A., Weissenbock H.: Comparative histopathological study of rabbit haemorrhagic disease (RHD) and European brown hare syndrome (EBHS). Comp. Path. 1992, 107, 103-113.

10.Gavier-Widen D., Morner T.: Epidemiology and diagnosis of the European brown hare syndrome in Scandinavian countries: a review. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 1991, 10, 453-458.

11.Gavier-Widen D., Morner T.: Descriptive epizootiological study of Euro-pean brown hare syndrome in Sweden. J. Wild. Dis. 1993, 29, 15-20. 12.Gustafsson K., Svensson T., Uggla A.: Studies on an idiopathic syndrome in

the brown hare (Lepus europaeus) and mountain hare (Lepus timidus) in Sweden, with special reference to hepatic lesions. J. Vet. Med. A 1989, 36, 631-637.

13.Jurcik R., Lencuchova L., Salaj J.: Susceptibility of hares for the infectious haemorrhagic disease of rabbits (RVHD) under experimental conditions. Zschr. Jagden. 1992, 38, 34-41.

14.Larski Z.: Diagnostyka wirusologiczna chorób zwierz¹t. PWRiL, Warszawa 1992.

15.Laurent S., Vautherot J., Le Gall G.: Structural antigenic and immunogenic relationship between European brown hare syndrome virus and rabbit haemorrhagic disease virus. J. Gen. Virol. 1997, 78, 2803-2811.

16.Lavazza A., Scicluna M., Capucci L.: Susceptibility of hares and rabbits to the European brown hare syndrome virus (EBHSV) and rabbit haemorrhagic disease virus (RHDV) under experimental conditions. J. Vet. Med. B 1996, 43, 401-410.

17.Marcato P., Benazzi G., Vecchi M.: Clinical and pathological features of viral haemorrhagic disease of rabbits and European brown hare syndrom. Rev. Sci. tech. Off. Int. Epiz. 1991, 10, 371-392.

18.Morisse J. P., Picault J. P., Boilletot E., Morin M.: Etiological relationship between the European brown hare syndome (EBHS) and the viral haemor-rhagic disease in rabbits (VHD). Rev. Med. Vet. 1990, 141, 463-467. 19.Murphy F., Gibbs E. P., Horzinek M., Studdert M.: Veterinary Virology.

Aca-demic Press USA 1999.

20.Nardelli S., Agnoletti F., Costantini F., Parpajola R.: Diagnosis of rabbit haemorrhagic disease (RHD) and European brown hare syndrome (EBHS) by indirect sandwich polyclonal ELISA. J. Vet. Med. B 1996, 43, 393-400. 21.Nauwynck H., Callebaut P., Peeters J., Ducatelle R., Uyttebroek E.:

Suscep-tibility of hares and rabbits to a Belgian isolate of European brown hare syndrome virus. J. Wild. Dis. 1993, 29, 203-208.

22.Nowotny N., Ros Bascunana C., Ballagi A., Gavier-Widen D., Belak S.: Phy-logenetic analysis of rabbit haemorrhagic disease and European brown hare syndrome viruses by comparison of sequensis from the capsid protein gene. Arch. Virol. 1997, 142, 657-673.

23.Nowotny N., Steineck T., Tataruch F., Schilcher F., Weissenbock H.: Euro-pean brown hare syndrome (EBHS) – experimentelle Untersuchungen. Wien. Tierärztl. Mnschr. 1991, 78, 370-378.

24.Wirblich C., Meyers G., Ohlinger V. F., Capucci L., Eskens U., Haas B., Thiel H.: Europen brown hare syndrome virus: Relationship to rabbit hemor-rhagic disease virus and other caliciviruses. J. Virol. 1994, 68, 5164-5173. Adres autora: dr hab. Barbara Majer-Dziedzic, ul. Akademicka 12, 20-033 Lublin

Objaœnienie:* podano œrednie wartoœci uzyskane od 5 królików po szczepieniu podskórnym; ** podano œrednie wartoœci uzyska-ne od 5 królików po szczepieniu domiêœniowym; *** próba zero-wa wykonana przed szczepieniem

Tab. 4. Miano przeciwcia³ HI w surowicy szczepionych króli-ków t n a ir a W ij c a zi n u m m i u i n e i p e z c z s o p h c a i n d w I H o n a i M * * * 0 7 14 21 * 1 <5 40 160 160 * * 2 <5 40 160 160