Artyku³ przegl¹dowy Review
Pszczo³a miodna podtrzymuje bioró¿norodnoæ, a tym samym stabilnoæ ekosystemów. Pszczo³y (wszystkie gatunki) zapylaj¹ oko³o 70-80% ziemskiej flory, bê-d¹c niezbêdnym sk³adnikiem biocenoz l¹dowych (32). Maj¹ wielkie znaczenie nie tylko dla rodowiska natu-ralnego, ale i upraw rolniczych. S¹ jednym z czynni-ków intensyfikacji plonów, zapylaj¹c w Polsce oko³o 50 gatunków rolin, w tym pod os³onami. Wartoæ przyrostu plonów szacowana jest w obszarze UE na 14,2 × 109 EUR (10). Oko³o 1/3 produktów
spo¿yw-czych konsumowanych przez cz³owieka i ponad 50% diety t³uszczowej jest zale¿na od zapylania przez owa-dy. W 2006 r. zakoñczono prace nad zmapowaniem genomu A. mellifera. Jest ona czwartym owadem po muszce owocowej, jedwabniku i komarze widliszku, którego genom poznano w ca³oci (39).
W ostatniej dekadzie bardzo popularne sta³y siê badania nad epigenomem pszczo³y. Genom jest to
ca³kowity komplet informacji genetycznej znajduj¹cy siê w organizmie. System reguluj¹cy ekspresjê genów, wystêpuj¹cy poza DNA to epigenom. Je¿eli gen po-równa siê do ksi¹¿ki z biblioteki, któr¹ jest genom, to epigenom bêdzie w tym przypadku systemem wyszu-kuj¹cym ksi¹¿ki potrzebne w danej chwili do czytania i zwracaj¹cym je w stanie nienaruszonym na pó³kê biblioteczn¹ (7).
Pierwszy raz nazwy epigenetyka u¿y³ angielski embriolog C. H. Wadington w 1942 r. Epigenetyka bada wyciszanie i aktywowanie genów. Metylowanie promotorów genów (7) jest najpowszechniejszym mechanizmem tych procesów. U ka¿dego organizmu, w ka¿dej tkance i komórce w danej chwili s¹ w³¹-czane i wyciszane (wy³¹w³¹-czane) inne geny. Ka¿-dy organizm wykorzystuje tylko ok. 10% swoich genów, z czego w konkretnym momencie i w danej komórce aktywnych jest tylko 2% z nich. Pozosta³y
Metylowanie DNA u pszczo³y miodnej (Apis mellifera)
i jego wp³yw na badania biologiczne
ANETA STRACHECKA, JERZY PALEOLOG, GRZEGORZ BORSUK, KRZYSZTOF OLSZEWSKI, MILENA BAJDA
Katedra Biologicznych Podstaw Produkcji Zwierzêcej Wydzia³u Biologii i Hodowli Zwierz¹t UP, ul. Akademicka 13, 20-950 Lublin
Strachecka A., Paleolog J., Borsuk G., Olszewski K., Bajda M.
DNA methylation in the honey bee (Apis mellifera) and its importance for biological research
Summary
The honey bee is the fourth insect following the drosophila, the silkworm and the anopheles whose genome has been fully investigated. Eighty percent of the methylation-prone apian genes are located in the brain. Only about 70 thousand out of the 60 million cytosines contained in the bee genome are methylated. Most of them have their primary methylation sites in the exons. In contrast to the intensive human genome methylation, only small and specific segments of the honey bee genome are methylated. It is estimated that approximately 35-40% of apian genes are deficient in CpG groups. DNA methylation increases the incidence of mutations at the CpG sites and may promptly lead to inconsistency between DNA sequences. Methylation in A. mellifera occurs exclusively in CpG dinucleotides characterized by a bimodal configuration and deamination of methylated CpGs to TpGs (CpA in the supplementary strand), resulting in GC mutating into AT. Genes with a low and high CpG content (low-CpG and high-CpG) are active in various biological processes. The low-CpG genes are typical of hypermethylation and particularly important for metabolism, ubiquitination, gene expression and translation. The high-CpG genes, in turn, primarily participate in hypomethylation and are fundamental for development processes, intercellular communication and adhesion. The sparing methylation system (of bees) offers unique possibilities for the study of methylation using a model organism that is much simpler than most laboratory plants and animals, let alone man. The specific epigenetic mechanisms active in the small apian genome make bees potential model objects for epigenetic analyses and experiments aiming at providing solutions to such human health problems as neoplastic, genetic, metabolic, vascular, neurological and immunological diseases.
DNA stanowi najczêciej mieciowy DNA (junk DNA; u ssaków) (7).
Mechanizmy epigenetyczne w komórce odpowie-dzialne s¹ m.in. za piêtnowanie rodzicielskie, deakty-wacjê licznych sekwencji powtórzonych, kontrolê pro-cesów rozwoju i podzia³u komórki oraz wy³¹czanie drugiego chromosomu X w komórkach ¿eñskich (7). Nadmierna metylacja promotorów genów supresoro-wych, która prowadzi do zaburzenia profilu epigene-tycznego, powoduje nowotworzenie. Spostrze¿enie tej zale¿noci pozwoli³o okreliæ nowe cele terapeutycz-ne i wprowadziæ nowy sposób leczenia nazywany te-rapi¹ epigenetyczn¹. Terapia taka polega na komplek-sowym dzia³aniu ograniczaj¹cym niekorzystne zmia-ny epigenetyczne i przywróceniu komórki do normy (8). Zmiany epigenetyczne s¹ odwracalne i zachodz¹ na wczesnych etapach nowotworzenia. Na zmiany po-ziomu metylacji DNA mog¹ wp³ywaæ: promieniowa-nie rentgenowskie, zwi¹zki chemiczne Ni i Cr, czyn-niki genetyczne, procesy starzenia siê oraz obecnoæ w diecie substancji bêd¹cych ród³em grup metylo-wych, takich jak kwas foliowy, witamina B12 (7).
Pszczo³a jako organizm modelowy
W ca³ym wiecie miliardy dolarów s¹ przeznaczane na badania epigenomu. Wymagaj¹ one jednak tanie-go, ³atwego w obs³udze modelu dowiadczalnetanie-go, w którym mo¿na ledziæ zmiany na poziomie epige-netycznym (molekularnym) i konfrontowaæ je z ³atwo mierzalnymi cechami u osobników. Najlepiej by³oby, gdyby te modelowe osobniki przejawia³y plastycznoæ fenotypow¹, czyli przy tych samych genomach mia³y wyranie ró¿ne postacie i spe³nia³y ró¿ne funkcje, jed-nak wybrane procesy biochemiczne i fizjologiczne powinny mieæ podobne do tych u cz³owieka. Mog³y-by tak¿e prowadziæ spo³eczny tryb ¿ycia i mieæ rozwi-niête funkcje psychiczne. W tej sytuacji Apis mellife-ra jest idealnym modelem.
Z punktu widzenia systematyki pszczo³a miodna jest owadem. Jednak ju¿ w drugiej po³owie XIX w. Jan Mehring sformu³owa³ stwierdzenie, ¿e rodzina pszcze-la to istota odpowiadaj¹ca krêgowcom. Dzisiaj kom-binacja cech i osi¹gniêæ ewolucyjnych rodziny pszcze-lej pozwala przyrównywaæ j¹ do ssaków (38).
W rodzinie pszczelej wystêpuj¹ ró¿ne formy feno-typowe, wród których wyró¿nia siê: matki, trutnie i robotnice. Ró¿ni¹ siê one percepcj¹ zmys³ów, d³u-goci¹ ¿ycia, metabolizmem i zachowaniem. W lecie robotnica (A. mellifera) ¿yje do 40 dni. W tym czasie przechodzi ró¿ne stadia specjalizacji w tzw. poli-etyzmie wiekowym, w którym wraz z rozwojem po-szczególnych gruczo³ów wykonuje zró¿nicowane prace na rzecz rodziny pszczelej. Zdumiewaj¹cy jest fakt, i¿ pszczo³y zimowe mog¹ prze¿yæ a¿ 6 miesiêcy. Z kolei matka mo¿e prze¿yæ nawet 5-7 lat, w tym cza-sie sk³ada jaja, których masa jest dwukrotnie wiêksza ni¿ ona sama (6). Zawdziêcza to pszczo³om robotni-com, które od¿ywiaj¹ j¹ bogatym w bia³ko mleczkiem
pszczelim. W inny sposób przebiega ¿ycie trutnia, któ-rego zadaniem jest unasiennienie matki pszczelej. Opi-sana w skrócie biologia rodziny pszczelej mog³aby wiadczyæ o posiadaniu du¿ej liczby genów. Jednak ca³y materia³ genetyczny pszczo³y zgromadzony jest w 16 chromosomach, 10 tys. genów i 265 mln. nukle-otydów (39). Ca³e to skomplikowane ¿ycie spo³eczne, kasty p³ciowe (matka, robotnica, truteñ) i wiekowe (pszczo³y ulowe, zbieraczki), ró¿na d³ugoæ ¿ycia, percepcja zmys³ów, metabolizm i zachowania uwarun-kowane s¹ tym samym genomem. St¹d te¿ wystêpuje plastycznoæ fenotypowa i aktywne mechanizmy epi-genetyczne, wród których mo¿na wyró¿niæ: metylo-wanie DNA, remodelometylo-wanie chromatyny i iRNA. Za rozró¿nienie kast bezporednio odpowiada metylowa-nie DNA, g³ówmetylowa-nie przy udziale enzymu metylotrans-ferazy DNA Dnmt3 (12).
Metylowanie DNA polega na przy³¹czeniu grupy metylowej (-CH3) do wysp CpG, czyli do regionów DNA o du¿ej frekwencji dinukleotydów CG (Cyto-zynaGuanina). Zapis CpG oznacza sekwencjê cyto-zynawi¹zanie fosfodiestroweguanina. Proces ten zachodzi przy udziale adenino- i cytozyno-specyficz-nych enzymów metylotransferaz DNA (DNMT). S-adenozylo-L-metionina (AdoMet) jest donorem grup metylowych w tej rekcji. DNMT katalizuj¹ przy³¹cze-nie grupy -CH3 do wêgla C5, atomu azotu grupy
ami-nowej N4 w obrêbie piercienia pirymidynowego
i azotu N6 w grupie aminowej adeniny. Produktami tej reakcji jest zmetylowany DNA oraz S-adenozylo--L-homocysteina (27).
Wiêkszoæ genów sk³ada siê z promotora (w³¹cznik genu) i czêci koduj¹cej (nonik w³aciwej informa-cji). Wy³¹czanie genu polega na zablokowaniu pro-motora (metylowanie). Metylowanie promotorów jest najczêstsze u cz³owieka. Pszczo³a ró¿ni siê pod tym wzglêdem od cz³owieka, gdy¿ metylowanie promo-torów u niej nie wystêpuje albo wystêpuje rzadko. Dla tych obydwu organizmów stwierdzono metylacjê w eksonach (27). Ponadto wiêkszoæ pszczelich ge-nów ma nadrzêdne miejsca metylacji w eksonach. W³anie taki sposób metylacji pozwala na regulowa-nie procesów splicingu, zmieniaj¹c aktywnoæ/ekspre-sjê genów Eukariota w odpowiedzi na czynniki ro-dowiskowe. Ma to miejsce przy takich procesach, jak: wykszta³canie opornoci, odpornoci immunologicz-nej, kszta³towanie pamiêci oraz plastycznoæ reakcji mózgu. Wykazano, ¿e te same geny w DNA robotnic i matek ró¿ni¹ siê metylacj¹ eksonów (ponad 500 ge-nów) (26, 27). W konsekwencji otrzymuje siê osobni-ki ró¿ni¹ce siê fenotypowo i genotypowo. Metylacja eksonów, tak wa¿na w przypadku cz³owieka, jest du¿o mniej poznana ni¿ metylacja promotorów genów. Jej zbadanie pozwoli³oby na rozwi¹zanie wielu klu-czowych problemów medycyny cz³owieka. Tak wiêc i w tym przypadku pszczo³a staje siê doskona³ym modelem, posiada bowiem mechanizm bêd¹cy przed-miotem zainteresowania, a pozyskanie i utrzymanie
materia³u do badañ mo¿e byæ stosunkowo ³atwe i ta-nie. Pszczo³a miodna sta³a siê równie¿ modelem do badañ epigenetycznych owadów, poniewa¿ tylko u niej wystêpuj¹ pe³ne, funkcjonalne mo¿liwoci konieczne dla metylacji CpG (np. komplet enzymów, pe³ny ze-staw miejsc do metylowania). Inne owady, takie jak muszka owocowa (Drosophila melanogaster), komar widliszek (Anopheles gambiae) i jedwabnik (Bombyx mori) nie maj¹ tych mechanizmów aktywnych lub s¹ one ograniczone (16). Na przyk³ad, u muszki owo-cowej, podstawowego obiektu badañ genetycznych, metylacja DNA jest ograniczona przede wszystkim do asymetrycznych dinukleotydów CpT i CpA oraz jest kontrolowana tylko przez dDNMT2 i metylotranfe-razê tRNAAsp, przez co zachodzi fragmentarycznie
i jest trudna do zinterpretowania (40).
U A. mellifera wystêpuje wy¿szy udzia³ sekwencji nukleotydów A + T, wysepek CpG oraz genów kodu-j¹cych metylotransferazy DNA ni¿ u wiêkszoci istot ¿ywych. Procesy zwi¹zane z metylowaniem DNA u pszczo³y i cz³owieka s¹ bardzo zbli¿one do siebie. Zarówno u cz³owieka, jak i u pszczo³y stwierdzono ponadto podobny komplet metylaz cytozyny (Dnmt1, Dnmt2, Dnmt3), st¹d pszczo³y maj¹ zdolnoæ groma-dzenia epigenetycznej informacji, która kontroluje pro-cesy dziedziczenia w sposób podobny do cz³owieka i dlatego sta³y siê one dobrym modelem do laborato-ryjnych badañ biomedycznych z zakresu epigenetyki. Enzym Dnmt1 katalizuje a¿ 97-99,9% procesu metylacji podczas mitozy (41). Odpowiedzialny jest ponadto za przenoszenie grup metylowych z AdoMet do cytozyny zlokalizowanej na niezmetylowanej nici potomnej, przekazanie sta³ego profilu metylacji oraz rozpoznanie hemimetylowanych dinukleotydów CpG na potomnej i matczynej nici DNA. Dnmt2 nie posia-da w³aciwoci katalitycznych, pomimo podobieñstwa w strukturze. Dnmt3 odpowiada za metylacjê de novo i jest najbardziej aktywna podczas rozwoju embrio-nalnego (30, 41). U pszczó³ zidentyfikowano trzy ortologi DNMT: AmDnmt3, AmDnmt1a i AmDnmt1b. Te dwa ostatnie w 70% s¹ identycznymi, ~ 1400-ami-nokwasowymi proteinami, które w 55% s¹ identyczne z ludzk¹ DNMT1. Z kolei pszczele AmDNMT3 ma po-dobne sekwencje do ludzkich hDNMT3A i hDNMT3B, z, odpowiednio, 33% i 32% podobieñstwem ca³ego genu oraz z 61% i 66% podobieñstwem domeny kata-litycznej (40). U pszczó³ inhibicja dwóch enzymów: deacetylazy histonów oraz DNMT wp³ywa na spowol-nienie funkcji mózgu, synaptycznej plastycznoci oraz utrudnia zapamiêtywanie (25). Zahamowanie procesu metylacji poprzez wyciszenie genu DNMT prowa-dzi ponadto do rozwoju larw pszczelich w kierunku matki. Czynniki hamuj¹ce metylacjê DNA wykryto w mleczku pszczelim, wydzielinie gruczo³ów gardzie-lowych stanowi¹cej pokarm larw i matek (18, 19). W ten sposób udowodniono równie¿, i¿ sk³adniki diety oraz inne czynniki rodowiska mog¹ wp³ywaæ na geny i d³ugoæ ¿ycia (16, 33). Poziom metylacji
zmienia siê wraz z wiekiem poszczególnych osobni-ków u ró¿nych kast. Jest on wy¿szy u osobniosobni-ków do-ros³ych ni¿ u larw, np.: procent zmetylowania genomu robotnicy w stadium larwy wynosi 3,3%, a u doros³ej 5,5%; u matki: larwa 3,0%, doros³a 5,3%. Jed-nym z genów, które s¹ w ró¿ny sposób regulowane na poziomie stadium rozwojowego oraz kasty jest gen Hex110. U A. mellifera wystêpuj¹ cztery heksamery-ny: 70a, 70b, 70c i 110. Pierwsza z nich wystêpuje zarówno u larw (w ich surowicy), jak i form doros³ych (w ich ciele t³uszczowym), a pozosta³e trzy maj¹ wy-soki poziom w okresie larwalnym, a potem ich po-ziom drastycznie maleje. Dodatkowo, heksameryna 110 wp³ywa na rozwój jajników, a ekspresja genu Hex110 jest obserwowana u matek oraz u robotnic z rodzin, w których brakowa³o matki i rozwija³y siê u nich jajniki. Gen ten jest bardziej metylowany u osob-ników doros³ych ni¿ u larw. Gen Hex110 ma tylko dwie wyspy CpG, jedn¹ zlokalizowan¹ w regionie 5 w transkrypcyjnym i translacyjnym miejscu startu, a drug¹ w regionie 3 zawieraj¹cym kodon stop. U cz³o-wieka metylacja wysp CpG w regionie promotorowym koreluje z aktywnoci¹ transkrypcyjn¹ oraz z aktyw-noci¹ genów na nieaktywnym chromosomie X u ko-biet. Z kolei u pszczó³ ich metylacja zachodzi na niskim poziomie, tak jak ma to miejsce w przypadku regionu 5 w Hex110 (16). Beye i wsp. (4) podaj¹, ¿e u pszczo³y miodnej tempo rekombinacji (wymiana odcinków chromosomów homologicznych, czyli po mieszaniu siê genomu samicy i samca) w porównaniu z innymi zwierzêtami oraz ludmi jest dziesiêciokrot-nie bardziej intensywne. Próbuje siê to wyjaniæ ma³¹ zmiennoci¹ genetyczn¹ w rodzinie, gdy¿ wszystkie robotnice pochodz¹ od jednej matki. Pszczo³y maj¹ wielu ojców, nawet 44 w jednej rodzinie. System determinacji p³ci okaza³ siê bardzo z³o¿ony. Przyjête zosta³o, ¿e matka odgrywa g³ówn¹ rolê, samice roz-wijaj¹ siê z zap³odnionych, za trutnie z niezap³od-nionych jajeczek. Okaza³o siê to nie do koñca prawd¹, poniewa¿ decyduj¹cy o p³ci gen csd ma wiele alleli. Jeli spotka³yby siê ró¿ne allele, to powstaje samica, za jeli te same samiec. W przypadku, gdyby spot-ka³y siê dwa te same allele, larwa trutnia wydziela³aby substancjê kanibalizmu i by³a zjadana przez robotnice lub powstawa³by niep³odny samiec (5, 42).
U pszczó³ 80% genów podlegaj¹cych metylacji znaj-duje siê w mózgu (1). Metylacja u A. mellifera wy-daje siê ograniczona do cytozyny zwi¹zanej z CpG dinukleotydu. Z ponad 60 mln cytozyn znajduj¹cych siê w genomie pszczó³ miodnych tylko ok. 70 tys. jest metylowanych (26). Jak ju¿ wspomniano, wiêkszoæ z nich ma nadrzêdne miejsca metylacji w eksonach. Taki oszczêdny system metylacji stwarza unikalne mo¿liwoci do badania procesu metylacji na modelu znacznie prostszym ni¿ wiêkszoæ rolin i zwierz¹t laboratoryjnych, a przede wszystkim ni¿ cz³owiek. Lyko i wsp. (26) wykazali, ¿e u matek poziom metyla-cji cytozyny w mCG w eksonach wynosi 8,6% mCGs,
za w intronach zaledwie 0,2% mCGs, natomiast u ro-botnic, odpowiednio, 8,16% mCGs i 0,22% mCGs. Ponadto doszli do wniosku, ¿e metylacja poza miej-scami CpG w genomie pszczó³ jest bardzo rzadka albo nawet nie istnieje. Przeprowadzone przez nich badania wykaza³y, ¿e poziom metylacji CpG w DNA mózgu matki i robotnicy jest zbli¿ony, gdy¿ wynosi, odpowiednio, 69 064 i 68 222 CG, a u obu tych kast 54 312 CG. Ponad 550 genów wykazuje znacz¹ce ró¿-nice miêdzy metylacj¹ matek i robotnic, co mo¿e przy-czyniæ siê do du¿ych rozbie¿noci w zachowaniu. W porównaniu z liczb¹ metylowanych cytozyn cz³o-wieka, u pszczó³ wystêpuje ich oko³o trzy razy mniej. Okaza³o siê, ¿e w przeciwieñstwie do intensywnej metylacji genomu cz³owieka, tylko niewielkie i kon-kretne odcinki genomu pszczo³y miodnej s¹ metylo-wane (26). Wang i Leung (41) ponadto wykazali, ¿e w genach o niskim poziomie wysp CpG (obserwowa-ne/oczekiwane; < 0,82), relatywnie wystêpuje mniej-sza zawartoæ GC. Z kolei przy wysokiej zawartoci GC (48%) w genach zawartoæ CpG wynosi³a 1,1 do 1,3. Dla promotorów genów przy wysokiej zawar-toci CpG (obserwowane/oczekiwane) stosunek ten wynosi 1,63 ± 0,11, natomiast przy niskiej zawartoci 1,17 ± 0,2 (41). Szacuje siê, ¿e u pszczó³ oko³o 35-40% genów wykazuje deficyt grup CpG. Geny ze wskani-kiem CpGO/E < 0,8 s¹ uznawane za metylowane.
Nie zmetylowane CpG zosta³y natomiast wykryte w wybranych eksonach genów z CpGO/E > 1,0, co su-geruje, ¿e geny te nie s¹ zmetylowane, a ich metylacja jest ograniczona do cile okrelonego stadium roz-woju lub zachodzi w wyspecjalizowanych grupach komórek. Ponadto, dwa z szeciu badanych genów z CpGO/E > 1,0 ma wyspy CpG w regionie od strony kodonu ATG (13). Zmetylowane geny mia³y wiêcej ortologów i wykazywa³y wiêksz¹ ochronê sekwencji DNA ni¿ geny z nielicznymi metylacjami. Metylacja DNA zwiêksza wystêpowanie mutacji w miejscach CpG i mo¿e prowadziæ do szybkiej rozbie¿noci sek-wencji DNA. Jednym z mo¿liwych wyjanieñ tego faktu jest, ¿e ortologi z konsekwentnie niskim pozio-mem CpGO/E w drodze ewolucji maj¹ mniej ca³ocio-wo CpG dinukleotydów ni¿ metylacji genów z pored-nim CpGO/E, a tym samym nowe mutacje nie zachodz¹ u nich w porównywalnym tempie (15). Metylacja u A. mellifera zachodzi wy³¹cznie dla dinukleotydów CpG, które wykazuj¹ dwumodalny rozk³ad oraz de-aminacjê metylowanych CpG do TpG (CpA w uzu-pe³niaj¹cej nici), co powoduje mutacje GC-do-AT. O ile wiadomo, ten molekularny mechanizm jest uni-kalny dla genomu A. mellifera w porównaniu z zsek-wencjonowanymi genomami innych owadów. Geny o niskiej i wysokiej zawartoci CpG (low-CpG i high--CpG) s¹ zaanga¿owane w ró¿ne procesy biologiczne. Geny low-CpG s¹ charakterystyczne dla hipermetyla-cji i s¹ szczególnie wa¿ne dla metabolizmu, ubikwity-nacji, ekspresji genów i translacji. Z kolei geny high--CpG uczestnicz¹ przede wszystkim w hypometylacji
i s¹ istotne w procesach rozwoju, w komunikacji ko-mórkowej i adhezji (12). Zaskakuj¹cy jest fakt, i¿ geny low- i high-CpG znacznie ró¿ni¹ siê d³ugoci¹ i red-nio geny high-CpG s¹ piêæ razy d³u¿sze ni¿ low-CpG. rednio d³ugoæ genów (gene body) low-CpG wynosi 2,815; a w high-CpG 15,118 (stosunek high-CpG/ low-CpG = 5,37), przy czym d³ugoæ eksonów w high--CpG jest równa 1,837; a intronów a¿ 13,281, a w przy-padku low-CpG: eksony 1,626, introny 1,189 (43). Oko³o jedna trzecia genów u A. mellifera mo¿e byæ metylowana w dinukleotydach CpG w regionach in-tragenic konserwatywnych genów, które bior¹ udzia³ w kluczowych funkcjach biologicznych organizmu. Badania Foreta i wsp. (13) sugeruj¹, ¿e metylacja DNA jest staro¿ytnym epigenetycznym mechanizmem, który zosta³ dostosowany do nowoczesnej sieci regu-lacyjnej procesów molekularnych network. Tak wiêc, wyniki te wykraczaj¹ poza epigenetykê i ³¹cz¹ system network u wspó³czesnych zwierz¹t ze z³o¿onoci¹ pro-cesów podczas ewolucji wielokomórkowych organiz-mów. W tym kontekcie pojawi³a siê nowa dziedzina nauki epigenomika owadów, która, byæ mo¿e, bêdzie szczególnie przydatna w odkryciu i poznaniu podsta-wowych mechanizmów na poziomie rodowiska (13).
Geny, epigeny a uk³ad nerwowy
Rozwój systemu nerwowego pszczó³ nie jest ade-kwatny do ich ma³ej liczby genów. Uk³adem ner-wowym, funkcjami mózgu i zachowaniem osobnika kieruj¹ neuropeptydy. U pszczo³y zidentyfikowano oko³o 100 takich bia³ek, które s¹ produktami 6 genów. Za ukszta³towanie pamiêci u pszczó³ odpowiadaj¹ neurotransmitery i mediatory (37). S¹ one podobne do tych, które wystêpuj¹ u cz³owieka (21). Ze wzglêdu na spo³eczne zachowanie pszczo³y jest ona jednym z najlepszych modeli w badaniach procesu zapamiê-tywania i uczenia siê (22, 29). Te badania wykorzys-tuje siê tak¿e dla potrzeb medycyny. Mózg doros³ej pszczo³y jest plastyczny, zmienia swoje rozmiary/ob-jêtoæ wraz z wiekiem i odpowiada za zachowania behawioralne w ich ¿yciu (28). U krêgowców wraz z wiekiem zachodzi wzmo¿ona metylacja miejsc pro-motorowych w DNA, prowadz¹ca do obni¿enia funk-cji poznawczych danego osobnika. W mózgu pszczó³ metylacja DNA nie jest sprzê¿ona z wiekiem chrono-logicznym i z obni¿eniem funkcji poznawczych. Na metylacjê u starych pszczó³ szczególnie wp³ywa licz-ba wysp CpG (9 sztuk) (24). Oprócz procesu metyla-cji DNA za pamiêæ d³ugoterminow¹ oraz za uczenie siê, tak dobrze rozwiniête u pszczo³y (14), odpowia-daj¹ równie¿ posttranslacyjne modyfikacje histonów (25).
Metylacja DNA jest procesem, który wzmaga pa-miêæ d³ugoterminow¹ (uczenie siê i zapamiêtywanie). Model uczenia siê u pszczó³ jest podobny do tego u krêgowców (11). Wiêkszoæ owadów ma dobrze roz-winiêt¹ pamiêæ krótkoterminow¹, jednak pszczo³y, które ¿yj¹ kilka miesiêcy (g³ównie pszczo³y zimowe)
maj¹ równie¿ dobrze rozwiniêt¹ pamiêæ d³ugotermi-now¹ (14). Lockett i wsp. (23) stwierdzaj¹, ¿e za kon-trolê epigenetyczn¹ pamiêci odpowiadaj¹ wspomnie-nia, po¿¹dania wêchowe pszczó³. Ka¿da z pamiêci, zarówno krótko-, jak i d³ugotrwa³a, wymagaj¹ odmien-nych DNMT. Nabycie i zanik pamiêci to procesy, które wymagaj¹, z jednej strony, tych samych komó-rek i molekularnych mechanizmów, a z drugiej strony ka¿dy z nich anga¿uje unikalne/odmienne mecha-nizmy. Stres u pszczó³ uwarunkowany straszeniem wp³ywa na wzrost aktywnoci transkrypcyjnej de novo DNMTs i tym samym zwiêksza liczbê metylowanych CpG, a w konsekwencji determinuje proces uczenia siê i zapamiêtywania, podobnie jak dzieje siê to u krê-gowców. Wyniki Locketta i wsp. (25) wskazuj¹, ¿e szczególnie wa¿na w tym procesie jest Dnmt3, której iloæ zwiêksza siê (g³ównie w cia³kach grzybowatych mózgu) w wyniku trenowania/tresowania pszczó³.
U owadów szczególnie istotn¹ funkcjê pe³ni¹ trzy biogenne neurochemiczne aminy: oktopamina (OA), dopamina i serotonina (9). Uczestnicz¹ one w proce-sach zapamiêtywania, uczenia siê, stanach pobudze-nia oraz w stanach behawioralnych (2). Szczególnie wysoki poziom OA oraz dopaminy i ich prekursora dihydroksyfenyloalaniny zaobserwowano u pszczó³ lotnych. Zwi¹zki te s¹ modulatorami (charakterystycz-nego) tañca robotnic powracaj¹cych do ula z py³kiem. Jak siê okazuje, OA jest wra¿liwa na poziom sacha-rozy i tym samym wzmacnia zapamiêtywanie drogi do po¿ytku (3). Poziom amin wspomagany jest przez 3-kinazê 1,4,5-trifosforanow¹ oraz jony wapnia, które bior¹ udzia³ w kaskadzie IP3 do IP4. Wszystkie te pro-cesy (mobilizacja Ca2+, rozk³ad fosfatydyloinozytolu,
formowanie cyklicznych nukleotydów, synteza nowych bia³ek) nak³adaj¹ siê na siebie i zmieniaj¹ na pozio-mie molekularnym (signalling network) funkcje m³o-dych pszczó³ w kierunku dojrza³ych osobników (20). W uk³adzie nerwowym ssaków najbardziej pobu-dzaj¹cym neurotransmiterem jest L-glutaminian (Glu). Coraz wiêcej dowodów potwierdza koncepcjê, ¿e glu-taminian jest tak¿e u¿ywany do komunikacji synap-tycznej w orodkowym uk³adzie nerwowym, obok swojej ugruntowanej roli w nerwowo-miêniowych po³¹czeniach. Zsekwencjonowanie genomu wykaza³o wysoce konserwatywne geny koduj¹ce zarówno jono-tropowe, jak i metabotropowe receptory glutaminia-nu oraz immunoreaktywnoæ glutaminianopodobn¹ w mózgu pszczó³ (36). W mózgu pszczó³ glutaminian wraz z kwasem ã-aminomas³owym (GABA) i acety-locholin¹, s¹ najbardziej rozpowszechnionymi neuro-przekanikami u doros³ych osobników, osi¹gaj¹c naj-wy¿szy poziom oko³o 10. dnia ¿ycia. Transmisja glu-taminergiczna jest istotn¹ funkcj¹ uk³adu nerwowego pszczó³ i podlega wysoce konserwatywnej regulacji poprzez molekularne komponenty glutamatergic net-work. System glutaminergiczny jest zaanga¿owany w proces uczenia siê i zapamiêtywania. Ju¿ niewiel-kie iloci substancji po³¹czone i odebrane przez
re-ceptory glutaminianowe wp³ywaj¹ na zachowania be-hawioralne pszczó³ (21). Receptory N-metylo-D-aspa-raginowe (NMDA) integralnie wi¹¿¹ glutaminian, co powoduje trwa³e zmiany w funkcji synaps i os³abia uczenie siê i pamiêæ (36). Badania Jones i wsp. (17) wskazuj¹, ¿e na rozwój mózgu oraz na procesy zapa-miêtywania wp³ywa równie¿ temperatura wewn¹trz rodziny. Pszczo³y utrzymywane w temperaturze 35--36°C szybciej ucz¹ siê i zapamiêtuj¹ (pamiêæ krótko-terminowa) ni¿ pszczo³y wychowane w temperaturze 32-33°C.
Geny odpowiedzialne za zegar biologiczny pszczo-³y s¹ mniej podobne do tych u owadów, natomiast bar-dziej zbli¿one do tych wystêpuj¹cych u krêgowców (31, 35). Biochemiczne mechanizmy procesu podzia-³u komórek i odtwarzania tkanek oraz zwi¹zane z nimi telomerazy s¹ równie¿ bardzo podobne u cz³owieka i pszczo³y (34).
Dziêki specyficznym mechanizmom epigenetycz-nym dzia³aj¹cym w niewielkim genomie pszczo³y mo¿e ona byæ modelowym obiektem do badañ epige-netycznych, modelem do rozwi¹zania takich proble-mów zdrowotnych ludzi, jak: choroby nowotworowe, genetyczne, metaboliczne, naczyniowe, neurologicz-ne, immunologiczne. Tak¿e diagnostyka tych chorób mo¿liwa jest ze wzglêdu na wystêpowanie wzorów metylacji, które informuj¹ o stanie aktywnoci genów oraz o sposobie ich aktywacji i inhibicji. Wiedza na ten temat ma istotne znaczenie w produkcji leków, okrelaniu wp³ywu czynników rodowiskowych na genom, w ocenie wieku i stanu rozwojowego komó-rek. Metylacji przypisuje siê du¿¹ wartoæ technolo-giczn¹ ze wzglêdu na stabilnoæ cz¹steczki DNA; dziê-ki temu mo¿e ona staæ siê bardzo dobrym markerem do przeprowadzania rutynowej diagnostyki medycz-nej i molekularmedycz-nej.
Pimiennictwo
1.Barchuk A., Cristino A., Kucharski R., Costa L., Simoes Z., Maleszka R.: Molecular determinants of caste differentiation in the highly eusocial honey-bee Apis mellifera. BMC Dev. Biol. 2007, 7, 70-89.
2.Barron A., Maleszka J., Meer R., Robinson G., Maleszka R.: Comparing injection, feeding and topical application methods for treatment of honeybee with octopamine. J. Insect Physiol. 2007, 53, 187-194.
3.Barron A., Maleszka R., Meer R., Robinson G.: Octopamine modulates honey bee dance behavior. Neuroscience 2007, 104, 1703-1707.
4.Beye M., Gattermaier I., Hasselmann M., Gempe T., Schioett M., Baines J., Schilipalius D., Mougel F., Emore Ch., Rueppell O., Srivio A., Guzman--Navoa E., Gunt G., Solignac M., Page R.: Exceptionally high levels of recombination cross in the honey bee genome. Genome Res. 2006, 16, 1339--1344.
5.Beye M., Hunt G. J., Page R. E., Fondrk M., Grohmann L., Moritz R.: Unusually high recombination rate detected in the sex locus region of the honeybee (Apis mellifera). Genetics 1999, 153, 1701-1708.
6.Borsuk G.: Przegl¹d wybranych zagadnieñ z badañ etologicznych w pszcze-larstwie. Kosmos 2011, 60, 401-413.
7.Burzyñski S. R.: Geny ¿ycia. Wyd. Farmapress, Warszawa 2008, 16-77. 8.Burzyñski S. R.: Practical application of gene silencing theory of aging:
life extension in animal testing and human clinical trails. Anti-Ageing Med. Therap. 2009, 11, 1-8.
9.Cayre M., Buckingham S., Yagodin S., Sattelle D.: Cultured insect mush-room body neurons express functional receptors for acetylocholine, GABA, glutamate, octopamine, and dopamine. J. Neurophysiol. 1999, 81, 1-14.
10.De la Rua P., Jaffe R., Dall Olio R., Munoz I., Serrano J.: Biodiversity, conservation and current threats to European honeybees. Apidologie 2009, 40, 263-284.
11.Dyer A. G., Neumeyer C., Chittka L.: Honeybee (Apis mellifera) vision can discriminate between and recognise images of human faces. J. Exp. Biol. 2005, 208, 4709-4714.
12.Elango N., Hunt B. G., Goodisman M., Yi S.: DNA methylation in widespread and associated with differential gene expression in castes of the honeybee, Apis mellifera. PNAS Early Edition 2009, doi/10.1073/pnas.0900301106. 13.Foret S., Kucharski R., Pittelkow Y., Lockett G., Maleszka R.: Epigenetic
regulation of the honey bee transcriptome: unraveling the nature of methylated genes. BMC Genomics 2009, 472, 1-11.
14.Giurfa M.: The amazing mini-brain: lessons from a honey bee. Bee World 2003, 84, 5-18.
15.Hunt B., Brisson J., Yi S., Goodisman M.: Functional conservation of DNA methylation in the Pea Aphid and the Honeybee. Genome Biol. Evol. 2010, 2, 719-728.
16.Ikeda T., Furukawa S., Nakamura J., Sasaki M., Sasaki T.: CpG methylation in the hexamerin 110 gene in the European honeybee, Apis mellifera. J. Insect Sci. 2011, 74, 1-11.
17.Jones J., Helliwell P., Beekman M., Maleszka R., Oldroyd B.: The effects of rearing temperature on developmental stability and learning and memory in the honey bee, Apis mellifera. J. Comp. Physiol. A 2005, 191, 1121-1129. 18.Kamakura M.: Royalactin induces queen differentiation in honeybees. Nature
2011, 473, 478-483.
19.Kucharski R., Maleszka J., Foret S., Maleszka R.: Nutritional control of reproductive status in honeybees via DNA Methylation. Science 2008, 319, 1827-1830.
20.Kucharski R., Maleszka R.: Molecular profiling of behavioural development: differential expression of mRNAs for inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase isoforms in naïve and experienced honeybees (Apis mellifera). Mol. Brain Res. 2002, 99, 92-101.
21.Kucharski R., Mitri C., Grau Y., Maleszka R.: Characterization of a metabo-tropic glutamate receptor in the honeybee (Apis mellifera): implication for memory formation. Invert. Neurosci. 2007, 7, 99-108.
22.Lipiñski Z.: Istota oraz mechanizm porzucania gniazd przez roje pszczó³ miod-nych. Blenam, Olsztyn 2002.
23.Lockett G., Helliwell P., Maleszka R.: Involvement of DNA methylation in memory processing in the honey bee. Learning Memory 2010, 21, 812-816. 24.Lockett G., Kucharski R., Maleszka R.: DNA methylation changes elicited by social stimuli in the brains of worker honey bees. Genes, Brain and Beha-vior 2011, doi:10.1111/j.1601-183X.2011.00751.x.
25.Lockett G., Wilkes F., Maleszka R.: Brain plasticity, memory and neurologi-cal disorders: an epigenetic perspective. Neuro Report 2010, 21, 909-913. 26.Lyko F., Foret S., Kucharski R., Wolf S., Falckenhayn C., Maleszka R.: The
Honey Bee Epigenomes: Differential Methylation of Brain DNA in Queens and Workers. PlosBiology 2010, 8, 1-12.
27.Lyko F., Maleszka R.: Insects as innovative models for functional studies of DNA methylation. Trends Genetics 2011, 27, 127-164.
28.Maleszka J., Barron A., Helliwell P., Maleszka R.: Effect of age, behavior and social environment on honey bee brain plasticity. J. Comp. Physiol. A 2009, 195, 733-740.
29.Menzel R., Giurfa M.: Cognitive architecture of a mini-brain: the honeybee. Trends Cogn. Sci. 2001, 5, 62-71.
30.Miklos G., Maleszka R.: Epigenomic communication system in human and honey bee: From molecules to behavior. Hormones and Behavior 2011, 59, 399-406.
31.Pahl M., Zhu W., Pix W., Tautz J., Zhang S.: Circadian timed episodic-like memory a bee knows what to do when, and also where. J. Exp. Biol. 2007, 210, 3559-3567.
32.Paleolog J.: Pszczo³y ochrona zasobów genetycznych, [w:] Litwiñczuk Z.: Ochrona zasobów genetycznych zwierz¹t gospodarskich i dziko ¿yj¹cych. PWRiL, Warszawa 2011.
33.Paleolog J., Strachecka A., Burzyñski S., Olszewski K., Borsuk G.: The larval diet supplemented with the low-molecular epigenetic switch sodium phenylacetylglutaminate influences the worker cuticle proteolytic system in Apis mellifera L. J. Apic. Sci. 2011, 55, 73-83.
34.Robertson H., Gordon K.: Canonical TTAGG-repeat telomeres and telome-rase in the honey bee, Apis mellifera. Genome Res. 2006, 16, 1345-1351. 35.Shemesh Y., Cohen M., Bloch G.: Natural plasticity in circadian rhythms
is mediated by reorganization in the molecular clockwork in honeybees. FASEB J. 2007, 21, 2304-2311.
36.Si A., Helliwell P., Maleszka R.: Effect of NMDA receptors antagonists on olfactory learning and memory in the honeybee (Apis mellifera). Pharmacol. Biochem. Behav. 2004, 77, 191-197.
37.Si A., Zhang S., Maleszka R.: Effect of caffeine on olfactory and visual learning in the honey bee (Apis mellifera). Pharmacol. Biochem. Behav. 2005, 82, 664-672.
38.Tautz J.: Fenomen pszczó³ miodnych. Galaktyka, £ód 2008.
39.The Honeybee Genome Sequencing Consortium: Insight into social insects from the genome of the honeybee Apis mellifera. Nature 2006, 443, 931--949.
40.Wang Y., Jorda M., Maleszka R., Ling X., Robertson H., Mizzen C., Peina-do M., Robinson G.: Functional CpG methylation system in a social insect. Science 2006, 314, 645-647.
41.Wang Y., Leung F.: In silico prediction of two classes of honeybee genes with CpG deficiency or CpG enrichment and sorting according to gene ontology classes. J. Mol. Evol. 2009, 68, 700-705.
42.Woyke J.: Diploid drone substance cannibalism substance. XXI Intern. Apicult. Congr., Univ. Maryland, USA, 1967, a. Abstracts: 57-58, b. Pro-ceedings, Apimondia Publ. House, Bucharest, Romania: 471-4 AA 681/1967. 43.Zeng J., Yi S.: DNA methylation and genome evolution in honeybee: gene length, expression, functional enrichment covary with the evolutionary signature of DNA methylation. Genome Biol. Evol. 2010, 2, 770-780. Adres autora: dr Aneta Strachecka, ul. Akademicka 13, 20-950 Lublin; e-mail: aneta.strachecka@up.lublin.pl
