Wpływ fłurazepamu i zewnątrzkomórkowego pH na amplitudę i kinetykę GABA ergicznych prądów synaptycznych w hodowanych neuronach z hipokampa szczura

Wpł yw

Hura/ćpaniu i zewnątrzkomórkowego pH na amplitudę

i kinetykę GABAergicznych prądów synaptycznych

w hodow anych neuronach z hipokampa szczura*

Piotr Brzeźniaki, Ewa Pindel, Tomasz Wojtowicz, M ich ał Piast, Jerzy W. M ozrzym as

Sam odzielna Pracownia Biofizyki Układu N erw ow ego Katedra Biofizyki

Akadem ia Medyczna we Wrocławiu

Streszczenie

Stężenie jo nó w wodorowych (pH) i benzodiazepiny (BDZ) są czynnikam i m odulującym i receptory GA BA a . W szczególności, wartość pH środowiska zew nątrzkom órkow ego może zmieniać się w zależności od stanu fizjologicznego lub patologicznego. W niniejszej pracy przedstaw iono wyniki badań wpływu flurazepam u (benzodiazepiny) przy różnych wartościach zewnątrzkom órkowego pH (z zakresu 5.5 - 7.2) na am plitudę m iniaturow ych GABA-ergicznych inhibujących prądów synaptycznych (m IPSCs). Stwierdzono, że obecność flurazepamu prowadzi do zwiększenia am plitudy mIPSCs, ale efekt ten zależy od pH i je st najw iększy przy silnie kwaśnych wartościach. Wpływ flurazepamu na am plidudę mIPSC osiąga nasycenie przy stężeniu ok. I цМ dla wszystkich badanych wartości pH. Wyniki te w skazują na to, że m odulacja Prądów G AB Aergicznych przez benzodiazepiny je st zależna od odczynu środowiska.

Słow a klu cz ow e: flu razepam , benzo diaze piny , pH , recepto ry G A B A a , pa tch-clam p , m IPSC .

Benzodiazepiny są związkami, które wspom agają aktywność receptorów GABAa [4, 9, 14]. Do tej grupy zw iązków należą substancje stosowane ja k o leki Przeciwepileptyczne (AED), przeciwkonwulsyjne, leki nasenne i uspokajające. Receptor G A BAa zaw ierający podjednostkę y2 posiada m iejsce wiążące dla benzodiazepin, które znajduje się na interfejsie pomiędzy podjednostką y2 i ot t9. 11, 12, 13], co pozw ala na bezpośrednią modulację działania receptora przez te związki. Głównym efektem oddziaływania benzodiazepin na receptor GABA

*

jest zw iększenie pow inowactw a GABA do receptora G A BAa (G A BAaR) [1]. W praktyce, najczęściej opisywanym efektem benzodiazepin je st zwiększenie amplitud i w ydłużenie czasu deaktywacji prądów G ABAergicznych [4, 2].

Innym czynnikiem , który silnie m oduluje funkcjonow anie G A B A aR jest stężenie jo nów wodorowych w bezpośrednim otoczeniu receptora [3, 8, 10]. Zakwaszenie roztw oru pow oduje redukcję am plitudy (przy b. niskich stężeniach GABA). pH je st jedn ym z parametrów, który może ulec zm ianie w stanach chorobowych, patologicznych układu nerwowego, co z kolei może wpływać na efektywność działania leków, zw iązków m odulujących działanie receptora GA BAa [14]. Praca ta stara się odpowiedzieć na pytanie, jak i wpływ na m odulację synaptycznych prądów GABAergicznych przez benzodiazepiny mają zmiany pH w środowisku zewnątrzkomórkowym.

Badania przeprow adzono na hodowlach kom órek nerwow ych, pochodzących z hipokam pa szczura (2-3 dni po urodzeniu). Procedura preparacji hodowli została przedstawiona w szczegółach w pracy [7]. 2-3 dniow e szczury zostały zdekapitow ane, hipokamp został w yekstrahow any, pocięty, potraktowany enzymam i trawiącymi i zdysocjow any na pojedyncze komórki, które wysiane zostały na płytkach Petriego i pozostaw ione w inkubatorze przez przynajm niej tydzień. W tym czasie, dochodzi do w ytw orzenia dużej ilości funkcjonalnych połączeń synaptycznych. Pomiary wykonano przy użyciu techniki patch-clam p, w konfiguracji whole-cell, rejestrując miniaturowe, inhibujące prądy postsynaptyczne (m IPSCs), przy obecności blokerów: tetrodotoksyny (TTX, 1 Ц.М) blokującej napięciowozależne kanały sodowe, i kwasu kinurynow ego (1 mM) blokującego transm isję glutam atergiczną (AM PA i NM DA ). Rejestracje wykonano przy stałym , ustalonym na -70 mV napięciu błonowym .

Roztwór zewnątrzkom órkow y miał następujący skład: NaCI 137 mM, KC1 5 mM, C aC l2 2 mM, M gCl2 1 mM, D-glukoza 20 mM, H EPES 10 mM, pH roztw oru doprow adzone do odpow iedniego pH (6.0 - 7.2) przy użyciu NaOH. Dla pH = 5.5, zamiast buforu HEPES użyty został bufor MES 15 mM. Pipeta pom iarowa w ypełniona była roztworem o składzie: CsCl 137 mM, СаСЬ 1 mM, M gCl2 2 mM, BABTA 11 mM, ATP 2 mM, pH = 7.2 m iareczkow ane przy użyciu CsOH.

Roztwór standardowy, o danym pH i ustalonym stężeniu flurazepamu, podaw ano w bezpośrednie otoczenie badanej komórki. Prądy synaptyczne wykazywały bardzo duże zróżnicowanie zarówno jeśli idzie o am plitudę jak i przebieg czasow y (Ryc. 1A) dlatego też w celu ich opisania każdorazowo dokonano ich algebraicznego uśrednienia (Ryc. IB). Do akwizycji i analizy

danych w ykorzystano pakiety programowe clampex 9.2 i clam pfit 9.2 (Axon Instruments).

R yc. 1. P rzyk łado w e re je stracje m IPSC d la różnych w artości p H (A) o ra z u śred nion e wartości Prądów m ierzo nyc h w da nyc h w arunk ach (B). W artości w zględ nej a m p litud y m in iaturow y ch prądów sy na ptyc zny ch d la różnych w artości pH z ew ną trz kom órkow eg o (z m ierz one z przynajm niej n = 3 ko m ó rek) (C).

Stosując wyżej opisaną m etodologię, dokonano analizy zależności am plitudy m iniaturowych prądów synaptycznych od zewnątrzkom órkowego pH i stężenia flurazepamu. W artość średniej amplitudy dla kontrolnego pH = 7.2 wyniosła 44.8 ± 1.3 pA (n = 50). Stwierdzono, że zm niejszające się pH powoduje początkowo w zrost am plitudy mIPSC (dla pH = 6.5), ale dalsze zm niejszanie wartości pH prowadzi do zmniejszenia tego param etru [Ryc. 1C]. Wyniki te potwierdzają efekt jo n ó w wodorow ych na prądy GA BA ergiczne opisany w pracach [3, 8]. Flurazepam zwiększał am plitudę mIPSCs, ale efekt ten był zależny od w artości pH. Ryc. 2A-D przedstawia w zględne zm iany amplitud (względem średniej am plitudy mIPSCs zmierzonej przy pH = 7.2 na tej samej kom órce) przy różnych wartościach pH i stężeniach flurazepamu.

A

В

С

I 10

В

D

R y c. 2. W y kres zależnośc i w zględnej am p litud y m IP SC od stęż en ia flu razep am u (p rze ryw an ą lin ią zaz nac zon o po zio m o dpo w ia dając y w artości w zględnej am plitu d y [IpH+ п11Г1т.ршп/ IpH=72J dla pH = 7.2) d la (A ) pH = 5.5, (B ) pH = 6.0, (C) pH = 6.5 i (D ) pH = 7.2, (E ) w zg lę dn a w artość am p litud y (m ierz on e w zg lęde m pH ko ntrolneg o = 7.2), (F) w arto ść w zględn ej am p litud y [IpH +

йипшфшц/ I,,h1 o dnies ione j do danej w a rtości pH.

N ajw iększy wpływ flurazepam u na amplitudę stw ierdzono przy wartości pH = 5.5: choć średnia am plituda mIPSCs przy pH = 5.5 i nieobecności flurazepam u uległa zm niejszeniu do 0.75 ± 0.05 (n = 5, w zględem am plitud przy pH kontrolnym równym 7.2) to przy stężeniu 3 цМ flurazepam u amplituda wzrastała do 1.45 ± 0.02 ( n = 3) (Ryc. 2A). Dla porów nania, przy pH = 7.2 i stężeniu flurazepam u 3 цМ w ystąpił wzrost amplitudy do 1.21 ± 0.09 (n = 4)

[Ryc. 2D]. Wyniki te w skazują na bardzo w ażną obserwację, że wpływ flurazepamu na am plitudy mIPSCs jest uzależniony od w artości pH w środowisku zew nątrzkom órkowym . Zależność efektu flurazepam u od pH jest jeszcze lepiej w idoczna na [Ryc. 2E] przedstawiającym wpływ flurazepam u na am plitudę mIPSCs m ierzoną i odnoszoną do wartości am plitud dla określonego pH (przy nieobecności flurazepamu). W zrost am plitudy przez flurazepam zależał m onofonicznie od pH i dla 1 цМ flurazepam u przy pH = 5.5 względna am plituda wyniosła 1.81 ± 0.06 ( n = 3), przy pH = 6.0 1.34 ± 0.09 ( n = 3), przy pH = 6.5 1.22 ± 0.03 (n = 3) i przy pH 7.2 1.20 ± 0.02 (n = 5).

Stężenie 1 цМ flurazepamu okazało się być w ystarczające do nasycenia efektu wzrostu am plitudy - jak widać na (Ryc. 2A-D ) dalsze zwiększanie stężenia nie w yw ołuje znaczących zmian w wartości amplitudy.

Przedstaw ione wyniki pokazują, że flurazepam wpływa na zwiększenie am plitudy m IPSC, a efekt oddziaływ ania flurazepamu je st zależny od wartości pH przy jakim to oddziaływanie zachodzi. Bardzo wyraźnie w idoczne jest, że zm niejszenie stężenie protonów (zakwaszenie roztw oru), powoduje silne zwiększenie w pływu flurazepam u, co może sugerow ać, że w niższych wartościach pH następuje łatw iejsze wiązanie się tego związku do receptora GABA i przez to s i l n i e j s z ą m odulację jeg o funkcjonowania. Efekt ten m oże być także związany z przyjm owaniem przez flurazepam różnych właściw ości zależnych od pH np. uprotonowania, dimeryzacji, w pływ ających na m ożliwość wiązania się związku oraz jego właściw ości m odulacyjne. Ta m ożliwość jest jedn ak mało prawdopodobna ze względu na to, że wartość pKa dla flurazepam u wynosi 8.16, co sugeruje iż zakwaszanie roztworu poniżej w artości kontrolnej (7.2) nie pow inno istotnie wpływać na uprotonowanie flurazepam u. Jest możliwe, że różny w pływ flurazepamu na am plitudy m IPSCs przy różnych wartościach pH je st konsekw encją nakładania się wpływ u tych dwóch czynników w w arunkach bardzo krótkiej ekspozycji receptorów na synaptycznie wydzielony GABA. Przy silnie kwaśnych pH, stała w iązania staje się tak powolna, że bardzo krótkotrw ała ekspozycja receptorów synaptycznych na neuroprzekaźnik (czas przebywania neuroprzekaźnika w synapsie jest szacowany na ok. kilkaset mikrosekund, [15]) je st niew ystarczająca by doszło do aktywacji receptorów w takim stopniu jak ma to m iejsce w warunkach kontrolnych. Pojaw ienie się flurazepamu przy kwaśnym pH odw raca efekt zakwaszenia środow iska na stałą wiązania. Należy jed nak podkreślić, że niska wartość pH w pływ a ponadto na zmniejszenie desensytyzacji [3]. A zatem, sum aryczne działanie obniżonego pH i flurazepam u może doprow adzić do zm niejszenia desensytyzacji przy niezm ienionym lub naw et zwiększonym pow inowactwie receptora GABAa do jego agonisty (w pływ pH i flurazepam u na

stałą w iązania się kom pensują). W tej sytuacji, w ydzielony synaptycznie agonista, przy niskim pH i w obecności flurazepam u, m oże doprowadzić do znacznego wzrostu am plitudy mIPSCs, gdyż większa proporcja związanych receptorów przejdzie do stanu konform acyjnego otw artego kosztem stanu zdesensytyzowanego (patrz dyskusja o m echanizmie wpływ u pH na receptory GABAA w parcy [3]).

K onkludując, najważniejszym wnioskiem z niniejszej pracy jest to, iż flurazepam silnie m oduluje GABA ergiczne prądy synaptyczne i efekt ten je st bardzo istotnie m odulow any przez zmiany w artości pH środowiska zew nątrzkom órkowego. O bserwacja ta w ydaje się bardzo ważna, gdyż jak ju ż wspom niano we w stępie, wartość pH roztworów zewnątrzkom órkowych może ulegać istotnym zm ianom w różnych stanach fizjologicznych i patologicznych.

Piśmiennictwo

1. D ia n-Shi W a ng ,a, S hu n-Y an Lu, Z h en Hong and Hai-Lei Z h u a (20 03 ) B iphas ic action o f m idaz olam on G A B A A reccpto r-m cdia ted re sponses in rat sacral d orsal com m issural ne urons. B ioc he m ica l a n d B iop hys ica l R esearch C om m unications. 309 (2 003 ) 8 9 3 -89 9 . 2. R e ynolds J. N.. M aitra R. (1 996) Propofol and flurazepam act sy ne rgistic ally to po tentiate

G A B A a re c ep to r a ctivatio n in hum an re com bina nt receptors. E u ro pe an J. o f P ha rm a colog y 3 14 151-156.

3. M oz rzym as J.W ., Ż am o w sk a E .D ., Pytel M., M ercik K. (2003). M od ulation o f G A B A a re ce pto rs by hy drog en ions reveals syn aptic G AB A tran sie nt and a crucial role o f the d ese ns itiza tio n process. J.N eurosc i. 23: 7 981-7 992.

4. P on ce r J.C ., D u rr R., G a hw iler B.H. and T ho m pson S .M.. M odu la tio n o f S yn aptic G A B A a R e cepto r F un ctio n by B enzo diaz epin es in A rea C A3 o f Rat H ip pocam p al Slice C ultures.

N e ur op ha rm a co lo gy . Vol. 35. N o.9/1 0 1169-1179.

5. M .V., W es tbro ok G .L. (1 995 ) D esensitized states pro lon g G A B A a chann el resp onse s to b rie f agonis t pulse s. N eu ro n 15: 181-191.

6. M ing-D e W ang, M o zib ur R a hm an, Di Z hu, (2005) P rotons inh ibit Cl c on du ctanc e by direct o r alloste ric in tera ctio n with the B A G A -bin ding site in the rat rec om b ina nt antl cx,ß2 G A B A a recep tor. E uro. J. o fP h a r m . 528 I - 6.

7. A nd jus P .R.. S tev ic -M arino vic Z ., C herub ini E. (1997) Im m un oglo bulins form m otoneu rone diseas e pa tie nts en ha nc e glutam ate release from rat hippocam pal ne uro ns in cu lture, 504 103-

112.

8. Pa ste rnac k M ., S m irn ov S., K aila K. (1996) Proton M odu la tio n o f F un ctiona lly D istinct G A B A a R e cepto rs in A cutely Isolated Pyram idal N euron s o f Rat H ippoc am pus.

N eu ro p ha r m ac o lo g y V ol. 35, No. 9/10. 1279 - 1288.

9. W afford K.A. (2 005 ), G A B A a re cep tor subtypes: any c lue s to th e m echan ism o f b en zo diaz ep in e d e pen de n ce ? C urrent O pinion in P h arm aco log y 5: 47 - 52.

10. K rishek B .J., A m ato A. (19 96), Proton se nsitivity o f the G A B A a re ce p to r is a sso ciate d with re cep to r su b un it co m po s itio n . J. P hysiol. 492 ( Pt 2 ):4 3 1 -43.

11. B erezhon y D., N yfelet Y., G on th ier A. (200 4) On the B e nzo d iaz ep ine B ind ing Poc ket in G A B A A R eceptors . J. B iolo g. Chem. Vol. 279, No. 5 3 1 6 0 - 3 1 6 8 .

12. O gris W ., Poltl A., Siegh ard W., (2004) Affinity o f variou s be nz od iaz ep in e site ligands in m ice w ith a p oin t m utatio n in the G A B A a re ce pto r y2 sub unit. B ioc h em ic a l P ha rm a c olo gy 68

1 62 1-1 629 .

13. B oileau A.J., B a ur R., Sha rkey E., Singel E., C z ajkow ski C. (200 2) T he rela tive am ount o f cR N A c od ing for g2 s ubu nit affects stim u lation by b en zod ia ze p ine s in G A B A a re ceptors e xpresse d in X e no p u s oocytes. N eur op ha rm a colog y 43 695 - 700.

14. B orch ardt M. (199 9) R e view o f the clinical Pharm acology a nd use o f the b en zod iaz ep ine s. J.

P erian esthe sia N u rsing, Vol. 14 No. 2 65 - 72.

15. M o zrzym as J.W . (2 004 ) D ynam ism o f G A B A a re cep tor a ctivatio n sha pes the “p erso nality” o f G A B A a rec e p to r activ ation shapes the “p erso nality” o f inh ib itory synapses.

N e urop h arm a co lo gy , 47 9 4 5 -9 6 0 .

A dres do kore spondenc ji: P io t r B rz eź nic ki Sam odzie lna Pra cow nia B iofizyki U kła du N e rw ow e go K a tedra Biofizyki A k ad em ia M e dy czn a we W rocław iu ul. C hału bińs kieg o 3 50-36 8 W rocław T e l.:(4 8 7 1 )7 8 4 1 5 5 1 e-m ail: p brz ez@ interia .pl