A C T A U N I V E R S I T A T I S N I C O L A I C O P E R N I C I ZABYTKOZNAW STWO I KONSERW ATORSTW O X XI
N A U K I HUM ANISTYCZNO-SPOŁECZNE — ZESZYT 270 — 1994
Zakład Technologii i Technik Malarskich
Zbigniew B rochw icz
ZASTOSOW ANIE BARWNIKÓW ORGANICZNYCH JA K O CZYNNIKÓW KONTROLNYCH
W BIBUŁOW EJ CHROM ATOGRAFII SPŁY W O W EJ C IĄ G ŁEJ W RAMACH ID EN TY FIK A CJI
WĘGLOWODANOWYCH SPO IW M ALARSKICH *
W chrom atografii jednokierunkow ej w łaściw ej odróżnia się, obok chrom atografii w stępującej, rów nież chrom atografię spływ ow ą lub in a czej zstępującą. W tym drugim przypadku w procesie rozw ijania chro- m atogram ów rozpuszczalnik (faza ruchom a — organiczna), znajdujący się w odpow iednim naczyniu (rynience) w górnej części kom ory (rys. 1), spływ a w zdłuż paska b ibuły w dół. P rzepływ rozpuszczalnika zachodzi pod w pływ em działania sił ciężkości. Ogólnie chrom atografię spływow ą (zstępującą) określa się m ianem techniki spływ ow ej. Rozwijanie chro- m atogram ów w technice spływ ow ej prow adzić m ożna trzem a sposobami:
a. P rzez jednokrotne rozw ijanie chrom atogram ów w w ybranym u k ła dzie rozw ijającym i przerw anie tego procesu przed spływ em fazy orga nicznej do końca paska. W ten sposób czoło rozpuszczalnika spływ a do pew nej określonej długości paska (ca 2— 3 cm od dolnego jego brzegu). Po w yjęciu z kom ory czoło rozpuszczalnika jest oznaczane ołówkiem bądź to w św ietle białym , bądź też w prom ieniach UV. M ając dokładnie zazna czone czoło rozpuszczalnika można dokładnie obliczyć R( dla każdego składnika badanej substancji.
b. P rzez w ielokrotne rozw ijanie chrom atogram ów w jednym i tym sam ym układzie rozw ijającym , bądź też w dw óch różnych układach, stosow anych n a przem ian. Mimo stosunkow o długiego okresu rozw ijania chrom atogram ów , m etoda ta znacznie przew yższa rozw ijanie jednokrot ne, szczególnie w tedy, gdy chrom atograficznem u rozdziałowi podlegają m ieszaniny zaw ierające składniki trudno rozdzielające się na chrom
ato-* Część doświadczalną niniejszej pracy wykonano w latach 1978 i 1979, nato m iast jej ostateczną redakcję i przygotowanie do druku zrealizowano na przełomie 1989 i 1990 r.
Rys. 1. Schemat komory „Chropa” produkcji NRD do rozw ijania chromatogramów techniką spływową
gram ie w rozw ijaniu jednokrotnym . W yniki uzyskane m etodą w ielo krotnego rozw ijania chrom atogram ów z cukram i prostym i techniką w stę pującą świadczą o tym najlepiej. W w ariancie tym stosuje się rozw ija nie 2— 3-krotne, a w niektórych przypadkach w ielokrotność ta może być zwiększona. P rzy ty m w ariancie technicznym traci się jednak możliwość stosow ania tzw. w spółczynnika podziału Rf poszczególnych składników , a to z tego względu, że po w ielokrotnym rozw ijaniu tru d n o je st za każ dym razem uzyskać czoło rozpuszczalnika w identycznej odległości od linii startow ej. W takim przypadku stosuje się więc w prak ty ce inny w spółczynnik podziału niż Rfl a m ianowicie R 0, gdzie o = w y b ran y zwią
Zastosowanie barw ników organicznych.. 9 zek, w stosunku do którego oblicza się współczynnik podziału innych sk ła d n ik ó w 1. Odnosi się to zarówno do chrom atogram ów rozw ijanych w ielokrotnie techniką w stępującą, jak i spływową.
c. Przez chrom atografię spływ ow ą ciągłą, polegającą na tym , że faza
ruchom a (organiczna) spływ a z bibuły chrom atograficznej do pakietu bibuły, bądź też ligniny, ułożonego na dnie kom ory chrom atograficznej. Zw isająca z ry n ien k i bibuła sty k a się z pakietem , k tó ry p rzy jm u je nad m iar rozpuszczalnika spływ ającego z bibuły. Również i w tym przypadku stosuje się w prak ty ce ten sam w spółczynnik podziału, o k tórym w spom niano wyżej.
Pierw sze dw a w a rian ty m ają wiele w ad i na ogół ustęp u ją technice w stępującej, natom iast w arian t ostatni znacznie je przewyższa. Stosuje się go na ogół w tych przypadkach, gdy m.a się do czynienia z m ieszaniną związków tru d n o rozdzielających się na chrom atogram ie. U jem ną stroną chrom atografii spływ ow ej ciągłej jest b ra k kontroli nad m igracją n a j szybciej m igrującego związku w badanej m ieszaninie. U stalenie w łaści wego czasu rozw ijania chrom atogram ów , w k tórym następ u je optym alny rozdział związków badanej substancji w danym układzie rozw ijającym , a jednocześnie najszybciej w ędrujący składnik pozostaje jeszcze n a bi bule, jest bardzo istotne w tego rodzaju badaniach. Można by, co p raw da, na podstaw ie w ielu doświadczeń ustalić dla całego tego procesu od pow iedni czas rozw ijania chrom atogram ów , p ra k ty k a w ykazuje jednak, że w yniki mogą być z w ielu względów niepow tarzalne. Na szybkość m i gracji badanych związków w procesie ich chrom atograficznego rozdziału w pływ a w iele param etrów , m iędzy innym i tem p e ra tu ra pomieszczenia, w k tó ry m ten proces się odbyw a 2.
Przedm iotem niniejszego arty k u łu jest zastosowanie odpowiednich układów rozw ijających w procesie chrom atograficznego rozdziału cukrów prostych przy użyciu techniki spływ ow ej ciągłej, z jednoczesnym zasto sow aniem odpow iednich czynników kontrolnych, pozw alających śledzić czas m igracji najszybciej w ędrującego cukru, to znaczy 1-ramnozy. Cu k ie r ten, jak w ykazuje lite ra tu ra przedm iotu oraz w łasne badania, w przew ażającej części układów rozw ijających w ęd ru je najszybciej, i to zarówno w technice w stępującej, jak i spływ ow ej. Jako. czynniki
kon-j _ odległość od środka plamy do miejsca sta rtu związku X ° odległość od środka plamy do miejsca startu związku O
g d z ie : X — b a d a n y zw iązek, O — w zorcow y zw iązek. T yp o w y m p rz y k ła d e m m oże b y ć np. w sp ó łcz y n n ik p o d ziału RGlik. sto so w a n y w b ib u ło w ej c h ro m a to g ra fii ro zdzielczej c u k ró w p ro sty c h :
odległość przebyta przez badany cukier ^ Gllk- odległość przebyta przez cukier wzorcowy
T a k im zw iązkiem w zo rco w y m w c h ro m a to g ra fii c u k ró w p ro s ty c h b y w a często d -glikoza. Z o b .: C h ro m a to g ra fia , po d re d . J. O p ierisk iej-B lau th , A. W ak sm u n d zk ieg o i M. K ańskiego, PW N, W arszaw a 1957, s. 381 i 597.
trolne zastosowano dostępne barw niki organiczne, zarówno rozpuszczal ne w wodzie, ja k i w alkoholu etylow ym . W trakcie badań porównano szybkość m igracji 1-ram nozy i odpowiednio dobranych barw ników , k tó ry ch m igracja w technice spływ ow ej pow inna być taka sam a lub nieco szybsza. Odpowiednio dobrany barw nik, dobrze widoczny w trakcie m i gracji na bibule chrom atograficznej jako barw na plam a, jest w łaśnie czynnikiem kontrolnym pozw alającym ustalić każdorazowo w łaściw y czas rozw ijania chrom atogram ów .
CZĘSC DOŚWIADCZALNA
WYBÓR UKŁADÓW ROZWIJAJĄCYCH
W pracach dośw iadczalnych stosowano następujące układ y rozpusz czalników:
1. O ctan ety lu + lod. kw as octowy 4- w oda (3:1:3)3. 2. N -butanol + p iry d y n a + w oda (5:3:1)4.
3. O ctan ety lu + p iry d y n a + woda (3,6:1:1,15) s.
4. O ctan ety lu + p iry d y n a + woda + 80-procentow y kw as octowy (8:3:8:0,5) 6.
CHARAKTERYSTYKA POSZCZEGÓLNYCH UKŁADÓW ROZWIJAJĄCYCH
1. U kład pierw szy — octan ety lu + lod. kw as octow y + w oda (3:1:3) —
m a odczyn kw aśny; pH fazy organicznej świeżo przygotow anego układu w ynosi 2,3 7. S kładniki tego układu nie łączą się ze sobą całkowicie, stąd też po w laniu ich do rozdzielacza należy całość energicznie w ytrząsnąć i pozostawić na kilka godzin do całkow itego rozdzielenia się dw óch faz — fazy górnej, zw anej organiczną, i fazy dolnej, zw anej fazą wodną. Po całkow itym rozdzieleniu się tych dwóch faz dolną ostrożnie zlewa się z rozdzielacza do zlew ki i stosuje się do nasycenia kom ory w czasie chro- m atografow ania, górnej zaś używ a się do rozw ijania chrom atogram ów .
Ze względu na m ałą lepkość octanu etylu układ ten ch arak tery zu je szybka m igracja na bibule. W adą tego układu jest jego m ała trw ałość:
s Wg M. A. Jerm yn, F. A. Isherwood, Biochem. J., 44, 402 (1949).
1 Z. Brochwicz, G um y roślinne jako spoiwa m alarskie w świetle daw nych tra k
tatów, ich własności oraz identyfikacja w zabytkow ych polichromiach, M ateriały
Zachodniopomorskie, t. 9, (Szczecin) 1963, s. 534, przyp. 158.
5 Wg P. Colombo, D. Corbetta, A. Pirotta, G. Ruffini, A. Sartori, J. Chromatogr., t. 3, 1960, n r 4, s. 343—350.
* Wg M. Pietrusiewicz, E. Pidek, Nowy układ do chromatograficznego rozdziału
glikozam iny, glikozy, galaktozy, m annozy, arabinozy i ram nozy, Chemia Analitycz
na, 1962, n r 7 (1007).
7 Pom iar pH w ykonał m gr G. Jaw orski w Zakładzie Technologii i Technik Sztuk Plastycznych In stytutu Zabytkoznaw stwa i K onserw atorstw a UMK w To runiu.
Zastosowanie barw ników organicznych. 11
pod w pływ em zaw artego w nim kw asu octowego octan e ty lu ulega h y drolizie, przez co układ ten z upływ em czasu zm ienia swoje właściwości. Mimo szybkiej m igracji na bibule nie uzyskuje się po jednokrotnym roz w inięciu najlepszego rozdziału cukrów prostych. Po 24 godzinach rozw i jania techniką w stępującą na paskach bibuły chrom atograficznej W hat- m an n r 1, o długości 48 cm, rozdział cukrów prostych jest niezbyt dobry, a w artości R£ są stosunkow o niskie. W litera tu rze przedm iotu układ ten zaleca się stosować do jednokrotnego rozw ijania cukrów prostych 8. N a sze dośw iadczenia w ykazały, że ich lepszy rozdział na chrom atogram ach u zyskuje się w tedy, gdy są one rozw inięte techniką w stępującą w w y m ienionym układzie 3— 5-krotnie 9. Poniew aż każde rozw ijanie trw a prze ciętnie 24 godziny, w sum ie więc, jeśli stosujem y rozw ijanie trzykrotne, cały ten proces trw a trz y doby.
W trakcie badań nad przydatnością tego układu do rozw ijania chro- m atogram ów techniką spływ ow ą ustalono, że po jednym rozw inięciu roz dział cukrów nie jest rów nież najlepszy. Zastosowanie rozw ijania w ielo krotnego, podobnie jak to robiono w technice w stępującej, nie popraw iło efektów rozdziału cukrów prostych, uzyskano bowiem gorsze w yniki niż po w ielokrotnym rozw ijaniu techniką w stępującą.
2. U kład drugi — n -butanol 4- p iry d y n a + woda (5:3:1) — m a odczyn słabo zasadowy. Jego pH tuż po przygotow aniu w ynosi 7,4 10. Składniki tego układu dobrze m ieszają się z sobą, nie trzeba więc przygotow yw ać ich w rozdzielaczu. Trw ałość układu jest duża i jak w ykazały w łasne do św iadczenia, m ożna go z powodzeniem stosować naw et w ciągu czterech ty g o d n iłl.
Ze w zględu n a dużą lepkość tego układu szybkość jego m igracji na bibule W hatm an n r 1 w technice w stępującej jest dw ukrotnie m niejsza niż w układzie poprzednim , a więc czas rozw ijania chrom atogram ów jest dw ukrotnie dłuższy. W układzie tym rozdzielają się szczególnie dobrze oligosacharydy, dw ucukrow ce red u k u jące oraz dobrze d-galaktoza i d-gli- koza. C hrom atogram y rozw ijane w tym układzie rozpuszczalników w y kazu ją w technice w stępującej duże w artości Rf cukrów prostych już po ich jednokrotnym rozwinięciu. W ielokrotne rozw ijanie w technice w stę p u jącej jest w tym przypadku zbyteczne, poniew aż nie uzyskuje się zw iększenia efektyw ności w sam ym rozdziale cukrów prostych. Może ono być jedynie stosow ane w celu polepszenia rozdziału oligosacharydów.
W badaniach w łasnych w ykonano próby rozw ijania chrom atogram ów
* Zob.: Papierchromatographie in der Botanik, pod red. H. F. Linskensa, Sprin ger-Verlag, Berlin—G öttingen—H eidelberg 1959, s. 92; I. M. Hais, K. Macek, Hand
buch der Papierchromatographie, VEB Gustav Fischer Verlag, Jena 1958, s. 279.
* Z. Brochwicz, op. cit., s. 534—536. 10 P atrz przyp. 7.
i rozdzielenia cukrów prostych techniką sp ły w o w ą 12. C hrom atogram y rozw ijano jedno- i w ielokrotnie (2-, 3-, 4-krotnie). P rzeciętny czas roz w ijania na paskach bibuły o długości 40 cm w ynosił przeciętnie 9— 10 godzin w tem p eratu rze 20°C. Po jednokrotnym rozw inięciu uzyskano w y niki niezadow alające, nie było bowiem w yraźnego rozdziału cukrów pro stych. Stosunkow o najlepszy rozdział uzyskano na chrom atogram ach roz w iniętych trz y - i czterokrotnie.
3. U kład trzeci — o składzie: octan etylu + piry d y n a + woda (3,6:1: :1,15) — jest układem o odczynie bardzo słabo kw aśnym ; pH jego fazy organicznej w ynosi 6,2 13. Poszczególne jego składniki nie m ieszają się całkowicie z sobą, dlatego też przygotow uje się go w rozdzielaczu. Po kilku godzinach n astępuje w yraźny podział na dwie fazy. F azę górną — organiczną stosuje się do rozw ijania chrom atogram ów , natom iast dolną — w odną do nasycenia kom ory w czasie trw an ia procesu chrom atografo- wania.
W chrom atografii w stępującej najlepsze w yniki w rozdziale cukrów p rostych uzyskuje się w tedy, gdy chrom atogram y rozw ijane są w ielo krotnie.
W chrom atografii spływ ow ej na paskach bibuły chrom atograficznej W hatm an n r 1, o długości 40 cm, w ciągu 7— 8 godzin czoło rozpuszczal n ika spływ a na odległość 32— 33 cm. Na chrom atogram ie rozw iniętym jednokrotnie uzyskuje się na ogół wysokie w artości Rf cukrów prostych, ze w zględu jednak na kró tk i czas m igracji układu rozw ijającego nie uzy sk u je się zadow alającego rozdziału. P lam y cukrów prostych położone są zbyt blisko siebie. Rozw ijanie w ielokrotne (2- i 3-krotne) nie popraw iło właściw ie efektu rozdziału cukrów prostych.
4. U kład czw arty — o składzie: octan etylu + piry d y n a + woda + 80- -procentow y kw as octowy (8:3:8:0,5) — jest układem nieco bardziej kw aś nym od poprzedniego, bowiem jego pH (faza organiczna) w ynosi 5,3 u . Podobnie jak poprzedni w ym aga przygotow ania w rozdzielaczu, ponieważ jego składniki nie m ieszają się całkowicie ze sobą. Po rozw arstw ieniu w rozdzielaczu górną fazę, podobnie jak poprzednio, stosuje się do rozw i jania chrom atogram ów , n atom iast fazę dolną — wodną do nasycenia ko m ory chrom atograficznej.
Je s t to układ, w k tó ry m po jednokrotnym rozw inięciu chrom atogra mów techniką w stępującą uzyskuje się w zględnie dobry rozdział cukrów prostych. Rozw ijanie w ielokrotne efekty te w yraźnie polepsza.
W technice spływ ow ej jedno- i w ielokrotnej w yniki rozdziału cukrów prostych nie są w pełni zadowalające.
12 Ibid., s. 537—538. 13 P atrz przyp. 7. 14 P atrz przyp. 7.
Zastosowanie barw ników organicznych. 13 BARWNIKI ORGANICZNE UŻYTE DO BADAŃ
Do badań użyto następujących barw ników organicznych syntetycz nego pochodzenia, stosow anych w chemii jako w skaźniki (zastosowano barw n ik i rozpuszczalne w wodzie oraz te, które rozpuszczają się w alko holu etylow ym ):
I. B arw niki rozpuszczalne w wodzie:
1) żółcień brylantow a, 12) zieleń jodowa,
2) żółcień akrydynow a, 13) zieleń m alachitow a,
3) oranż m etylow y, 14) indygokarm in,
4) safranina, 15) b łękit ksylenow y,
5) benzopurpuryna, 16) b łękit m etylenow y,
6) fu k sy n a kw aśna, 17) b łękit brom ofenolowy,
7) fuksyna zasadowa, 18) fiolet krystaliczny,
8) czerw ień Kongo, 19) fiolet L au th a (tionina),
9) floksyna, 20) fiolet krezylow y,
10) zieleń brylantow a, 21) nigrozyna.
11) zieleń św ietlna,
II. B arw niki rozpuszczalne w 96-procentow ym alkoholu etylow ym :
1) czerw ień p-m etylow a, 6) alizaryna,
2) eozyna, 7) kw as rozolowy,
3) erytrozyna, 8) czerw ień chlorofenolowa,
4) pąs 3B (Sudan IV), 9) b łękit brom otym olow y,
5) czerw ień fenolowa, 10) fiolet m etylow y.
B arw niki w ym ienione w pierw szej grupie przygotow ano do badań jako 0,1-procentowe roztw ory wodne, natom iast w drugiej grupie — jako 0,1-procentowe roztw ory alkoholowe. R oztw ory te przechow yw ano w tem p e ratu rze pokojow ej w szczelnie zam kniętych butelkach.
METODYKA BADAŃ
D la każdego układ u rozw ijającego przygotow ano n ajp ierw po trzy wielopaskow e arkusze bibuły chrom atograficznej W hatm an n r 1 o w y m iarach 33X35 cm. Szerokość arkusza w ynosiła w tym p rzypadku 33 cm, a jego wysokość 35 cm. Na arkuszach tych w ykreślono ołów kiem paski o szerokości 3 cm w zdłuż wysokości arkusza. Linię startow ą oznaczono ołów kiem na wysokości 4 cm od dolnego brzegu arkusza. Na podzielone w ten sposób trz y arkusze naniesiono w szystkie badane barw niki, a na o statn i pasek każdego arkusza — wzorcowe cukry proste w ilości po 20 m ikrogram ów .
W szystkie trzy arkusze rozw ijano jednocześnie w kom orach chrom a tograficznych „C hropa” prod. NRD, przystosow anych do chrom ato grafii dw ukierunkow ej. Przez rozw ijanie trzech arkuszy jednocześnie uzyskano w przybliżeniu te same w aru n k i m igracji uk ład u rozw ijającego
oraz bardzo bliskie w artości Rf cukrów prostych, a szczególnie 1-ramnozy jako cukru najszybciej w ędrującego.
R oztw ory poszczególnych barw ników nanoszono w ilości po 20 m ikro- gram ów, a na ostatni pasek kw as glikuronow y i wodne roztw ory na stępujących cukrów prostych:
1) d-galaktozy, 5) 1-arabinozy,
2) d-glikozy, 6) d-rybozy,
3) d-m annozy, 7) 1-ramnozy.
4) d-fruktozy,
Wodne roztw ory cukrów i ich pochodnych przygotow ano do badań w stężeniach 0,1-procentow ych i nanoszono na bibułę jako wzorce w ta kiej ilości, aby stężenie każdego z nich wynosiło n a linii sta rtu po 20 m i- krogram ów .
R oztw ory poszczególnych barw ników , zarówno w odne, jak i alkoholo we, nanoszono w ilości po 0,02 ml. Wielkość plam poszczególnych b arw ników na m iejscu sta rtu w ahała się w granicach 3— 4 m m średnicy.
Do nanoszenia zarówno roztw orów barw ników , jak i roztw orów cu krów użyto pip ety do hem oglobinom etru. Stosowano w ielokrotne nano szenie roztw oru i suszenie za pomocą zw ykłej suszarki fryzjerskiej.
W ielopaskowe arkusze rozw ijano n ajp ierw techniką w stępującą w poszczególnych układach rozpuszczalników , przy czym w każdym z nich stosowano rozw ijanie tylko jednokrotne. Po dojściu czoła rozpuszczalnika do odpow iedniej wysokości arkusze w yjm ow ano z kom ory, suszono w tem p e ra tu rze pokojow ej pod w yciągiem w dygestorium , następnie plam y barw ników obrysow yw ano ołówkiem. W prom ieniach UV zaznaczano ołówkiem bardzo dokładnie linię czoła rozpuszczalnika. W dalszym toku postępow ania odcinano w zdłuż arkusza pasek z naniesionym i cukram i prostym i i w yw oływ ano go ftalan em aniliny ls. Po w yw ołaniu pasek ten
15 Papierchromatographie in der Botanik, s. 93: „0,93 g aniliny i 1,66 g kwasu
ftalowego rozpuszcza sią w 5 ml H20 i dodaje do tego 95 ml acetonu. Chromato- gram y w ywołuje się przez zanurzenie bibuły w tym roztworze, po czym ogrzewa się w tem peraturze 100—110°C w ciągu 10 m inut. Aldoheksozy dają żółtobrunatne plamy, aldopentozy — czerw onobrunatne, kwasy uronowe — pomarańczowe”. Cukry w ystępujące na bibule w małych stężeniach można dodatkowo identyfikować w prom ieniach UV, szczególnie aldoheksozy, metylopentozy (1-ramnoza) i kwasy uro nowe, dają one bowiem charakterystyczną fluorescencję po w ywołaniu chrom ato- gram ów tym odczynnikiem. Odczynnik ten jest mało trw ały i powinien być przy gotowany każdorazowo przed w ywołaniem nowych chrom atogramów. W literaturze przedm iotu do przygotowania odczynnika poleca się stosować jako rozpuszczalnik n-butanol nasycony wodą. W naszej praktyice badawczej w miejsce n-butanolu sto suje się aceton, ponieważ w tym przypadku nie ma obawy, że w trakcie wywo ływ ania chrom atogram ów mogą ulec rozmyciu plam y poszczególnych cukrów. W przypadku stosowania odczynnika rozpuszczonego w n-butanolu nasyconym wo dą, wywołanie chrom atogram ów przez ich zanurzenie w roztworze odczynnika może spowodować rozmycie plam.
Zastosowanie barw ników organicznych.. 15
doklejano do pozostałej części arkusza z barw nikam i. Obrysow yw ano ołów kiem plam y cukrów i obliczano następujące w artości Rf:
a) w artości Rf plam poszczególnych barw ników ;
b) w artości Rt 1-ramnozy jako cu k ru najszybciej m igrującego we w szystkich w ym ienionych układach rozw ijających;
c) w artość Ruamn. dla tych plam barw ników , których lokalizacja na chrom atogram ach rozw iniętych techniką w stępującą, a więc i szybkość m igracji oraz w artość R(, by ły bliskie w artości R( 1-ram nozy18.
Do dalszych badań, w których stosowano już w yłącznie technikę spływ ow ą, zakw alifikow ano tylko te barw niki, których w artości Rt były bliskie w artości Rt 1-ramnozy. W trak cie rozw ijania chrom atogram ów re jestrow ano dokładnie zabarw ienie poszczególnych plam barw ników , po niew aż w zależności od pH układu rozpuszczalników barw a ich może ulegać zmianie.
WYNIKI BADAN NAD MIGRACJĄ BARWNIKÓW I CUKRÓW PROSTYCH UZYSKANE W POSZCZEGÓLNYCH UKŁADACH ROZPUSZCZALNIKÓW
W poszczególnych układach rozpuszczalników uzyskano następujące w yniki:
1. U kład: octan ety lu + lod. kw as octowy + woda (3:1:3)
W w yn ik u rozw ijania techniką w stępującą z 31 barw ników zastoso w anych do badań tylko niew iele w ykazało szybkość m igracji zbliżoną do tem pa m igracji 1-ramnozy. Większość barw ników m igruje bądź wol niej niż 1-ramnoza, bądź też ich m igracja jest znacznie szybsza. Zarów no jedne, ja k i drugie barw n ik i w yelim inow ano z dalszych badań i pozosta wiono tylko te, k tóre w technice spływ ow ej m ogły okazać się przydatne. W artości R£ w y b ran y ch barw ników i 1-ramnozy na chrom atogram ach rozw iniętych w ty m układzie techniką w stępującą ilu stru je tab ela 1.
TABELA 1
Wartości R f barwników na chromatogramach rozwiniętych jednokrotnie techniką wstępującą w układzie: octan etylu + kwas octowy + woda (3:1:3) w ciągu 24 godzin, zakwalifikowanych do dalszych badań techniką spływową ciągłą w tym samym
układzie rozpuszczalników Lp. Rodzaj barwnika Wartość R, barwnika Wartość R, 1-ra-mnozy Wartość R Ram a. dla barwnika Kolor barwnika w trakcie rozwijania chromatogramu 1 2 3 4 5 6
1 Błękit ksylenowy 0,14 0,18 0,78 niebieski 2 Czerwień feolowa 0,28 0,18 1,56 żółtocytrynowy 3 Błękit metylenowy 0,29 0,18 1,61 niebieskozielonkawy
4 Oranż metylowy 0,37 0,18 2,06 różowoczerwony
5 Fiolet krezylowy 0,49 0,18 2,72 fioletowy 6 Żółcień brylantowa 0,51 0,18 2,83 żółty
B arw niki wyszczególnione w tabeli 1 naniesiono następnie na linię sta rtu na w ielopaskow ych arkuszach bibuły chrom atograficznej W hat m an n r 1 o długości 56,5 cm. Szerokość poszczególnych pasków na tych arkuszach w ynosiła 4 cm. Linię startow ą w ykreślono na wysokości 6 cm od górnego brzegu arkusza. B arw niki, podobnie jak poprzednio, nano szono w ilości po 0,02 ml roztw oru każdy. Na ostatnim pasku jako wzo rzec naniesiono roztw ór 1-ramnozy w ilości 20 m ikrogram ów .
C hrom atogram y zanurzono w rynienkach um ieszczonych w górnej części kom ory „C hropa”, przystosow anej do rozw ijania jednokierunko wego. Zanurzone w rynienkach arkusze obciążono specjalnym i ru rk am i szklanym i, zatopionym i z obydw u końców i zaw ierającym i w ew nątrz p rę t mosiężny o grubości 12 mm.
Zastosowano rozw ijanie ciągłe. Na dnie szklanej kom ory chrom ato graficznej umieszczono odpow iedniej wielkości p akiet z ligniny, z którym stykał się zw isający z ry n ien k i arkusz bibuły; w pakiecie tym zbierał się nadm iar rozpuszczalnika spływ ającego z bibuły. C hrom atogram rozw ija no w ciągu 12 godzin. Po w yjęciu arkusza bibuły z kom ory ostatni pasek z 1-ramnozą odcięto i w ywołano ftalanem aniliny. W yniki uzyskane na chrom atogram ach ilu stru je tabela 2.
TABELA 2
Szybkość migracji wybranych barwników i 1-ramnozy na chromatogramach rozwiniętych techniką spływową ciągłą w układzie: octan etylu + kwas octowy
+ woda (3:1:3) w ciągu 12 godzin
Lp. Rodzaj barwnika Odległość od startu do środka plamy Wartość Rr™ . dla barwnika Uwagi 1 2 3 4 5
1 Błękit ksylenowy 124 mm 1,02 migracja barwnika bardzo bliska migracji 1-ramnozy
2 Czerwień fenolowa 220 mm 1,79 migracja barwnika zbyt szybka w stosunku do migracji 1-ramnozy 3 Błękit metylenowy 246 mm 2,00 migracja barwnika zbyt szybka w stosunku do migracji 1-ramnozy 4 Oranż metylowy 288 mm 2,34 migracja barwnika zbyt szybka w stosunku do migracji 1-ramnozy 5 Fiolet krezylowy 400 mm 3,25 migracja barwnika zbyt szybka
w stosunku do migracji 1-ramnozy 6 Żółcień brylantowa 421 mm 3,42 migracja* barwnika zbyt szybka
w stosunku do migracji 1-ramnozy
J a k w ynika z tabeli 2 jedynym barw nikiem , k tó ry m ożna uznać za optym alnie przydatny, jest b łękit ksylenow y, k tó ry w technice spływ ow ej w ęd ru je nieco szybciej niż 1-ramnoza. W artość podziału tego barw nika
Zastosowanie barw ników organicznych.. 17 czyć, że w spółczynnik ten na chrom atogram ach rozw iniętych techniką w stępującą w ynosi 0,78 (tab. 1, rubr. 5), a więc b arw nik ten w technice spływ ow ej m igruje nieco szybciej niż w technice w stępującej. Pozostałe barw niki, w ym ienione w tabelach 1 i 2 w pozycjach 2— 6, z uw agi na ich m igrację, znacznie szybszą od m igracji 1-ramnozy, nie mogą być stosowane jako czynnik k ontrolny w chrom atografii spływ ow ej ciągłej cukrów pro stych.
Poniew aż w ciągu 12 godzin przesunięcie się 1-ramnozy od linii s ta r tu w dół jest niezbyt duże, dodatkowo w ykonano rozw ijanie w dłuższych okresach, a m ianowicie w ciągu 30 i 42 godzin. Uzyskano w ten sposób dłuższą drogę m igracji cukrów prostych i lepszy ich rozdział.
C hrom atogram przedstaw iający m igrację 1-ramnozy i rozdział pozo stałych cukrów prostych, po rozw inięciu go w ciągu 42 godzin techniką spływ ow ą ciągłą, ilu stru je ry su n ek 2. Stw ierdzono, że przedłużenie czasu rozw ijania techniką spływ ow ą ciągłą w tym układzie rozpuszczalników praw ie w ogóle nie w pływ a na zwiększenie szybkości m igracji błękitu ksylenowego w stosunku do tem pa m igracji 1-ramnozy. W artości RRaran. dla b łękitu ksylenowego w poszczególnych okresach rozw ijania przed sta w iają się następująco: 12 godzin — 1,02; 30 godzin — 1,03; 42 godziny — 1,04.
2. Układ: n-butanol + p iry d y n a + woda (5:3:1)
W ielopaskowe arkusze bibuły o długości 35 cm z naniesionym i roz tw oram i barw ników oraz z 1-ramnozą na ostatnim pasku arkusza rozw i jano w niniejszym układzie jednokrotnie techniką w stępującą w ciągu 24 godzin. P asek z 1-ramnozą odcięto od pozostałej części arkusza i w y w ołano ftalan em aniliny. Na podstaw ie w yników uzyskanych na chro m atogram ach do dalszych badań zakw alifikow ano barw niki wyszczegól nione w tabeli 3.
Pozostałe barw niki, k tó ry ch użyto do badań, ale nie wyszczególniono w niniejszej tabeli ze w zględu na w artości Rf, w yraźnie różniące się od
TABELA 3
Wartości Rf barwników na chromatogramach rozwiniętych jednokrotnie w układzie: n-butanol + pirydyna + woda (5:3:1) techniką wstępującą w ciągu 24 godzin i zakwalifikowanych do dalszych badań techniką spływową ciągłą w tym samym
układzie rozpuszczalników
Lp. Rodzaj barwnika WartośćRr
barwnika Wartość Rt 1-ra-mnozy Wartość R R arna. dla barwnika Kolor barwnika w trakcie rozwijania chromatogramu 1 2 3 4 5 6
1 Błękit bromofenolowy 0,37 0,48 0,78 niebieskofioletowy 2 Czerwień fenolowa 0,46 0,48 0,96 żółtocytrynowy 3 Fiolet krezylowy 0,53 0,48 1,10 jasnofioletowy 4 Czerwień p-metylowa 0,55 0,48 1,15 żółtopomarańczowy
Rf 1-ramnozy, zostały z dalszych badań w yelim ino wane. B arw niki w ym ienione w tab eli 3 oraz cukry wzorce poddano badaniom za pomocą techniki spły wow ej ciągłej. Naniesiono je na arkusz b ibuły chro m atograficznej W hatm an n r 1 o długości 56,5 cm i rozw ijano w ty m układzie techniką spływ ow ą cią głą w ciągu 22 godzin. K ontrolą czasu rozw ijania oparto przede w szystkim na szybkości m igracji czer w ieni p-m etylow ej i fioletu krezylowego, które — jak w ynika z tabeli 3 — w ęd ru ją w ty m układzie najszybciej. Z chwilą, kiedy barw niki te zbliżyły się na odległość ca 12 cm od dolnego brzegu a rk u sza, rozw ijanie przerw ano. P asek z naniesioną m ie szaniną cukrów prostych po odcięciu w yw ołano fta - lanem aniliny. Uzyskane w yniki ilu stru ją tabela 4 oraz ry su n ek 3.
Rys. 2. Rozdział cukrów prostych i barw ników kontrolnych w układzie: octan etylu + kwas octowy + woda (3:1:3)
Zastosowanie baiw ników organicznych... 19
TABELA 4
Szybkość migracji wybranych barwników oraz 1-ramnozy na chromatogramach rozwiniętych techniką spływową ciągłą w układzie n-butanol + pirydyna + woda
(5:3:1) w ciągu 24 godzin Lp. Rodzaj barwnika Odległość od startu do środka plamy Wartość R R a m a . dla barwnika Uwagi 1 2 3 4 5
1 Błękit bromo 265 mm 1,01 migracja barwnika prawie taka sama
fenolowy jak migracja 1-ramnozy
2 Czerwień fenolowa 323 mm 1,24 barwnik jeszcze może być użyty jako
czynnik kontrolny
3 Fiolet krezylowy 357 mm 1,37 migracja barwnika zbyt szybka w stosunku do migracji 1-ramnozy 4 Czerwień p-mety- 329 mm 1,26 barwnik jeszcze może być użyty jako
Iowa czynnik kontrolny
J a k w ynika z tabeli 4, barw nikiem najbardziej p rzy d atn y m do kon trolow ania czasu m igracji 1-ramnozy w tym układzie rozpuszczalników jest błękit brom ofenolow y, którego szybkość m igracji jest praw ie iden tyczna z tem pem m igracji 1-ramnozy. RBamn. dla b łękitu brom ofenolow e- go w ynosi 1,01. Za p rzy d atn e m ożna by rów nież uznać następne dw a barw niki, a mianowicie: czerw ień fenolow ą (RRamn. = 1>24) i czerw ień
p-m etylow ą ( R Ramn. = 1.26), natom iast fiolet krezy Iowy, z uw agi n a znacz
nie szybszą m igrację od m igracji 1-ramnozy (RRamn. = 1,37), należałoby raczej odrzucić.
N a chrom atogram ach rozw iniętych w tym układzie rozpuszczalników techniką spływ ow ą ciągłą w ciągu 16 godzin w artości RRamn. dla w ym ie nionych barw ników wynoszą: błękit brom ofenolow y — 1,15, czerw ień fe nolowa — 1,33, fiolet krezylow y 1,52, czerw ień p-m etylow a — 1,33. W ar tości te nasuw ają wniosek, że przy dłuższym czasie rozw ijania w arto ści RRamn. w ty m układzie rozpuszczalników m aleją, w przeciw ieństw ie do układu poprzedniego, w k tó ry m w artości te by ły stałe.
3. U kład: octan ety lu + p iry d y n a + w oda (3,6:1:1,15)
W ielopaskowe arkusze bibuły W hatm an n r 1 o długości 35 cm, z n a niesionym i jak poprzednio roztw oram i barw ników oraz z 1-ramnozą jako wzorcem , rozw inięto jednokrotnie w ciągu 24 godzin w tem p eratu rze 20°C ( ± 1°). Po w yjęciu z kom ory i w ysuszeniu odcięto pasek z 1-ramno zą i w yw ołano ftalan em aniliny.
Z 31 barw ników w ytypow ano tylko te, k tó ry ch w spółczynnik podziału
R Ramn. nie przekraczał jedności, doświadczenie bowiem w ykazało, że
b arw n ik i takie w technice spływ ow ej w ęd ru ją znacznie szybciej i ich w artość Rnamn. przekracza jedność. B arw niki w ytypow ane do dalszych
stych oraz barw ników kon trolnych w układzie: n-buta- nol -t- pirydyna + woda (5:3:1)
Zastosowanie barw ników organicznych... 21 badań i ich w spółczynniki podziału ilu stru je tabela 5. Pozostałe barw niki, nie wyszczególnione w tabeli 5, nie zostały zakw alifikow ane do dalszych badań ze w zględu na bardzo zróżnicowaną m igrację w stosunku do 1-ram- nozy.
TABELA 5
Wartości Rr barwników na chromatogramach rozwiniętych jednokrotnie w ciągu 24 godzin techniką wstępującą w układzie: octan etylu + pirydyna + woda (3,6:1:1,15) i zakwalifikowanych do dalszych badań w technice spływowej ciągłej
Lp. Rodzaj barwnika Wartość Rr barwnika Wartość Rf 1-ra mnozy Wartość R R a m a . dla barwnika Kolor barwnika w trakcie rozwijania chromatogramu 1 2 3 4 5 6
1 , Fiolet krezylowy 0,32 0,34 0,94 niebieskofioletowy
2 Błękit bromofenolowy 0,30 0,34 0 , 8 8 niebieskofioletowy
3 Czerwień fenolowa 0,37 0,43 1,08 czerwony 4 Fiolet Lautha (tionina) 0,25 0,34 0,73 niebieski
Na wielopaskowe arkusze bibuły chrom atograficznej W hatm an n r 1 naniesiono barw niki w ym ienione w tabeli 5, a na ostatnim pasku cukry wzorce w ilości po 20 m ikrogram ów . Linię startow ą w ykreślono w od ległości 6 cm od górnego brzegu arkusza. A rkusz rozw ijano techniką spływ ow ą ciągłą w ciągu 24 godzin w tem p eratu rze 20°C ( ± 1°). W tr a k cie rozw ijania chrom atogram u zauważono, że barw n ik i te tw orzą dwie pary , jeśli chodzi o szybkość ich m igracji. Pierw szą, szybciej w ędrującą parę, stanow iły czerw ień fenolow a i fiolet krezylow y, drugą zaś parą, w ęd ru jącą wolniej, okazały się fiolet L au th a (tionina) oraz błękit brom o- fenolowy. Rozw ijanie chrom atogram u zakończono z chwilą, gdy pierw sza, szybciej w ęd ru jąca p a ra barw ników dotarła do dolnego brzegu a rk u sza bibuły.
P asek z cukram i prostym i w yw ołano ftalan em aniliny. U zyskane w y niki w artości Rsamn. poszczególnych barw ników ilu stru je tab ela 6 oraz ry su n e k 4.
Również i w tym układzie rozpuszczalników, podobnie jak w poprzed nim, d aje się zauw ażyć tę sam ą prawidłowość, a m ianowicie barw niki,
któ re w chrom atografii w stępującej m ają w spółczynnik podziału R Bamn.
poniżej jedności (tab. 5, ru b r. 5), w ęd ru ją w technice spływ ow ej ciągłej
szybciej od 1-ramnozy i ich w artości R Ramn. S ą większe od jedności.
4. U kład: octan etylu + p iry d y n a + w oda + 80-procentow y kw as octo w y (8:3:8:0,5)
W analogicznych w aru n k ach chrom atografow ano w ty m układzie w szystkie barw niki, o k tó ry c h m owa wyżej.
TABELA 6
Szybkość migracji wybranych barwników oraz 1-ramnozy na chromatogramach rozwiniętych techniką spływową ciągłą w układzie octan etylu + pirydyna + woda
(3,6:1:1,15) w ciągu 24 godzin Lp. Rodzaj barwnika Odległość od startu do środka plamy Wartość R Raron. dla barwnika Uwagi 1 2 3 4 5
1 Czerwień fenolowa 484 mm 1,21 para barwników wędrująca
2 Fiolet krezylowy 489 mm 1,22 szybciej
3 Fiolet Lautha (tionina) 438 mm 1,09 para barwników wędru jąca wolniej od dwóch 4 Błękit bromofenolowy 455 mm 1,13
poprzednich
W ielopaskowe arkusze o długości 35 cm z naniesionym i roztw oram i barw ników oraz z 1-ramnozą rozw ijano n ajp ierw w tym układzie jedno krotnie techniką w stępującą w ciągu 8 godzin w tem p eratu rze 20°C ( ± 1°). P asek z 1-ramnozą w yw ołano ftalanem aniliny. Na podstaw ie w yników uzyskanych na chrom atogram ach rozw iniętych techniką w stępującą do dalszych badań zakw alifikow ano barw niki zestaw ione w tabeli 7.
Pozo-TABELA 7
Wartość Rf barwników na chromatogramach rozwiniętych jednokrotnie techniką wstępującą w układzie: octan etylu + pirydyna + woda + 80-procentowy kwas octowy (8:3:8:0,5) w ciągu 8 godzin i zakwalifikowanych do dalszych badań
w technice spływowej ciągłej
Lp. Rodzaj barwnika WartośćRr barwnika Wartość Rr 1-ra mnozy Wartość R Kimn. dla barwnika Kolor barwnika w trakcie rozwijania chromatogramu 1 2 3 4 5 6
1 Fiolet krezylowy 0,21 0,24 0,88 fioletowy
2 Czerwień fenolowa 0,26 0,24 1,08 żółty
3 Safranina 0,32 0,24 1,33 czerwony
stałe barw niki, użyte do badań i nie wyszczególnione w tabeli 7, ze w zglę du na zb y t w olną lub szybką m igrację w stosunku do m igracji 1-ramno zy zostały w yelim inow ane z dalszych badań.
B arw niki w ym ienione w tabeli 7 oraz cukry proste jako wzorce n a niesiono na czteropaskow y arkusz bibuły chrom atograficznej W hatm an n r 1 o długości 56,5 cm i rozw ijano w ty m układzie techniką spływ ow ą ciągłą w ciągu 30 godzin w tem p eratu rze 20°C ( ± 1°). K ontrolę rozw ija nia tego chrom atogram u oparto przede w szystkim n a szybkości m igracji czerw ieni fenolowej: z chwilą, kiedy zbliżała się ona do dolnego brzegu
Rys. 4. Rozdział cukrów pro stych oraz barw ników kon trolnych w układzie: octan etylu + pirydyna + woda (3,6:1:
arkusza bibuły, na odległość ca 12 cm, rozw ijanie przeryw ano. Pasek z cukram i prostym i w yw ołano ftalanem aniliny. Uzyskane w yniki ilu stru je tabela 8 i ry su n ek 5.
TABELA 8
Szybkość migracji wybranych barwników oraz 1-ramnozy na chromatogramach rozwiniętych techniką spływową ciągłą w układzie: octan etylu + pirydyna + woda
+ 80-procentowy kwas octowy (8:3:8:0,5) w ciągu 30 godzin
Lp. Rodzaj barwnika Odległość od startu do środka plamy Wartość R Ramn. dla barwnika Uwagi 1 "ł 3 4 5
1 Fiolet krezylowy 338 mm 1,04 szybkość migracji barwnika jest prawie identyczna z migracją 1-ra mnozy, w związku z czym jest on najbardziej przydatny dla tego ukła du rozpuszczalników
2 Czerwień fenolowa 381 mm 1,17 barwnik nieprzydatny 3 Safranina 404 mm 1,22 barwnik nieprzydatny
Z przeprow adzonych badań w ynika, że w powyższym układzie roz puszczalników m ożna w ykorzystyw ać w chrom atografii spływ ow ej cu krów prostych jako czynniki kontrolne następujące barw niki: fiolet k re- zylow y i czerw ień fenolową. Za użyciem tej p ary barw ników jednocze śnie przem aw ia to, że szybkość ich m igracji jest najbardziej zbliżona do m igracji 1-ramnozy (nieznacznie ją przewyższa). Poza tym użycie na chrom atogram ach tych barw ników jednocześnie, na dwóch różnych pa skach, daje pełną gw arancję zakończenia procesu rozw ijania chrom ato- gram ów we w łaściw ym czasie. Ja k w ynika z tabeli 8, czerw ień fenolowa m ig ru je nieco szybciej niż fiolet krezylow y, stąd też, jeśli spłynie ona z rozpuszczalnikiem z arkusza bibuły, pozostaje jeszcze jeden barw nik jako czynnik k o n tro ln y pozw alający uchwycić właściwe zakończenie pro cesu rozw ijania.
PODSUMOWANIE WYNIKÓW BADAN I WNIOSKI
Przeprow adzone badania w ykazały, że stosując odpowiednio dobrane b arw n ik i (wskaźniki), o szybkości m igracji zbliżonej do tem pa m igracji 1-ramnozy, m ożna do rozdzielenia cukrów prostych w y stępujących w h y drolizatach węglow odanow ych spoiw m alarskich stosować z powodzeniem chrom atografię spływ ow ą ciągłą. B arw niki te pozw alają w trakcie roz w ijania chrom atogram ów w szklanych kom orach chrom atograficznych
Rys. 5. Rozdział cukrów prostych oraz barw ników kontrolnych w układzie: octan etylu + pirydyna + 80-procento- w y kw as octowy + w oda (8:3:0,5:8)
kontrolow ać szybkość m igracji 1-ramnozy na bibule. K iedy dolna część plam y barw nika znajdzie się w odległości 5— 6 cm od dolnego brzegu bibuły, rozw ijanie należy przerw ać, aby nie dopuścić do spłynięcia 1-ram nozy w raz z rozpuszczalnikiem do pakietu ligniny ułożonego na dnie ko m ory.
C hrom atografia spływ ow a ciągła pozwala na rozciągnięcie m igracji cukrów prostych, a tym sam ym na uzyskanie lepszego ich rozdziału.
J a k ten proces m a się do chrom atografii w stępującej? W chrom ato g rafii w stępującej jednokierunkow ej po jednokrotnym rozw inięciu chro- m atogram ów uzyskuje się — w zależności od długości paska i czasu m i gracji — n a ogół rozdział cukrów prostych niezbyt zadow alający. E fekt ten popraw ić można przez w ielokrotne rozw ijanie chrom atogram ów w ty m sam ym lub w dwóch różnych układach rozpuszczalników 17. W tym ostatnim przypadku uzyskuje się już rozdział cukrów w pełni zadow ala jący, za w y jątkiem d-m annozy i d-fruktozy, k tó re zazw yczaj tw orzą w spólną plam ę. K ażde rozw ijanie chrom atogram ów w technice w stępu jącej w ielokrotnej, na paskach bibuły o długości 35 cm, trw a jednak 24 godziny, w sum ie więc n a trzy k ro tn e rozwinięcie chrom atogram ów po trzeba 72 godziny. W tego rodzaju rozw ijaniu chrom atogram ów , w dwóch różnych układach rozpuszczalników , należy mieć do dyspozycji dwie od dzielne kom ory chrom atograficzne, dla każdego układu oddzielną.
Stosow anie jedno- i w ielokrotnego rozw ijania chrom atogram ów tech niką spływ ow ą zw ykłą (nieciągłą) jedno- i w ielokrotnie, to znaczy taką,
17 Z. Brochwicz, M. Górzyńska, P. Połom, J. W iklendt, Materiały i techniki
średniowiecznych m alowideł ściennych w kościele św. Jakuba w Toruniu, Toruń
1988, s. 32—33. W pracy tej po raz pierwszy zakomunikowano o zastosowaniu tej metody w chrom atograficznej analizie węglowodanowych spoiw m alarskich w śred niowiecznych m alowidłach ściennych. Metodę tę w prowadziłem do badań jednak znacznie wcześniej, a mianowicie przy końcu la t siedemdziesiątych. W yniki badań nie były wówczas jeszcze publikowane. Zgodnie z tą metodą chrom atogram y roz w ija się techniką w stępującą 3 razy po 24 godziny w (następujących kolejno po sobie układach rozpuszczalników: 1) pierwsze rozw ijanie w układzie: octan etylu + pirydyna + woda (3,6:1:1,15); 2) drugie rozw ijanie w układzie: octan etylu + kwas octowy + w oda (3:1:3); 3) trzecie rozw ijanie w układzie pirydynowym, wymienionym w punkcie pierwszym. Rozwijanie trzykrotne m a na celu w ydłużenie drogi m igracji cukrów prostych oraz ich lepszy rozdział. Zastosowanie dwóch różnych układów rozw ijających ma między innym i polepszyć m igrację kwasów uronowych, które w ystępują w gumach roślinnych oraz w kleju z nasion lnu. M igracja tych kwasów w układzie pirydynowym jest słaba, natom iast w układzie drugim jest na tyle zmaczna, że można je wyraźnie odróżnić od wielocukrowców jako pozostałych reszt niepełnej hydrolizy, co często się zdarza naw et w hydrolizatach wykonanych w ostrych w arunkach. W układzie drugim słabo oddzielają się od siebie dwa podsta wowe cukry, będące aldoheksozami, a mianowicie d-galaktoza i d-glikoza. Są one charakterystycznym i składnikam i klejów roślinnych pochodzenia zbożowego (klej pszeniczny, jęczmienny, otrzym yw ane z ziaren zbożowych). W układzie pierwszym rozdział tych cukrów jest zadowalający i w ten sposób można je bezbłędnie ziden tyfikować.
Zastosowanie barw ników organicznych.. 27 w k tó rej czoło rozpuszczalnika nie spływ a z bibuły, też nie daje w łaści w ie w pełni zadow alających w yników . Znacznie lepsze re z u ltaty uzyskuje się w tedy, gdy stosuje się m etodę spływ ow ej chrom atografii ciągłej. Za letą tej m etody jest niew ielka ilość używ anych rozpuszczalników (ca 150— 200 ml), a więc i duża oszczędność odczynników, i przy tym m niejsza szkodliwość niektórych z nich dla zdrow ia (np. pirydyny). W adą tej m e tody jest to, że plam y cukrów prostych na chrom atogram ach są bardziej w ydłużone niż na chrom atogram ach rozw iniętych techniką w stępującą. Nie m ożna rów nież stosować kilkakrotnego rozw ijania ciągłego w jed nym lu b w dwóch następujących po sobie układach rozpuszczalników, doprow adziłoby to bowiem do spłynięcia z bibuły zarów no barw nika kontrolnego, jak i cukrów prostych. Byłoby to więc w ielokrotne rozw ija nie ciągłe, w ostatecznym efekcie nie kontrolow ane.
Z przeprow adzonych prób jednoznacznie w ynika, że do rozw ijania chrom atogram ów z cukram i prostym i najbardziej n ad ają się następujące u k ład y rozpuszczalników oraz w ybrane do nich odpowiednie barw niki kontrolne:
1) układ: octan etylu + lod. kw as octow y + woda (3:1:3) oraz jako b arw n ik k o n tro ln y 0,1-procentow y w odny roztw ór błękitu ksylenowego;
2) układ: octan ety lu + p iry d y n a + w oda (3,6:1:1,15) oraz dw a kon trolne barw niki: 0,1-procentow y roztw ór w odny fioletu L au th a (tioniny) i 0,1-procentow y roztw ór w odny błęk itu brom ofenolowego;
3) układ: octan ety lu + p iry d y n a + woda + 80-procentow y kw as octo w y (8:3:8:0,5) oraz jako b arw n ik ko n tro ln y 0,1-procentow y w odny roz tw ór fioletu krezylowego.
U kład n -butanol + piry d y n a + woda (5:3:1), z uw agi na w olniejszą m igrację cukrów prostych i nie najlepszy ich rozdział na chrom atogra m ach rozw iniętych techniką spływ ow ą ciągłą, należy uznać — w porów naniu z poprzednim i układam i — za m niej p rzy d atn y w chrom atogra ficznej analizie w ęglow odanow ych spoiw m alarskich.
M ożna przyjąć, że niezależnie od te m p e ra tu ry oraz czasu rozw ijania chrom atogram ów szybkość m igracji w ybranych barw ników w stosunku do tem pa m igracji 1-ramnozy jest wielkością praw ie stałą, bow iem róż nice byw ają nieznaczne.
Rozdział i dokładne ustalenie rodzaju plam cukrów prostych, po w y w ołaniu chrom atogram ów ftalan em aniliny, u stala się n a podstaw ie RRamn.. to znaczy przez określenie stosunku drogi przebytej przez po szczególne cu k ry proste do drogi przebytej przez 1-ramnozę. Odcinki m igracji liczy się zawsze od m iejsca s ta rtu do środka plam y określonego cu k ru prostego. W spółczynnik podziału poszczególnych cukrów prostych w stosunku do 1-ramnozy przedstaw ia n astępujący wzór:
droga przebyta przez badany cukier prosty RRamn. droga przebyta przez 1-ramnozę
Poniew aż w szystkie cukry proste w ęd ru ją w olniej niż 1-ramnoza, w spółczynnik podziału R Ramn. będzie zawsze wielkością poniżej jedności.
W przypadku, gdy w analizow anej substancji, będącej spoiwem m a larskim , 1-ramnoza jest nieobecna, wówczas zajdzie potrzeba zastosow ania innego w spółczynnika podziału, np.
