Medycyna Wet. 2008, 64 (5) 632
Artyku³ przegl¹dowy Review
Czynniki transkrypcyjne STAT
ogólna charakterystyka
Rodzinê bia³ek STAT (signal transducers and activa-tors of transcription), czyli przekaniki sygna³u i aktywa-tory transkrypcji, zidentyfikowano na pocz¹tku lat dzie-wiêædziesi¹tych ubieg³ego wieku jako cytoplazmatyczne czynniki transkrypcyjne bior¹ce udzia³ w przekazywaniu informacji od receptorów cytokin do j¹dra komórkowe-go, gdzie wp³ywaj¹ one na transkrypcjê wielu genów (13). Dotychczas opisano siedem czynników transkrypcyjnych STAT u ssaków, do których zaliczaj¹ siê: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B, STAT6 oraz STAT-D zidentyfikowany u muszki owocowej Drosophila melano-gaster (23).
Geny koduj¹ce czynniki transkrypcyjne STAT zlokali-zowane s¹ u ró¿nych gatunków ssaków w ró¿nych chro-mosomach; i tak: geny bia³ek STAT1 i STAT4 u myszy zlokalizowane s¹ w 1 chromosomie, natomiast u cz³owieka znajduj¹ siê one w chromosomie 2. STAT3, STAT5A oraz STAT5B zmapowano u myszy w chromosomie 11, a u cz³owieka w chromosomie 17, z kolei geny dla czynni-ków transkrypcyjnych STAT2 oraz STAT6 zlokalizowa-ne s¹ w 10 chromosomie u myszy, a u cz³owieka wystê-puj¹ one w chromosomie 12 (2).
Bia³ka z rodziny STAT zbudowane s¹ z podobnej licz-by aminokwasów, a mianowicie, dla czynników STAT: 1, 3, 4, 5A oraz 5B zbudowane s¹ z 750-795 aminokwa-sów, natomiast bia³ka STAT2 oraz STAT6 zbudowane s¹ z 750-850 aminokwasów (4).
Wszystkie czynniki transkrypcyjne STAT charaktery-zuj¹ siê bardzo podobn¹ budow¹. Posiadaj¹ one piêæ kon-serwatywnych domen, a mianowicie: domenê wi¹¿¹c¹ DNA, która usytuowana jest w rodkowej czêci bia³ek STAT, domenê SH2 (Src-homology-2-like domain), do-menê SH3 (Src-homology-3-like domain). Poza tym bia³ka
STAT zawieraj¹ jeszcze dwie terminalne domeny: NH2 oraz COOH (9).
Domena SH2 jest domen¹ kluczow¹ dla czynników transkrypcyjnych STAT, poniewa¿ bierze ona udzia³ w przy³¹czaniu tych bia³ek do kompleksów receptoro-wych, a obecnoæ jej wymagana jest tak¿e podczas inter-akcji z kinazami tyrozynowymi JAK. Ponadto domena SH2 bierze udzia³ w dimeryzacji czynników transkryp-cyjnych STAT, co jest warunkiem póniejszej zdolnoci tych bia³ek do wi¹zania siê z DNA (13). Za domen¹ SH2 w pozycji 694 znajduje siê tyrozyna, której fosforylacja jest warunkiem aktywacji bia³ek STAT (22).
Funkcja czynników transkrypcyjnych STAT polega na regulacji ekspresji genów w odpowiedzi na sygna³ od re-ceptorów cytokin, takich, jak na przyk³ad: IFN-á, -â, -ã, interleukiny (2-7, 10-13 i 15) oraz erytropoetyna, trom-bopoetyna czy prolaktyna i hormon wzrostu. Trzy z po-znanych bia³ek STAT s¹ aktywowane tylko poprzez kon-kretne ligandy: STAT2 aktywowany jest tylko poprzez INF-á, STAT4 w limfocytach aktywuje IL-12 oraz INF-á, natomiast STAT6 aktywowany jest tylko przez IL-4 i IL-16. Czynniki transkrypcyjne, takie jak STAT: 1, 3, 5A czy 5B s¹ aktywowane przez wiele ró¿nych li-gandów, co jednoczenie sk³ania do postawienia pytania, w jak wielu specyficznych odpowiedziach komórkowych bior¹ udzia³ czynniki STAT (2, 4). W organizmie myszy bia³ka STAT spe³niaj¹ kluczow¹ rolê i inaktywacja które-go z nich prowadzi do niepo¿¹danych konsekwencji.
Uproszczony proces aktywacji bia³ek z rodziny STAT wygl¹da nastêpuj¹co: cytokiny kumuluj¹ siê i wi¹¿¹ ze swoimi receptorami wystêpuj¹cymi w b³onie komórko-wej, powoduj¹c tym samym pobudzenie kinaz tyrozyno-wych typu JAK. W receptorach cytokin powstaj¹ wtedy miejsca z ufosforylowan¹ tyrozyn¹, co wywo³uje ³¹cze-nie czynników transkrypcyjnych STAT z receptorem. Na-stêpnie s¹ one fosforylowane, przez wci¹¿ obecne w
kom-Czynnik transkrypcyjny STAT5A a cechy u¿ytkowe byd³a
TOMASZ GRZELAK, MAREK KMIEÆ, ARKADIUSZ TERMAN, INGA KOWALEWSKA-£UCZAK
Katedra Genetyki i Ogólnej Hodowli Zwierz¹t Wydzia³u Biotechnologii i Hodowli Zwierz¹t AR, ul. Doktora Judyma 6, 71-460 Szczecin
Grzelak T., Kmieæ M., Terman A., Kowalewska-£uczak I.
STAT5A transcription factor with reference to production traits in cattle
Summary
STATs (signal transducers and activators of transcription) are latent transcription factors present in the cytoplasm of the majority of animal cells. They are activated by tyrosine phosphorylation and then translocated to the nucleus where they induce transcription of target genes. The STAT5A factor mediates the actions of cytokines and peptide hormones, including prolactin and growth hormone. STAT5A, previously known as MGF (mammary gland factor), is the most important transcription factor mediating the action of ligands on the expression of genes responsible for production traits in cattle.
Medycyna Wet. 2008, 64 (5) 633
pleksie z receptorem, kinazy JAK. Prowadzi to do dime-ryzacji bia³ek STAT poprzez interakcje konserwatywnej domeny SH2 z ufosforylowany¹ tyrozyn¹. Dimery bia³ek STAT migruj¹ nastêpnie do j¹dra komórkowego, gdzie wi¹¿¹ siê z elementami sekwencji GAS (gamma-activa-ted sequence), wp³ywaj¹c na transkrypcjê genów docelo-wych. Sekwencja GAS jest specyficzna dla ka¿dego z bia³ek STAT (15, 21).
Czynnik transkrypcyjny STAT5A
Bia³ko STAT5 wczeniej okrelane by³o mianem MGF (mammary gland factor), poniewa¿ wykryto je w gruczo-le mgruczo-lekowym owcy, gdzie uczestniczy w szlaku oddzia-³ywania prolaktyny na ekspresjê genów bia³ek mleka (24). STAT5 wystêpuje w postaci dwóch izoform A oraz B, które kodowane s¹ przez dwa ró¿ne geny. Homologia miê-dzy bia³kiem STAT5A i STAT5B wynosi oko³o 95%. Obie izoformy posiadaj¹ tyrozynê w pozycji 694, której ufos-forylowanie jest niezbêdne do aktywacji obu bia³ek (9).
Choæ ufosforylowanie tyrozyny jest procesem obliga-toryjnym do aktywowania bia³ek STAT5, to istnieje jesz-cze jedna droga aktywacji, polegaj¹ca na fosforylacji se-ryny, jednak jest to proces o charakterze uzupe³niaj¹cym i droga aktywacji poprzez ten aminokwas nie zosta³a jesz-cze dobrze poznana (4). W przypadku bezw³osych szczu-rów hirosaki (HHR) to nie fosforylacja tyrozyny by³a kluczowym elementem aktywacji bia³ka STAT5A, lecz zwi¹zek cukrowy o nazwie O-GlcNAc (N-acetylogluko-zamina przy³¹czona do polipeptydu wi¹zaniem O-gliko-zydowym) (20).
STAT5 rozpoznaje receptory dla prolaktyny i hormonu wzrostu, a tak¿e dla interleukin: IL-2, 7, 9, 15 oraz trom-bopoetyny, erytropoetyny, naskórkowego czynnika wzros-tu (EGF), czynnika stymuluj¹cego wzrost kolonii granu-locytów (G-CSF) (11, 12). Niektóre z tych receptorów w czasie ró¿nicowania prezentowane s¹ jednoczenie na ró¿nych komórkach. Na przyk³ad, aktywowany przez ery-tropoetynê czynnik STAT5 w czerwonych krwinkach, a przez prolaktynê w gruczole mlekowym, mo¿e dzia³aæ w tym samym czasie w dwóch typach tkanek, indukuj¹c tym samym transkrypcjê genów wp³ywaj¹cych na ró¿ne cechy (4). Ekspresjê czynnika transkrypcyjnego STAT5 oprócz gruczo³u mlekowego zaobserwowano tak¿e w lim-focytach T oraz komórkach szpikowych i mia³o to przy-puszczalnie zwi¹zek z tym, ¿e myszy wykorzystywane w dowiadczeniu cierpia³y na bia³aczkê (12).
Podobnie jak wszystkie bia³ka z rodziny STAT, tak¿e bia³ko STAT5A zawiera piêæ konserwatywnych domen.
Domena odpowiedzialna za wi¹zanie tego czynnika transkrypcyjnego z DNA rozpoznaje sekwencjê aminokwasow¹ okrelan¹ jako GAS (ã-interferon-activated-sequence), na któr¹ sk³ada siê motyw nastêpuj¹cych aminokwa-sów: 5 TTCNNNGAA 3 (12, 14). Sekwen-cja GAS obecna jest, miêdzy innymi, w pro-motorze genu â-kazeiny, ale tak¿e w bia³kach kwanej serwatki mleka (WAP-Whey Acidic Protein), â-laktoglobulinie oraz ás1-kazeinie (12, 16). Promotor â-kazeiny ma tak¿e miej-sce wi¹zania dla receptora glukokortykoidów i insuliny, co mo¿e prawdopodobnie wzmoc-niæ dzia³anie czynnika transkrypcyjnego STAT5 (4, 12).
W 16 eksonie genu STAT5A zlokalizowana jest dome-na SH2. Jest odome-na bardzo wa¿nym elementem bia³ka, po-niewa¿ bierze udzia³ w procesie aktywacji czynnika STAT5A, a konkretnie w jego dimeryzacji (5).
Najmniej konserwatywn¹ domen¹ jest terminalna do-mena COOH, która niezbêdna jest do pe³nej aktywnoci genu STAT5A. Najbardziej zachowawcz¹ czêci¹ dome-ny C-koñca jest segment czterech aminokwasów (Pro MetSerPro) (4). Jednoczenie w³anie w obrêbie odcinka C-koñca istniej¹ elementy, które ró¿ni¹ bia³ka STAT5A i STAT5B (22).
Gen czynnika tarnskrypcyjnego STAT5A zlokalizowa-no u byd³a w 19 chromosomie w obrêbie ramienia d³u-giego w pozycji 17 (10). Umiejscowiony jest on wewn¹trz locus STAT o wielkoci 40 kpz, gdzie znajduj¹ siê równie¿ geny STAT3 oraz STAT5B (19, 22). Dla porów-nania, gen STAT5A u myszy znajduje siê w chromoso-mie 11, u cz³owieka w chromosochromoso-mie 17 (2), u kozy, po-dobnie jak u byd³a, w chromosomie 19, natomiast u owiec w chromosomie 11 (10).
Gen czynnika transkrypcyjnego STAT5A u byd³a ma d³ugoæ 15947 pz i zawiera 19 eksonów. W dwóch pierw-szych eksonach oraz w ostatnim znajduj¹ siê sekwencje oskrzydlaj¹ce (UTR). W eksonie I i II rejon koduj¹cy 5 UTR mRNA ma d³ugoæ 187 nukleotydów, natomiast w eksonie ostatnim rejon koduj¹cy 3 UTR mRNA ma d³ugoæ 846 pz (nukleotydy 15101-15947). Otwarta ram-ka odczytu (ORF) rozpoczyna siê wraz z wyst¹pieniem sekwencji ATG w pozycji 1025 koñca 5(6).
Wp³yw polimorfizmu w genie STAT5A
na cechy u¿ytkowe byd³a
Badania nad wp³ywem polimorfizmów w genie czyn-nika transkrypcyjnego STAT5A na cechy u¿ytkowe byd-³a prowadzone by³y, jak dot¹d, g³ównie w kierunku cech u¿ytkowoci miêsnej. W 7 eksonie genu STAT5A u byd-³a wykryto polimorfizm, który powodowany jest tranzy-cj¹ C®T w pozycji 6853 (5). Substytucjê tê mo¿na roz-poznaæ metod¹ RFLP, stosuj¹c enzymy restrykcyjne, ta-kie jak: AvaI lub DdeI, uzyskuj¹c nastêpuj¹ce genotypy: CC, CT oraz TT, przy czym ostatni z wymienionych ge-notypów wyst¹pi³ jedynie u byd³a polskiego czerwonego i bia³ogrzbietego. Najwiêkszy wp³yw na cechy miêsnoci u byd³a zaobserwowano u osobników o genotypie CC. Buhaje o genotypie CC STAT5A/AvaI by³y w wieku 9 i 15 miesiêcy ciê¿sze, posiada³y wiêksz¹ wydajnoæ rzen¹, lepsze parametry tuszy oraz lepiej wykorzystywa³y paszê
Tab. 1. Efekty zaburzenia dzia³ania genów STAT u myszy (4)
e n a w o w y t k a n I i k i n n y z c Objawy 1 T A T S Brakwrodzonejodpowiedizorganzimunainfekcjebakteryjneiwriusowe 2 T A T S Letalnewewczesnymstadiumembironalnym 3 T A T S Letalnewewczesnymstadiumembironalnym;brakgasrtulacij 4 T A T S Zaburzeniafunkcij ilmfocytówTh1 A 5 T A T S Brakrozwojugruczo³usutkowegoorazzaburzenialaktacij B 5 T A T S Brakrozwojugruczo³usutkowegoorazzaburzenialaktacij 6 T A T S Zaburzeniafunkcij ilmfocytówTh2
Medycyna Wet. 2008, 64 (5) 634
w przeliczeniu na produkcjê miêsa ni¿ buhaje o genoty-pie CT (5).
Z badañ, jakie przeprowadzi³ Kmieæ i wspó³pracowni-cy (dane niepublikowane) wynika, i¿ polimorfizm genu STAT5A/AvaI nie wp³ywa istotnie na cechy u¿ytkowoci mlecznej byd³a holsztyñsko-fryzyjskiego odmiany czer-wono-bia³ej, choæ w pierwszej laktacji nieco wy¿szymi wartociami wydajnoci mleka oraz wydajnoci t³uszczu charakteryzowa³y siê osobniki o genotypie CT. Jednak, jak ju¿ wczeniej wspomniano, nie by³y to ró¿nice statys-tycznie istotne.
Kolejnym polimorfizmem genu STAT5A jest delecja trinukleotydu CCT w 15 intronie w pozycji od 12549 do 12551 (8). Polimorfizm ten identyfikowano za pomoc¹ metody PCR-heteroduplex (PCR-HD), co pozwoli³o okreliæ 3 genotypy: AA, AB oraz BB. Wstêpne wyniki wykaza³y, ¿e w poszczególnych stadach frekwencje ge-notypów znacznie siê ró¿ni³y, np. genotyp AA u byd³a rasy charolaise ujawni³ siê u 61% osobników, natomiast u byd³a fryzyjskiego oraz red angus a¿ u 83%. Genotyp BB zidentyfikowany zosta³ tylko u byd³a rasy charolaise oraz limousin, natomiast u byd³a fryzyjskiego nie wystê-powa³ (8).
Metod¹ PCR-RFLP przy u¿yciu enzymu MslI zidenty-fikowano tak¿e polimorfizm w 16 eksonie, który polega na substytucji T®C w pozycji 12743 (5). Tranzycja ta zmienia sekwencjê aminokwasow¹ w pozycji 686 (wali-na/alanina). Za istotnoci¹ tego polimorfizmu przemawia tak¿e fakt, i¿ wyst¹pi³ on w eksonie, który koduje dome-nê SH2, odpowiedzialn¹ za dimeryzacjê i aktywacjê czyn-nika transkrypcyjnego STAT5A. Zauwa¿ono tak¿e, ¿e po raz pierwszy genotyp mia³ wp³yw na wi¹zanie siê bia³ek j¹drowych. Stwierdzono, ¿e buhaje o genotypie CC wy-kazywa³y wiêksze powinowactwo do sondy DNA, któr¹ znakowano [32P] dCTP ni¿ buhaje o genotypie TT. Sonda
DNA zawiera³a sekwencjê GAS (5).
Za pomoc¹ metody SSCP odkryto polimorfizm SNP (single nucleotide polimorphism) polegaj¹cy na tranzycji adeniny w miejsce guaniny (A®G). Zlokalizowany jest on w 9 intronie genu STAT5A w pozycji 9501 (3). Bada-nia te wykaza³y, ¿e krowy czarno-bia³e nie wykazywa³y statystycznie istotnych powi¹zañ miêdzy genotypami a produkcj¹ mleczn¹, natomiast takie ró¿nice pojawi³y siê u krów rasy jersey. Najwy¿sz¹ wydajnoci¹ pod wzglê-dem mlecznoci charakteryzowa³y siê krowy o genotypie GG, natomiast mleko krów o genotypie AG zawiera³o wiêcej bia³ka ni¿ mleko byd³a o genotypach AA oraz GG. Co do zawartoci t³uszczu w mleku, najwy¿szy jego po-ziom podczas 1. i 2. laktacji wykazywa³y krowy o geno-typie AA (3).
W rejonie promotorowym wystêpuje tak¿e mutacja polegaj¹ca na tranzycji A®G w pozycji 488. Przeprowa-dzone badania wykaza³y, ¿e miejsce polimorfizmu jest tak¿e miejscem dla wi¹zania innego czynnika transkryp-cyjnego, jakim jest HNF-3 (hepatocyte nuclear factor-3), co mo¿e mieæ antagonistyczny wp³yw na ekspresjê czyn-nika STAT5A (7).
Oprócz wy¿ej wymienionych polimorfizmów genu STAT5A, odkrytych i opisanych przez polskich naukow-ców, zidentyfikowano tak¿e polimorfizm powtórzeñ TG w intronie 12 (22) oraz polimorfizm SSCP w postaci dwóch alleli A i B oraz trzech genotypów: AA, AB, BB
we fragmencie genu koduj¹cym domenê SH2 (1). Zaob-serwowano ostatnio tak¿e trzy wzory genotypów SSCP u byd³a rasy holsztyñsko-fryzyjskiej (17).
Badania, jakie prowadzone s¹ nad wp³ywem polimor-fizmu czynnika transkrypcyjnego STAT5A na cechy u¿yt-kowe byd³a, mog¹ byæ przes³ank¹ do stwierdzenia, ¿e gen STAT5A mo¿e byæ potencjalnym markerem cech ilocio-wych (QTL) u byd³a, co jednoczenie wi¹¿e siê z koniecz-noci¹ prowadzenia dalszych badañ nad tym genem.
Pimiennictwo
1.Antoniou E., Hirts B. J., Grosz M., Skidmore C. J.: A single strand conformation polymorphism in the bovine gene STAT5A. Anim. Genet. 1999, 30, 225-244. 2.Benekli M., Maria R. B., Baumann H., Wetzler M.: Signal transducer and
acti-vator of transcription proteins in leukemias. Blood 2003, 101, 2940-2954. 3.Brym P., Kamiñski S., Ruæ A.: New SSCP polymorphism within bovine STAT5A
gene and its associations with milk performance traits in Black-and-White and Jersey cattle. J. Appl. Genet. 2004, 45, 445-452.
4.Darnell J. E. Jr.: STATs and gene regulation. Science 1997, 277, 1630-1635. 5.Flisikowski K., Oprz¹dek J., Dymnicki E., Zwierzchowski L.: New
poly-morphism in bovine STAT5A gene and its association with meat production traits in beef cattle. Anim. Sci. Pap. Rep. 2003b, 21, 147-157.
6.Flisikowski K., Szymanowska M., Zwierzchowski L.: The DNA binding capa-city of genetic variants of the bovine STAT5A transcription factor. Cell. Mole. Biol. Lett. 2003a, 8, 831-840.
7.Flisikowski K., Starzyñski R. R., Zwierzchowski L.: Promoter variant depen-dent expression of the STAT5A gene in bovine liver. Biochim. Biophys. Acta 2004, 1679, 195-199.
8.Flisikowski K., Zwierzchowski L.: Polymerase chain reaction-heteroduplex (PCR-HD) polymorphism within the bovine STAT5A gene. J. Appl. Genet. 2003, 44, 185-189.
9.Freeman M. E., Kanyicska B., Lerant A., Nagy G.: Prolactin: structure, function and regulation of secretion. Physiolog. Rev. 2000, 80, 1523-1631.
10.Goldammer T., Meyer L., Seyfert H. M., Brunner R. M., Schwerin M.: STAT5A encoding gene maps to chromosome 19 in cattle and goat and chromosome 11 in sheep. Mammal Genome 1997, 8, 705-706.
11.Hendry L., John S.: Regulation of STAT signaling by proteolytic processing. Eur. J. Biochem. 2004, 271, 4613-4620.
12.Iavnilovitch E., Groner B., Barasch I.: Overexpression and Forced Activation of STAT5 in Mammary Gland of Transgenic Mice Promotes Cellular Prolife-ration, Enhances Differentiation, and Delays Postlactational Apoptosis. Mol. Cancer Res. 2002, 1, 32-47.
13.Ihle J. N.: STATs: Signal transducers and activators of transcription. Cell 1996, 84, 331-334.
14.Joung Y. H., Park J. H., Park T., Lee C. S., Kim O. H., Ye S. H., Yang U. M., Lee K. J., Yang Y. M.: Hypoxia activates signal transducers and activators of transcription 5 (STAT5) and increases its binding activity to the GAS element in mammary epithelial cells. Exp. Mol. Med. 2003, 35, 350-357.
15.Jove R.: Preface: STAT signaling. Oncogene 2000, 19, 2466-2467.
16.Kazansky A. V., Raught B., Lindsey S. M., Wang Y., Rosen J. M.: Regulation of mammary gland factor/STAT5A during mammary gland development. Mol. Endocrinol. 1995, 9, 1598-1609.
17.Lee H., Dekkers J. C. M., Soller M., Malek M., Fernando R. L.: Application of the false discovery rate to quantitative trait loci interval mapping with multiple traits. Genetics 2002, 161, 905-914.
18.McCracken J. Y., Molenaara J., Snell R. J., Davey H. W., Wilkins R. J.: Poly-morphic TG repeats presents within the bovine STAT5A gene. Anim. Genet. 1997, 28, 453-464.
19.Molenaar A., Wheeler T. T., McCracken J. Y., Seyfert H. M.: The STAT 3-enco-ding gene resides within the 40 kbp gap between the STAT5A- and STAT5B--encoding genes in cattle. Anim. Genet. 2000, 31, 333-346.
20.Nanashima N., Asano J., Hayakari M., Nakamura T., Nakano H., Yamada T., Shimizu T., Akita M., Fan Y., Tsuchida S.: Nuclear localization of STAT5 modified with O linkedN acetylglucosamine and early involution in the mammary gland of Hirosaki Hairless Rat. JBC Pap. 2005 (w druku). 21.Rawlings J. S., Rosler K. M., Harrison D. A.: The JAK/STAT signaling
pathway. J. Cell Sci. 2004, 117, 1281-1283.
22.Seyfert H., Pitra C., Meyer L., Brunner R. M., Wheeler T. T., Molenaara A., McCracken J. Y., Herrmann J., Thiesen H., Schwerin M.: Molecular characteri-zation of STAT5A- and STAT5B-encoding genes reveals extended intragenic sequence homogeneity in cattle and mouse and different degrees of divergent evolution of various domains. J. Molec. Evolution 2005, 50, 550-561. 23.Wakao H., Schmitt-Ney M., Groner B.: Mammary Gland-specific Nuclear
Fac-tor Is Present in Lactating Rodent and Bovine Mammary Tissue and Composed of a Single Polypeptide of 89 kDa. J. Biol. Chem. 1992, 267, 16365-16370. 24.Wakao H., Gouilleux F., Groner B.: Mammary gland factor (MGF) is a novel
member of the cytokine regulated transcription factor gene family and confers the prolactin response. EMBO J. 1994, 13, 2182-2191.
Adres autora: mgr in¿. Tomasz Grzelak, ul. Doktora Judyma 6, 71-460 Szczecin; e-mail: tomasz.grzelak@biot.ar.szczecin.pl
