HANNA
FABCZAK, KATARZYNA
SOBIERAJSKA
i STANISłAW
FABCZAK
Zakład Biologii KomórkiInstytut Biologii Doświadczalnej im. Nenckiego PAN Pasteura 3, 02-093 Warszawa
e-mail:h.fabczak@nencki.gov.pl k.sobierajska@nencki.gov.pl s.fabczak@nencki.gov.pl
DIMER bg BIAŁKA G — CZĄSTECZKA SYGNAŁOWA WPROWADZENIE
Wiele hormonów, neurotransmiterów, che-mokin oraz lokalnych aktywatorów i czynni-ków sensorycznych oddziaływując z serpen-tynowymi (siedmio-transbłonowymi) recepto-rami (ang. G-protein coupled receptor, GPCR), zlokalizowanymi w błonie komórkowej, ini-cjuje szlaki przekazywania sygnału, których jed-nym z głównych elementów są heterotrimery-czne białka G. Białka G, wiążące i hydrolizujące GTP, zbudowane są z trzech podjednostek:a, b i
g (STRYERi BOURNE1986, GILMAN1987, NEERi CLAPHAM1988, BIRNBAUMER1990). Głównie ze względu na GTP-azowe własności podjednostki
a, początkowo badania nad sygnalizacyjną rolą
białek G skupiły się na poznaniu funkcji tego polipeptydu (GILMAN 1987, STRYER 1986). Uważano, że tylko ta podjednostka pełni funk-cje sygnalizacyjne, podczas gdy dimerowi bg przypisywano jedynie rolę regulatora Ga i czyn-nika zakotwiczającego białko G w błonie ko-mórkowej (CLAPHAMi NEER1997). Obecnie jed-nak już wiadomo, że kompleksbg odgrywa nie mniej ważną rolę niż Ga i jest odpowiedzialny nie tylko za właściwą interakcję białka G z re-ceptorem po jego aktywacji (FIGLERi współaut. 1996, YASUDAi współaut. 1996), ale również za inicjację wymiany GDP na GTP przyłączanych do podjednostki Ga (TAYLORi współaut. 1996,
YASUDA i współaut. 1996). Ponadto wykazano, że kompleks bg może oddziaływać z wieloma efektorami i odgrywa dominującą rolę w kon-troli niektórych funkcji komórki. Dla przykładu w drożdżach Gbg jest głównym przekaźnikiem sygnału inicjowanego przez feromony (WHI-TEWAY i współaut. 1995). Również w odpo-wiedzi chemotaktycznej zarówno leukocytów (ARAI i współaut. 1997, NEPTUNE i BOURNE 1997), jak i Dictyostelium discoideum (WU i współaut. 1995, PERACINO i współaut. 1998), Gbg odgrywa kluczową rolę. Wiele doniesień wskazuje, że Gbg jest regulatorem przewodn-ości jonowej selektywnych kanałów K+(IKACh) w komórkach mięśnia sercowego i mózgu (LOGOTHESIS i współaut. 1987, SCHNEIDER i współaut. 1997), fosfolipazy Cb (RHEE i BAE 1997), cyklazy adenylanowej (SUNAHARA i współaut. 1996) oraz kinaz receptorów związa-nych z białkami G (ang. G-protein coupled re-ceptor kinases, GRKs) (PITCHER i współaut. 1992). Sygnalizacyjne własności zarówno pod-jednostki Ga, jak i kompleksu Gbg, stwarzają szansę równoczesnego kontrolowania dwóch efektorów po aktywacji receptora. Dodatkowo, zróżnicowanie struktury białek G (obecność wielu typów podjednostek Ga-20, Gb-6 i Gg-18) daje możliwość zwielokrotnienia liczby
punk-Numer 3–4 (264–265)
Strony
355–372
Praca finansowana w ramach grantu badawczego KBN Nr P04C01427 oraz działalności statutowej Instytutu Bio-logii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN.
tów docelowych, do których dociera sygnał, mechanizmów kontroli i rodzaju włączanych wtórnych przekaźników.
Celem tej pracy jest omówienie struktury, szlaków sygnalizacyjnych i możliwości regula-cji aktywności dimeru Gbg.
STRUKTURA I ODDZIAŁYWANIE Gbg Wprawdzie podjednostka Gbg zbudowana
jest z dwóch polipeptydówb i g, to jednak funk-cjonuje ona jako monomer, gdyż podjednostki te ulegają dysocjacji jedynie po denaturacji kompleksu. Dowodów na zróżnicowanie po-między poszczególnymi typami podjednostek
b i g w komórkach ssaków dostarczyło
moleku-larne klonowanie cDNA tych polipeptydów. Pierwsze badania izolowanego cDNA ko-dującego podjednostki b wykazały istnienie dwóch różnych genów kodujących białka o masie cząsteczkowej 36 kDa i 35 kDa. Do tej pory zidentyfikowano 6 typów podjednostek
b, włączając w to warianty powstałe w wyniku
alternatywnego składania (ang. splicing) ge-nów oraz 12 typów podjednostkig (CLAPHAMi NEER1997). Na podstawie homologii sekwen-cji aminokwasów wyróżniono kilka podro-dzin, do których zakwalifikowano poszczegól-ne podjednostki. W przypadku Gb podjednost-kib1-b4 charakteryzują się 80% identycznością w ponad 340 aminokwasowej sekwencji, nato-miastb5 i jej dłuższa forma, b5L, różnią się od pozostałych podjednostek i wykazują zaledwie 53% homologię z pozostałymi członkami tej
ro-dziny. Znalazło to odbicie w lokalizacji tych dwóch typów podjednostek, podjednostkab5 występuje wyłącznie w centralnym układzie nerwowym, zaś —b5L jedynie w siatkówce oka (WATSON i współaut. 1994, 1996).
W podjednostce Gb można wyróżnić dwa strukturalnie odmienne rejony. Na N-końcu, około 20 aminokwasów tworzy a helisę, zaś reszta molekuły utworzona jest przez motyw sekwencyjny, powtórzony 7-krotnie. Taka for-ma wielokrotnych powtórzeń sekwencji, na-zwana powtórzeniami WD, nie występuje je-dynie w Gb, lecz można ją znaleźć również w wielu innych białkach (około150), zaliczanych do nadrodziny WD-powtórzeń (NEER i współaut. 1994). Białka należące do tej ro-dziny, mimo podobieństwa w strukturze cząsteczki pełnią odmienne funkcje (SMITH i współaut. 1999). Analiza struktury krysta-licznej fragmentu WD Gb, przeprowadzona w dwóch niezależnych laboratoriach wykazała, że fragment WD-powtórzeń jest utworzony z
b-pasm (ang. b-strands), które ułożone są w
pierścień, tworzący strukturę „turbiny” (Ryc. 1). Każda łopatka „turbiny” jest
utwo-Ryc. 1 Struktura dimeru Gb1g2. Zaznaczono fragment WD-powtórzeń (wg GAUTAMA i współaut. 1998).
rzona z czterech skręconych b pasm, a kolis-tość całej struktury jest utrzymana dzięki zamknięciu molekularnego zatrzasku (ang. vel-cro-snap) na 7 łopatce(CLAPHAMi NEER1997, GAUTAM i współaut. 1998).
Badania krystalograficznej struktury hete-rotrimerycznego kompleku Gabg wykazały, że centrum cząsteczki stanowi podjednostka Gb posiadająca kilka różnych powierzchni od-działywania. Między Ga i Gb występują dwa nie zachodzące na siebie rejony kontaktu, z któ-rych ten ważniejszy zlokalizowany jest na krót-kim odcinku, w pobliżu regionu aktywnego (ang.switch II Ga). Przyłączenie GTP, podczas aktywacji szlaku sygnalizacyjnego, prowadzi do zmian konformacyjnych cząsteczki Ga, któ-rych konsekwencją jest jej dysocjacja od kom-pleksu Gbg. Powierzchnia oddziaływania mię-dzy Gb i Gg przebiega na całej długości cząsteczkig, a na N-końcu około 20 aminokwa-sowe fragmentya helisy obu podjednostek for-mują strukturę skręconej śruby (ang. coiled-co-il) (WALL i współaut. 1995). W podjednostce Gg nie występuje oddziaływanie między dome-nami tej cząsteczki, ale wszystkie miejsca wiązania znajdują się miedzy Gb i Gg (CLAPHAM i NEER 1997).
Pomimo wysokiej homologii jaka wystę-puje w rodzinie Gb (b1-b4), nie wszystkie jej typy mogą łączyć się z wszystkimi rodzajami
Gg. PRONIN i GAUTAM (1992) wykazali, że g1 może tworzyć kompleks zb1, lecz nie z b2, pod-czas gdy obie podjednostkib łączą się z g2 i g3. Wykazano, że podjednostki b1 i b2 są w 90% identyczne, więc interesujące jest, które z 33 reszt aminokwasowych, którymi różnią się miedzy sobą te białka, są odpowiedzialne za specyficzność kompleksu z odpowiednią pod-jednostkąg. Regiony nazywane coiled-coil obu podjednostek b są bardzo homologiczne i róż-nią się jedynie dwoma aminokwasami (Lys
ver-sus Arg w pozycji 15 i Ala verver-sus Ser w pozycji
28). Wydaje się jednak, że region ten jest główną domeną dimeryzacyjną i nie decyduje o specyficzności wiązania, za którą najprawdo-podobniej odpowiedzialne są domeny zlokali-zowane na 5 i 6 „łopatce” domeny WD Gb (G AR-RITSEN i SIMONDS 1994). Natomiast region w cząsteczce Gg, który określa specyficzność tworzenia kompleksu z poszczególnymi pod-jednostkami Gb1 lub Gb2 zlokalizowany jest w segmencie zbudowanym z 14 aminokwasów, blisko środka cząsteczki (SPRINGi NEER1994). Późniejsze badania wykazały, że 5 reszt amino-kwasowych występujących w 14 aminokwa-sowym segmencie pełni istotną rolę w omawia-nym procesie, a szczególne znaczenie mają tri-plety Glu38-Glu39-Phe40 (LEE i współaut. 1995) i Cys36-Cys37-Glu38 (MEISTER i współaut. 1995).
POTRANSLACYJNA MODYFIKACJA KOMPLEKSU Gbg IZOPRENYLACJA PODJEDNOSTKI g
Podjednostki g nie wykazują tak wysokiej homologii, jaka występuje w przypadku Gb, dlatego funkcjonalne zróżnicowanie komplek-su Gbg przypisuje się raczej g podjednostce. W zależności od przyjętych kryteriów białka na-leżące do tej rodziny można podzielić na kilka podrodzin, ale chyba najbardziej przejrzysta klasyfikacja tych polipeptydów opiera się na ty-pie potranslacyjnej modyfikacji. Podjednostki g1, gc występujące w komórkach fotorecepto-rowych należą do podrodziny I (PENG i współaut. 1992, ONGi współaut. 1995). Do tej samej grupy zalicza sięg11, której sekwencja aminokwasowa wykazuje 76% podobieństwo dog1 i dlatego początkowo przypuszczano, że lokalizacja tego białka jest również ograniczo-na do siatkówki (GAUTAM i współaut. 1998). Obecnie wiadomo, że występuje ono także w płucach, mózgu oraz płytkach krwi (M ORISHI-TA i współaut. 1998). Grupę drugą stanowią
pozostałe podjednostki. Wśród nichg2, g3 i g4 wykazują wyższą homologię w stosunku do sie-bie. Jednak nie ma to związku z ich lokalizacją w organizmie. Podjednostkig3 i g4 występują w mózgu, podczas gdyg2, podobnie jak g5, g7, g12, można znaleźć w różnych tkankach. Z ko-lei, podjednostkag8 ulega ekspresji w komór-kach węchowych (GAUTAM i współaut. 1989, CALI i współaut. 1992, KALYANARAMAN i współaut. 1995, ASANO i współaut. 1995, MORISHITA i współaut. 1998).
Białka należące do rodziny podjednostekg ulegają potranslacyjnej modyfikacji, prenylacji, polegającej na przyłączeniuizoprenoidudo cy-steiny w zlokalizowanym na C- końcu cząstecz-ki motywie CAAX (C-cysteina, A-aminokwas
ali-fatyczny, X-dowolny aminokwas). Po prenyla-cji trzy aminokwasy (AAX) są odcinane i odsłonięta reszta cysteinowa ulegametylacji.
Ostatni aminokwas X, występujący w tym motywie, determinuje rodzaj modyfikacji. Spo-śród 11 białek należących do rodziny Gg, do
trzech z nich (g1,gc i g11), stanowiących p od-rodzinę I przyłącza się 15 węglowa reszta far-nezylowa, podczas gdy pozostałe białka ulegają modyfikacji przez przyłączenie 20 węglowej reszty geranylgeranylu (MYUNG i współaut 1999). Farnezylacja lub geranylgeranylacja Gg nie jest wymagana do dimeryzacjiGb i Gg. Jed-nak proteolityczne odcięcie trzech aminokwa-sów z C-końca Gg, odpowiedzialnych za izopre-nylację czyni takie białko niezdolnym do połączenia z Gb. Sugeruje to, że utworzenie kompleksu Gbg następuje przed usunięciem trzech ostatnich aminokwasów i metylacją cy-steiny (HIGGINS i CASEY 1994).
Lipidowa modyfikacja podjednostki g jest ważna ze względu na możliwość zakotwicze-nia kompleksu Gbg w błonie komórkowej (FUKADA i współaut. 1990, WEDEGAERTNER i współaut.1995). Nieznany jest wprawdzie me-chanizm, dzięki któremu taka modyfikacja białek g przyczynia się do lepszego umiejsco-wienia ich w błonie, ale należy przypuszczać, że izoprenylowa reszta zakotwicza się bezpo-średnio w hydrofobowej błonie lipidowej. Na-suwa się jednak pytanie, czy ta modyfikacja jest wystarczająca do zakotwiczenia kompleksu
Gbg w błonie komórkowej. Inne białka preny-lowane, np. białka należące do rodziny małych białek G (białka Ras), korzystają z dodatkowe-go mechanizmu (palmitylacji) łączącedodatkowe-go je z błoną komórkową (HANCOCK i współaut. 1990, TAKIDAi WEDEGAERTNER2003). Podob-nie, w przypadku podjednostki g białka G z drożdży, stwierdzono palmitylację cysteiny w pobliżu motywu CAAX (HIRSCHMANi JENNESS
1999). Jednak w cząsteczce Gg człowieka nie znaleziono w pobliżu motywu CAAX domeny,
która mogłaby być dodatkowo palmitylowana (TAKIDA i WEDEGAERTNER 2003). Prawdopo-dobnie dlatego ekspresja Gbg w komórkach HEK293 wykazała, że kompleks ten w takich warunkach doświadczalnych bardzo słabo wiąże się z błoną komórkową i głównie zlokali-zowany jest w błonie retikulum endoplazma-tycznego, a dopiero ko-ekspresja Gbg i Ga pro-wadzi do silnego połączenia Gbg z błoną ko-mórkową (EVANKO i współaut. 2001). W na-stępnym etapie badań wykazano, że izopreny-lacja podjednostkig jest konieczna, ale nie wy-starczająca do zakotwiczenia kompleksu Gbg do błony komórkowej. Dodatkowym niezbęd-nym wymaganiem jest połączenie z podjed-nostką a, która jest palmitylowana. W mutan-tach pozbawionych zdolności ekspresji pod-jednostki a, ale tak zmienionych, aby Gg ule-gała palmitylacji, kompleks Gbg łączy się z błoną komórkową (TAKIDA i WEDEGAERTNER 2003).
Modyfikacje lipidowe g podjednostki są niezbędne nie tylko do utworzenia pra-widłowego kompleksu, ale mają również swoje następstwa funkcjonalne. W Tabeli 1 zestawio-no przykłady białek będących potencjalnymi
efektorami Gbg i wymagającymi do swojej akty-wacji izoprenylacji dimeru.
FOSFORYLACJA Gbg
WIELANDi współaut. (1993) wykazali, że w ludzkich komórkach leukemicznych (ang. hu-man leukemia cells, HL-60)Gb może być fosfo-rylowana na reszcie histydynowej przez specy-ficzny enzym wykorzystujący GTP jako sub-strat. W podobny sposób transducyna (Gt) w Prenylacja Oddziaływanie Funkcjonalne następstwa
b1g1 Ga brak prenylacji b1g1; brak wspomagania ADP-rybozylacji
przez PTX aoi at(1, 2)
b1g2 cyklaza adenylowa (AC)
brak prenylacji b1g2; brak hamowania AC typu Ilub brak stymulacji AC typu II w błonie (3, 4)
b1g1 fosfolipaza C (PLC) brak prenylacjib1g1; brak stymulacji PLCb(4, 5) Gt rodopsyna farnezylowany peptyd odpowiadający C końcowi
g1spe-cyficznie hamuje oddziaływanie Gtz receptorem (rodop-syną) (6)
Tabela 1. Efekt lipidowej modyfikacji kompleksu Gbg.
Referencje: (1) HIGGINSi CASEY1994, (2) OHGUROi współaut. 1992, (3) INIGUEZ-LLUHIi współaut. 1992, (4) MYUNGi współaut. 1999, (5) D IE-TRICHi wspólaut. 1994, (6) KISSELEVi współaut. 1994.
siatkówce oka może być fosforylowana przez analog GTP, GTPgS (WIELAND i współaut. 1992). Autorzy sugerują, że grupa fosforanowa może być przenoszona z ufosforylowanej histy-dyny na GDP związane z podjednostkąa. W ten sposób mogłaby funkcjonować alternatywna droga aktywacji Ga (KOWLURU i współaut. 1996). Mimo swojej atrakcyjności przypusz-czenie takie jest bardzo kontrowersyjne, gdyż wielu badaczy uważa, że możliwość aktywacji szlaków sygnalizacyjnych z pominięciem re-ceptora nie ma miejsca w systemach biologicz-nych (HOHENEGGERi współaut. 1996). Z dru-giej strony, wregulatorze osmolarnościu droż-dży wykazano możliwość przesunięcia grupy fosforanowej z histydyny na białko, które mo-duluje szlak kinaz MAP (MAEDA i współaut. 1994). Również ostatnie doniesienia dowodzą w badaniach in vitro, że transfer wysokoener-getycznej reszty fosforanowej z jednej z histy-dyn Gb (His-266) przy udzialekinazy
nukleoty-dowej B (ang. nucleoside diphosphatate kina-se,NDPK B) może prowadzić do aktywacji he-terotrimerycznych białek G. His-266 jest kon-serwowana w podjednostkach b1-b4, nie wy-stępuje natomiast w podjednostce b5, która różni się znacznie od pozostałych białek na-leżących do tej rodziny i w pozycji 266 posiada lizynę (CUELLO i współaut. 2003).
Kolejnym przykładem fosforylacji jest białkoSet4 (odpowiednikGbu drożdży), które w odpowiedzi na stymulację feromonem ulega fosforylacji w dodatkowym regionie 41 reszt aminokwasowych, umiejscowionym pomię-dzy 5 a 6 łopatką domeny WD. U innych Euka-ryota nie stwierdzono sekwencji homologicz-nych do dodatkowych aminokwasów białka Set4. Usunięcie tego łącznika nie wyklucza udziału Set4 w odpowiedzi na feromon, ale czy-ni takie mutanty bardziej wrażliwymi na stymu-lację i zaburza procesy adaptacyjne (COLE i REED 1991).
REGULACJA Gbg PRZEZ FOSDUCYNĘ W przekazywaniu sygnału w komórkach
eukariotycznych oprócz receptora, białek G, efektorowych białek enzymatycznych oraz wtórnych przekaźników, istotną rolę odgry-wają dodatkowe białka regulatorowe, kontro-lujące aktywność białek G. Można wśród nich wyróżnić dwie zasadnicze grupy. Do pierwszej grupy należą białka RGS (ang. regulators of G-protein signaling), które łączą się bezpośred-nio do aktywnej, połączonej z GTP, podjed-nostki a białka G (Ga) (HOLLINGER i HEPLER 2002). Do drugiej — białka z rodziny fosducyn, które posiadają w swojej cząsteczce domeny odpowiedzialne za wiązanie się z podjed-nostkamibg białka G (Gbg) (SCHULZ2001, FAB-CZAKi współaut. 2003). To właśnie ta zdolność i współzawodnictwo między fosducyną a Ga w wiązaniu się z podjednostkami Gbg jest jedną z możliwości kontroli mechanizmu przekazywa-nia sygnału w komórce. Utworzenie kom-pleksu fosducyna-Gbg wiąże się z translokacją Gbg do cytoplazmy i zjawisko to jest prawdo-podobnie odpowiedzialne za hamowanie szla-ku sygnalizacyjnego z udziałem białek G. Tak więc, dysocjacja i reasocjacja podjednostek Gbg z udziałem fosducyny jest jednym z głów-nych czynników regulujących aktywność białek G (LEE i współaut. 1987, 1990). Chara-kter oddziaływań fosducyny z podjednostkami Gbg był badany przy wykorzystaniu
promienio-wania X (GAUDET i współaut. 1996). Uporządkowanie krystalograficzne struktury fosducyny wskazuje na obecność dwóch głównych domen. Pierwsza domena to polarny N-koniec (pierwsze 105 aminokwasów) z dwo-ma helisami, tworzący powierzchnię od-działywania z „górną” powierzchnią Gb, po-wierzchnią, która oddziaływuje z Ga w kom-pleksie Gabg (HAWESi współaut. 1994, GAUDET i współaut. 1996, XU i współaut. 1995). Do-mena ta współzawodniczy z Ga w wiązaniu do Gbg i uniemożliwia utworzenia heterotrimeru Gabg. Pierwsze 63 aminokwasy wchodzące w skład helisy 1 tworzą rdzeń N-końca, a w pozy-cji 29 występuje ważny funkcjonalnie amino-kwas, tryptofan (Try-29), istotny w interakcji fosducyny z podjednostką Gb (XUi współaut. 1995). Wiązanie fosducyny do Gbg jest możli-we jedynie w przypadku, kiedy fosducyna występuje w formie zdefosforylowanej. LOEWi współaut. (1998) sugerują, że wiązanie fosdu-cyny do podjednostek Gbg powoduje zmiany konformacyjne, w konsekwencji których nas-tępuje przemieszczenie kompleksu Gbg z błony do cytoplazmy. Translokacja ta mogłaby być odpowiedzialna za hamowanie przeka-zywania sygnału wewnątrzkomórkowego (LEE i współaut. 1990).
Druga domena zlokalizowana na końcu C fosducyny, jest strukturalnie podobna do
tio-redoksyny (GAUDET i współaut. 1996) i łączy się tylko z zewnętrznym pasmem podjednostki Gb. Powinowactwo C-końca fosducyny do pod-jednostkib białka G jest dwukrotnie niższe niż stwierdzono to w przypadku N-końca (HAWESi współaut. 1994, Xu i współaut. 1995, TANAKAi współaut. 1997). Obie domeny, które w fosdu-cynie rozdzielone są przestrzenie, prawdo-podobnie również pełnią odmienne funkcje w komórce. N-końcowa domena odpowiedzialna jest za współzawodnictwo z podjednostką Ga w wiązaniu podjednostek Gbg, natomiast C-końcowa domena, tioredoksynowa, miałaby odpowiadać za translokację podjednostek Gbg z błony do cytoplazmy. Badanie wiązania dwóch domen fosducyny z Gbg, jako niezależ-nych struktur, okazało się bardzo użyteczne w poznaniu różnych aspektów oddziaływania podjednostek białka G z efektorami i podjed-nostką Ga. Doświadczenia przeprowadzone przez HAWESA i współaut. (1994) oraz XU i współaut. (1995) potwierdziły wcześniejsze przypuszczenia, co do funkcji N-końcowej do-meny fosducyny. Badacze ci wykazali, że N-ko-niec fosducyny po przyłączeniu podjednostek Gbg, tak jak zakładano wcześniej, może hamo-wać ich funkcje. Oddziaływanie to jest jednak niewystarczające do odłączenia Gbg od błony (TANAKA i współaut. 1996). Natomiast pozba-wienie fosducyny domeny N-końcowej nie przeszkadza w interakcji końca C tego białka z Gbg (SATOH i współaut. 1998), ale połączenie to także nie jest w stanie spowodować
trans-lokacji podjednostek Gbg do cytoplazmy. Praw-dopodobnie w tym przypadku, przy braku N-końca, powierzchnia oddziaływania tych dwóch białek jest jednak zbyt mała, aby wyt-worzyć stabilne oddziaływania między nimi (TANAKA i współaut. 1996).
Podjednostki Gbg zakotwiczone są do błony komórkowej za pośrednictwem hydro-fobowej reszty farnezylowej przyłączonej do podjednostki g białka G (MURRAY i współaut. 2001). Wiązania hydrofobowe są dodatkowo wzmocnione oddziaływaniami elektrostatycz-nymi. Przyłączenie fosducyny powoduje osłabienie wiązań elektrostatycznych pomię-dzy błoną a Gbg o jeden rząd wielkości. Ponad-to należy pamiętać, że przyłączenie fosducyny następuje tylko po oddysocjowaniu Ga. Roz-dzielenie heterotrimeru może być również po-wodem osłabienia wiązania Gbg do błony (omawiano to powyżej). Równocześnie nastę-pują nieznaczne zmiany konformacyjne pod-jednostki Gb, które dodatkowo osłabiają wiąza-nie dimeru Gbg z błoną i w rezultacie powo-dują translokację kompleksu fosducyna-Gbg do cytoplazmy (LOEWi współaut. 1998, MURRAYi współaut. 2001). Ponadto należy zaznaczyć, że fosducyna wiąże się z podobnym powinowac-twem do różnych kombinacji kompleksu pod-jednostki Gb z podjednostką Gg (GAUDET i współaut. 1996, 1999, MÜLLER 1996). Nie stwierdzono natomiast kontaktu fosducyny z podjednostką Gg w kompleksie Gbg.
ODDZIAŁYWANIE Gbg Z RECEPTOREM
Do aktywacji białek G w wyniku stymulacji receptora wymagana jest obecność heterotri-meru Gabg. W układzie tym dimer Gbg wzmac-nia wiązanie Gado odpowiedniego receptora (HIGASHIJIMA i współaut. 1987, HEITHIER i współaut. 1992, PHILLIPS i współaut. 1992a). Ponadto wykazano, że kompleks Gbg wiąże się bezpośrednio do oczyszczonego receptora b adrenergicznego (HEITHIERi współaut. 1992) oraz do rodopsyny (PHILLIPSi współaut. 1992 a, b). Badania wykorzystujące fluorescencyjnie znakowane podjednostki Gbg sugerują, że kompleks ten może pozostawać związany z ro-dopsyną przez cały cykl aktywacji, nawet po dysocjacji Ga (PHILLIPSi współaut. 1992a, b). Wiadomo też, że Gbg może hamować fosforyla-cję rodopsyny przez kinazę rodopsyny (K ELLE-HER i JOHNSON 1988, KISSELEV i współaut.
1995a, b).Ze względu na fakt, żeodmiennie niż w przypadku innych kinaz receptorów związa-nych z białkami G (np. GRK 2 i GRK3), kinaza rodopsyny nie wiąże się z Gbg, zatem efekt ha-mowania fosforylacji może być skutkiem wiązania się kompleksu Gbg bezpośrednio do receptora. W drożdżach obecność Gbg wyma-gana jest do związania białka G z receptorem feromonu (BLUMER i THORNER 1990), nato-miast badania na mutancie Dictyostelium poz-bawionym Gb wykazały obniżone powinowac-two wiązania chemoatraktantów do receptora, potwierdzając wcześniejsze sugestie, że do pra-widłowego funkcjonowania receptora nie-zbędny jest kompleks Gbg (WALL i współaut. 1995, WU i współaut. 1995). Zdolność wiąza-nia kompleksu Gbg do receptora zależy od typu
Di-mer utworzony z b1g1 umożliwia połączenie Gat (podjednostka a transducyny) z rodop-syną. Jednak po zamianieg1na g2 kompleks ten traci swoje własności (KISSELEV i współaut. 1995a). Kluczowe domeny odpowiedzialne za połączenie miedzy receptorem a białkiem G (rodopsyną a transducyną) zlokalizowane są na farnezylowanym końcu C podjednostki g (KISSELEV i współaut. 1994, 1999). Najnowsze badania wskazują, że podjednostki łączą się z receptorem w określonej sekwencji zdarzeń, a nie równocześnie, jak uprzednio sądzono (CHERFILSi CHABRE2003, GAUTAM2003). Pro-ces inicjowany jest połączeniem podjednostki
g z receptorem (rodopsyną), co umożliwia
przyłączenie do niego podjednostki a. Konse-kwencją tego są zmiany konformacyjne w cząsteczce Ga, w wyniku których następuje uwolnienie związanego GDP i przyłączenie w to miejsce GTP (HERRMANNi współaut. 2004).
Większość z przedstawionych wyników do-tyczy badań w systemach in vitro. Zaskakujące wyniki przedstawili ostatnio AKGOZ i współaut. (2004), wykorzystując znakowanie kompleksu Gbg-GFP (ang. green fluorescent protein) w żywych komórkach. Autorzy ci wy-kazali, że po stymulacji białek G przez receptor następuje natychmiastowa translokacja di-meru Gbg do aparatu Golgiego. Powrót kom-pleksu Gbg do błony komórkowej odbywa się dopiero po inaktywacji receptora. Obserwo-wany proces jest bardzo szybki i czas wymaga-ny do przebycia drogi w obie strowymaga-ny jest rzędu kilku sekund, a wydajność translokacji jest zależna od typu podjednostki g. Szybkie prze-mieszczenie kompleksu Gbg do aparatu Gol-giego po aktywacji receptora może sugerować, że po pierwsze, proces ten zachodzi dzięki dy-fuzji, a po drugie, że w aparacie Golgiego wys-tępuje potencjalny efektor lub efektory dimeru Gbg (AKGOZ i współaut. 2004).
Omawiając zjawisko oddziaływania kom-pleksu Gbg z receptorem nie można pominąć roli, jaką pełni on w jego fosforylacji przez se-rynowo/treoninowe kinazy białkowe
recep-torów sprzężonych z białkami G, kinazy GRK. Kinazy te, to cytoplazmatyczne białka, które przejściowo łączą się z błoną komórkową pod-czas stymulacji receptorów GPCR. Fosforylacja receptora powoduje jego przejściową inakty-wację i jest kluczowym mechanizmem wyłączającym receptor z procesu przekazywa-nia sygnału. W przypadku dwóch izoform tych kinaz, GRK2 i GRK3, niezbędnym po-średnikiem w procesie fosforylacji jest dimer Gbg (PITCHER i współaut. 1992, DAAKA i współaut. 1997). Bezpośrednie połączenie kompleksu Gbg z domeną plekstrynową na C-końcu GRK2 i GRK3 powoduje translokację kinaz do błony komórkowej (KOCHi współaut. 1993). „Okaleczając” GRK2 poprzez usunięcie domeny plekstrynowej pokazano, że na końcu N kinazy zlokalizowane jest drugie miejsce wiązania Gbg, które bierze udział w regulacji GRK2 przy niższych stężeniach Gbg (E ICH-MANN i współaut. 2003). Obecność tego miej-sca wydaje się niezbędna w prawidłowym funkcjonowaniu kinazy, gdyż wyłączenie jego funkcji na skutek podania specyficznych prze-ciwciał uniemożliwia fosforylację rodopsyny przez GRK2. Oddziaływanie pomiędzy dime-rem Gbg a GRK2 jest przykładem wzajemnej re-gulacji. Połączenie Gbg i GRK2 wymagane jest do aktywacji kinazy, ale z drugiej, strony kinaza GRK2 może regulować aktywność sygnaliza-cyjną kompleksu Gbg. Stwierdzono zahamowa-nie stymulacji PLCb przez Gbg po przyłączenie dimeru do GRK, niezależnie czy dimer został przyłączony do miejsca wiązania na końcu C czy N kinazy (EICHMANNi współaut. 2003).
Należy również wspomnieć, że prawdo-podobnie regulatorem procesu łączenia się GRK z Gbg może być fosducyna, tak jak to wy-kazali w komórkach układu węchowego BOEKHOFF i współaut. (1997). W formie zde-fosforylowanej, fosducyna silnie wiąże się z podjednostką Gbg, co uniemożliwia zakotwi-czenie GRK3 do wspólnego miejsca wiązania na tej podjednostce (BOEKHOFF i współaut. 1997, FABCZAK i współaut. 2003).
BIAŁKA EFEKTOROWE DLA Gbg
Od dawna uwaga badaczy skupia się na po-znaniu molekularnych oddziaływań miedzy Gbg i poszczególnymi efektorami, jednak wie-dza na ten temat jest nadal niepełna. Wykaza-no, że w obszernym fragmencieGb, pomiędzy
60 a 150 resztą aminokwasową, zlokalizowane są domeny odpowiedzialne za oddziaływanie z białkami efektorowymi (CHEN i współaut. 1995, 1997, WENGi współaut. 1996; YANi G AU-TAM 1996; FORD i współaut. 1998).
Od-działywania pomiędzy efektorami zostały czę-ściowo wyjaśnione dzięki badaniom wykorzy-stującym mutagenezę odpowiedniego frag-mentu Gb (PANCHENKOi współaut. 1998, BUCK
i współaut. 1999, ALBSOUL-YOUNESi współaut. 2001). Większość z tych badań wykazała obec-ność wielu miejsc w cząsteczce Gbg oraz w cząsteczce białka efektorowego, które są odpo-wiedzialne za ich wzajemne oddziaływania. Obserwacja poczyniona przez SONDKA i współaut. (1996) dowodzi, że Gbg nie zmienia swojej konformacji po odłączeniu się od Ga. Wydaje się więc, że połączenie z Ga i utworze-nie heterotrimeru Gabg ogranicza zdolność Gbg do aktywacji efektorów. Równocześnie su-geruje to, że miejsca wiązania Gado Gbg oraz miejsca wiązania efektorów i Gbg zlokalizowa-ne są w tym samym fragmencie cząsteczki (LIi współaut. 1998). Należy jednak zaznaczyć, że chociaż domeny odpowiedzialne za wiązanie poszczególnych efektorów lub Ga zlokalizo-wane są w tym samym fragmencie Gbg, to jed-nak nie są one identyczne, gdyż tworzą je se-kwencje różnych reszt aminokwasowych. Po-niżej szerzej omówione zostaną interakcje po-między wybranymi efektorami a dimeremGbg, aw Tabeli 2 zestawiono poznane do tej pory białka efektorowe oddziaływujace z Gbg.
CYKLAZA ADENYLANOWA
Udział kompleksu Gbg w regulacji aktywno-ści cyklazy adenylanowej (AC) był niedocenia-ny i przez długi czas uważano, że jedynie pod-jednostka Ga kontroluje syntezę cAMP (TANGi współaut. 1991). Zgodnie z tym założeniem wyłącznie podjednostka Gas odpowiedzialna byłaby za stymulację syntezy tego nukleotydu, podczas gdy Gai/z hamowałaby jego aktyw-ność. Późniejsze badania dowiodły, że również Gbg w zróżnicowany sposób reguluje aktyw-ność odmiennych form cyklazy adenylanowej. Wykazano, że Gbg stymuluje aktywność izo-form AC2, AC4 i AC7, hamuje natomiast aktyw-ność AC1 i AC8, równocześnie ograniczając działanie aktywatorów cyklazy adenylanowej, forskoliny, Ca-CaM, Gas (TANG i współaut. 1991, GAO i współaut. 1991). Stymulujące działanie Gbg na izoformy AC2, AC4 i AC7 stwierdzono jedynie w przypadku równocze-snej aktywacji przez Gas. Ma ono charakter sy-nergistyczny, gdyż następuje wówczas wielo-krotne wzmocnienie efektu działania Gas.
Przypuszczalne miejsca wiązania dimeru Gbg na cząsteczce AC (AC2, AC4 i AC7) zlokali-zowano pomiędzy 956 a 982 resztą aminokwa-sową położoną w środkowej części drugiej
ka-Efektor Gbg Referencje
Jonowe kanały potasowe (GIRK) + (1–4)
Jonowe kanały wapniowe ICa(N,P/Q) – (4–7)
Fosfolipaza A2 + (8)
Odpowiedź drożdzy na feromon + (9–11)
PLCb + (13, 14)
Cyklaza adenylanowa ± (15)
GRK + (16–19)
PI3K + (20)
Kaskada MAP kinaz + (21–23)
Kinazy tyrozynowe + (24, 25)
RACK + (26)
Tabela 2. Zestawienie znanych efektorów dla Gbg.
(1) LOGOTHETISi współaut. 1987; (2) CLAPHAMi NEER1988; (3) MIRSHAHIi współaut. 2002; (4) DASCAL2001; (5) IKEDA1996; (6) HERLITZEi współaut. 1996; (7) LUi współaut. 2001; (8) JELSEMAi współaut. 1987; (9) WHITEWAYi współaut. 1989; (10) CLARK1993; (11) HASSONi współaut. 1994; (12) STERNWEIS1994; (14) CAMPSi współaut. 1992a,b; (15) TANGi GILMAN1991; (16) HAGAi współaut. 1994; (17) BÜNEMANNi HOSEY1999; (18, 19) LODOWSKIi współaut. 2003a, b; (20) KERCHNERi współaut. 2004; (21) STEPHENSi współaut. 1994; (22) INGLESEi współaut. 1995; (23) MATTINGLYi MACARA1996; (24) PUMIGLIAi współaut. 1995; (25) TSUKADAi współaut. 1994; (25) LANGHANS-RAJASEKARAN
talitycznej domeny AC (CHEN i współaut. 1995). Nie znaleziono takiej sekwencji amino-kwasowej (956-982) w izoformach, które nie są regulowane przez Gbg. Ponadto sekwencja ta zawiera motyw QXXER, który występuje w innych efektorach Gbg i jest miejscem wiązania dimeru do białka efektorowego. Badania z wy-korzystaniem syntetycznych polipeptydów po-zwoliły ustalić, że region pomiedzy 75-165 resztą aminokwasową Gbg jest najprawdopo-dobniej włączony w interakcję z AC (CHEN i współaut. 1997). Wiele reszt aminokwaso-wych z tego rejonu (Lys-78, Trp-99 i Asn-119) również jest zaangażowanych w kontakt Gbg z Ga (LAMBRIGHTi współaut. 1996). Stanowi to poparcie założenia, że aktywacja efektora przez Gbg jest uniemożliwiona, gdy białko G występuje w postaci heterotrimeru. Zastoso-wanie do badań syntetycznych peptydów, któ-rych sekwencja odpowiadała sekwencji regio-nu pomiędzy 86-105 oraz 115-135 resztą ami-nokwasową podjednostki Gb pokazało, że pep-tyd Gb (86-105) powodował zahamowanie sty-mulacji AC2 i zmniejszenie efektu blokującego na AC1 przez Gbg. Podobne działanie zaobser-wowano po zastosowaniu drugiego peptydu Gb (115-135), jednakże jego efekt był mniejszy. Mutacja polegająca na wymianie Tyr-124 na Val w peptydzie Gb (115-135) obniżała efekt jego działania. Natomiast konsekwencją zamiany Met-101 na Asn w peptydzie Gb (86-105) było usunięcie wcześniej opisanego efektu działania peptydu. Należy zaznaczyć, że użycie peptydów Gb nie powodowało całkowitego zniesienia efektu Gbg na stymulację lub hamo-wanie, w zależności od zastosowanej izoformy AC. Może to wskazywać na obecność dodatko-wego miejsca kontaktu pomiędzy Gbg a AC, bądź, tak jak ma to miejsce w przypadku inne-go efektora, kanału potasowego (GIRK), włączenie w regulację aktywności AC również drugiej podjednostki tworzącej dimer, Gg (CHEN i współaut. 1997).
FOSFOLIPAZA Cb
Przynajmniej 30 receptorów związanych z białkami G stymuluje fosfodiesterazę fosfaty-dyloinozytolo(4,5)bisfosforanu (PLCb), a ogni-wem pośrednim są białka G, zarówno Ga, jak i Gbg. Stwierdzono, że oczyszczone białko Gbg może aktywować różne formy fosfolipazy, PLCb 1 , PLCb 2 oraz PLCb 3 (SMRCKAi STERN-WEIS1993, PATERSONi współaut. 1995).
Analo-gicznie jak w przypadku cyklazy adenylanowej (CHEN i współaut. 1997), BUCKze współauto-rami (1999), stosując syntetyczne polipeptydy, przeanalizowali udział dwóch fragmentów Gb w aktywacji PLCb 2. Wykazali oni, że Gb po-siada dwie, lecz pełniące odmienne funkcje, domeny zaangażowane w aktywacji PLCb. Pep-tyd Gb (86-105) bierze udział bezpośrednio w przekazywaniu sygnału do PLCb 2. Fragment ten może regulować aktywność PLCb zarówno sam, jak i w obecności Gbg. Ponieważ drugi fragment Gb (115-135) nie jest w stanie regulo-wać aktywności PLCb, natomiast hamuje sty-mulację enzymu przez Gbg, wydaje się więc, że jest on odpowiedzialny wyłącznie za wiązanie Gbg z PLCb i nie bierze udziału w przekazywa-niu sygnału. Stosując różnie zaprojektowane peptydy ustalono, które reszty aminokwasowe odgrywają ważną rolę w stymulacji PLCb. W pierwszej kolejności stwierdzono, że wymiana dwóch reszt aminokwasowowych obarczo-nych ładunkiem, Lys 89 i Arg 96, powoduje utratę przez peptyd zdolności aktywacji PLCb (BUCKi wspołaut. 1999). Konstruując kolejne peptydy dowiedziono, że w podjednostce b występuje dodatkowy region, zlokalizowany miedzy 42 a 54 resztą aminokwasową, który odpowiedzialny jest za stymulację enzymu. Mo-del zaproponowany przez BUCKAi współauto-rów (2002) zakłada, że kontakt między obu białkami, jaki ma miejsce w rejonach przekazy-wania sygnału i wspomagany przez od-działywanie między domenami odpowiedzial-nymi za połączenie obu białek, indukcje PLCb do osiągnięcia takiego „stanu gotowości”, aby sygnały z wielu regionów sygnalizacyjnych mogły być efektywnie przekazane na efektor. Autorzy podkreślają, że to oddziaływanie ma charakter dynamiczny i nie polega na wytwo-rzeniu statycznego połączenia miedzy białkami (BUCK i współaut. 2002).
KANAŁY JONOWE
Białka G mogą regulować bezpośrednio ak-tywność dwóch grup kanałów jonowych. Pierwszą grupę stanowi rodzina napięciowo czułych kanałów wapniowych, które są hamo-wane przezGbg, a drugą — rodzina kanałów po-tasowychtypuGIRKs (ang. G protegated in-wardly rectifying K+), które są aktywowane przez Gbg (CLAPHAM1994, HUANGi współaut. 1995, SCHNEIDER i współaut. 1997).
Kanały GIRKs odgrywają ważną rolę w kon-trolowaniu pobudliwości błony komórkowej i przekazu synaptycznego (LÜSCHERi współaut. 1997). W skład rodziny kanałów GIRKs u ssaków wchodzą 4 rodzaje kanałów, GIRK1-GIRK4, które zostały zlokalizowane w sercu (WICKMANi współaut. 1998), mózgu (LÜSCHER
i współaut. 1997, GUATTEO i współaut. 2000) oraz komórkach endokrynnych (YAMADA i współaut. 1998). Badania stechiometryczne wykazują, że funkcjonalny kanał GIRK zbu-dowany jest z 4 homomerycznych lub 2 par he-teromerycznych podjednostek (Ryc. 2). W każ-dej podjednostce transbłonowy rdzeń zbu-dowany jest z dwóch rozciągniętych przez całą szerokość błony a-helis (M1 i M2)
oddzielo-nych pętlą (ang. P-loop). M2 tworzy wew-nętrzną helisę, która stanowi krawędź poru, podczas gdy M1 skierowana jest w stronę dwu-warstwy lipidowej. W pętli, która formuje se-lektywny filtr w najwęższym miejscu poru, usytuowana jest helisa i motyw GYG, ok-reślający selektywność poru dla jonów potasu. Struktura poru kanału oparta jest na strukturze potasowego kanału bakteryjnego i jest ona prawdopodobnie wspólna dla wszystkich
kanałów potasowych (DOYLEi współaut. 1998, DASCAL 2001). Każda z helis zakończona jest domenami cytozolowymi. In vivo, po akty-wacji receptora sprzężonego z białkami G, uwolniona Gbg wiąże się bezpośrednio do N- i C-końcowej domeny cytoplazmatycznego re-gionu kanału GIRK (INANOBEi współaut. 1995, YAMADA i współaut. 1998) powodując kilka-krotne zwiększenie prawdopodobieństwa otwarcia kanału (IVANOVA-NIKOLOVA i B RE-TWEISER1997, YAKUBOVICHi współaut. 2000). Jednak zmiany strukturalne, następstwem których jest otwarcie kanału po połączeniu z Gbg, nadal nie są poznane. Jeden z modeli zakłada, że C-koniec działa jako blokada, która oddziaływuje przejściowo z porem kanału
(PESSIA i współaut. 1995). Ponieważ na C-końcu zlokalizowane są domeny odpowie-dzialne za wiązanie Gbg, PIP2, i Na+, jak również sekwencje, które tworzą motyw odpowie-dzialny za przemieszczanie się cząsteczki w obrębie błony, wydaje się zatem zrozumiałe, że ten region może regulować aktywność kanału.
Prace mające na celu poznanie miejsc wiązania pomiędzy dimerem Gbg i cząsteczką kanału skupiły się początkowo na udziale w Ryc. 2. Struktura kanału GIRK (wg DASEALA 2001).
tym procesie oddziaływań wyłącznie podjed-nostki Gb (MIRSHAHIi współaut. 2002). Jak wy-kazano, podjednostka Gb1 jest zdolna sama przyłączyć się do cząsteczki kanału, ale nie wpływa to na zmianę wielkości prądu przewo-dzonego przez kanał, jaką obserwuje się po przyłączeniu dimeru Gb1g2. Dlatego badacze zainteresowali się potencjalną rolą Gg2 w regu-lacji funkcji kanałów GIRKs. Część C-końcowa podjednostki Gg2 wydaje się pełnić istotną rolę w aktywacji kanału. Region między 35 a
71 resztą aminokwasową Gg jest wymagany do pełnej stymulacji kanału GIRK4 przez Gb1g2. Dziesięć reszt aminokwasowych z tego regio-nu tworzy swoistą sieć oddziaływań z Gb ogra-niczając krytyczny region Gbg, który określa stymulujący wpływ dimeru na aktywność GIRK4. Wykazano, że podwójna mutacja Gg (36 Asp na Thr oraz 48 Asp na Asn) eliminuje zdolność stymulacji kanału, nie wpływając jed-nocześnie na wiązanie z Gb. Te dwie reszty ami-nokwasowe odpowiedzialne za wiązanie Gg z Gb utrzymują precyzyjną konformację Gbg wy-maganą do pełnej stymulacji GIRK4 (PENG i współaut. 2003). Wyniki te sugerują, że Gg nie tylko jest wymagana do aktywacji GIRK przez
Gbg (KAWANOi współaut. 1999), ale także mo-duluje ona funkcję efektora (kanału GIRK) po-przez precyzyjną regulację efektywności dime-ru Gbg.
Kanały wapniowe typu L, N oraz P/Q są kanałami bramkowanymi napięciem i prze-wodzącymi selektywnie jony wapnia. NaRyc. 3 przedstawiono schemat budowy kanału wap-niowego zależnego od napięcia. Por takiego kanału tworzy podjednostkaa1i dwie pomoc-nicze podjednostki a2d i b. Podjednostka a1
składa się z 4 homologicznych transbłono-wych domen (I–IV) i 5 wewnątrzkomórko-wych segmentów, N-końca, C-końca oraz trzech łączników, L1–L3, występujących pomiędzy transbłonowymi domenami (D AS-CAL2001). Aktywność tych kanałów może być hamowana po aktywacji receptora sprzężone-go z białkami G dwoma drogami, z wykorzysta-niem mechanizmu zależnego i niezależnego od napięcia. Hamowanie poprzez napięciowo-niezależny mechanizm przebiega z wykorzy-staniem wielu szlaków sygnalizacyjnych i pośredniczą w tym procesie wtórne przeka-źniki (HILLE1994). W zależności od neuroprze-kaźnika, rodzaju komórki i miejsca w neuronie Ryc. 3. Struktura napięciowo zależnego kanału przewodzącego jony wapnia (wg DASCALA 2001).
whamowaniu aktywności kanałów pośredni-czą Gai, Gaq, Gbg (KAMMERMEIER i współaut.
2000a, b). Istnieją wprawdzie przesłanki wska-zujące na to, że niektóre typy hamowania nie-zależnego od napięcia są wynikiem bezpośred-niego oddziaływania Ga lub Gbg z kanałami wapniowymi typu N lub P/Q, jednak nie zo-stało to w pełni udowodnione (DASCAL2001). Wykazano natomiast, że dimerGbg bezpośred-nio uczestniczy w hamowaniu aktywności kanałów zależnych od napięcia. Regulacja tego typu występuje w kanałach wapniowych typu N lub P/Q i nie dotyczy kanałów typu L. Wydaje się, że to Gb jest główną podjednostką regu-lującą aktywność tych kanałów. Zidentyfiko-wano wiele miejsc oddziaływania pomiędzy kompleksem Gbg a cząsteczką kanału. Zlokali-zowane są one w rejonie łącznika pomiędzy segmentem I a IIa1 podjednostki kanału (PAGE
i współaut. 1997, ZAPOMNI i współaut. 1997, DOERINGi współaut. 2004) i na C-końcu (QINi współaut. 1997). Hamowanie napięciowo-za-leżne jest szybkie, a zaaplikowanie impulsu wywołującego depolaryzację błony komór-kowej przed aktywacją kanału, uniemożliwia przyłączenie Gbg do cząsteczki kanału (DASCAL
2001, MIRSHAHIi współaut. 2002). Przebadano 5 typów podjednostek Gb i stwierdzono, że
różne kombinacje dimeru hamują aktywność napięciowo zależnych kanałów wapniowych typu N (GARCIAi współaut. 1998, RUIZ-V ELAS-COi IKEDA2000). Postanowiono więc spraw-dzić, które reszty aminokwasowe odgrywają kluczową rolę w tym procesie. Poddano mutac-ji Asn110,Tyr111 i Val 112, które są silnie kon-serwowane we wszystkich typach podjedno-stki Gb. Zamiana tych reszt aminokwasowych spowodowała zanik hamującego działanie Gb na kanał typu N. Region 110-112 Gb, zlokalizo-wany jest poza domenami interakcji z Ga (WALLi współaut. 1995, DOERING i współaut. 2004) i nie był on wcześniej identyfikowany jako ważna funkcjonalnie domena Gb. Po-dobny efekt, tzn. utratę własności hamujących, stwierdzono po zamianie reszt aminokwaso-wychw dwóch sąsiadujących ze sobą rejonach pomiędzy 140-168 i 186-204 resztami amino-kwasowymi. Rejony te są odmienne od tych, które wcześniej opisano jako domeny odpo-wiedzialne za oddziaływanie z innymi efekto-rami. Dodatkowo, na Gb zidentyfikowano miej-sce, które służy jako molekularny czujnik stanu fosforylacji przez kinazę C zależnych od napięcia kanałów wapniowych typu N (D OERI-NG i współaut. 2004).
PODSUMOWANIE
Dimer Gbg wchodzący w skład heterotri-merycznego białka G, początkowo uważany za nieaktywną komponentę służącą jedynie zako-twiczaniu białka G do błony komórkowej, w swojej prawie 20. letniej historii okazał się nie-zwykle ważną cząsteczką sygnałową. W istnie-niu wielu izomerów poszczególnych podjed-nostek tworzących ten dimer należy upatry-wać jego różnorodności, zarówno
struktural-nej, jak i funkcjonalnej. Dzięki temu może on kontrolować i regulować funkcję tak wiele od-miennych efektorów (np. kanały jonowe, fos-folipaza Cb, cyklaza adenylanowa, kinazy re-ceptorów związanych białkami G oraz innych, których listę przedstawiono w Tabeli 2), a w następstwie szlaki sygnalizacyjne i w konse-kwencji odpowiedź komórki na sygnał.
DIMER bg OF G PROTEIN — SIGNALING MOLECULE S u m m a r y
The extracellular signals received by receptors with seven membrane-spanning regions that activate the G proteins, are routed to several distinct intracellular pathways. The G proteins consist of two functional units, Ga subunit, that binds guanine nu-cleotides and Gbg dimer that functions as a single unit. The regulation of signal transduction by the Gbg
com-plex at different protein interfaces: subunit — subunit, receptor — G protein, and Gbg — effector, are re-viewed. Gbg dimer regulates over twelve cellular effectors including phospholipase-b, adenyl cyclases, ion channels and G-protein coupled receptor kinases, which control a broad range of cellular processes.
LITERATURA
AKGOZM., KALYANARAMANV., GAUTAMN., 2004.
Recep-tor mediated reversible translocation of the G pro-tein betagamma complex from the plasma mem-brane to the Golgi complex. J. Biol. Chem. (w
dru-ku).
ALBSOUL-YOUNESA. M., STERNWEISP. M., ZHAOP., NAKATA H., NAKAJIMAS., NAKAJIMAY., KOZASAT., 2001.
Inter-action sites of the G protein beta subunit with bra-in G protebra-in-coupled bra-inward rectifier K+channel.
J. Biol. Chem. 276, 12712–12717.
ARAI H., TSOUC. L., CHAROI. F., 1997. Chemotaxis in a
lymphocyte cell line transfected with C-C chemoki-ne receptor 2B: evidence that directed migration is mediated by betagamma dimers released by ac-tivation of Galphai-coupled receptors. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 94, 14495–14499.
ASANOT., MORISHITAR., OHASHIK., NAGAHAMAM., M IY-AKE T., KATO K. 1995. Localization of various
forms of the gamma subunit of G protein in neu-ral and nonneuneu-ral tissues. J. Neurochem. 64,
1267–1273.
BLUMERK. J, THORNERJ. 1990. Beta and gamma
subu-nits of a yeast guanine nucleotide-binding protein are not essential for membrane association of the alpha subunit but are required for receptor co-upling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4363–4367.
BIRNBAUMER L., 1990. G proteins in signal
transduc-tion. Ann. Rev. Pharmacol Toxicol. 30, 675–705.
BOEKHOFFI., TOUHARAK., DANNERS., INGLESEJ., LOHSEM. J., BREERH., LEFKOWITZR. J., 1997. Phosducin,
po-tential role in modulation of olfactory signaling.
J. Biol. Chem. 272, 4606–4612.
BUCKE., LIJ., CHENY., WENGG., SCARLATAS., IYENGARR., 1999. Resolution of a signal transfer region from
a general binding domain in Gbeta for stimula-tion of phospholipase C-beta2. Science 283,
1332–1335.
BUCKE., SCARLATAS., IYENGARR., 2002. Role of dynamic
interactions in effective signal transfer for Gbeta stimulation of phospholipase C-beta2. J. Biol.
Chem. 277, 49707–49715.
BÜNEMANNM., HOSEYM. M., 1999. G-protein coupled
re-ceptor kinases as modulators of G-protein signal-ling. J. Physiol. 517, 5–23.
CALI J. J., BALCUEVAE. A., RYBALKIN I., ROBISHAWJ. D., 1992. Selective tissue distribution of G protein
gamma subunits, including a new form of the gamma subunits identified by cDNA cloning. J.
Biol. Chem. 267, 24023–24027.
CAMPSM., CAROZZIA., SCHNABELP., SCHEERA., PARKERP. J., GIERSCHIKP., 1992a. Isozyme-selective
stimula-tion of phospholipase C-beta 2 by G protein beta gamma-subunits. Nature 360, 684–686.
CAMPSM., HOUC., SIDIROPOULOSD., STOCKJ. B., JAKOBSK. H., GIERSCHIKP., 1992b. Stimulation of
phospholi-pase C by guanine-nucleotide-binding protein beta gamma subunits. Eur. J. Biochem. 206,
821–831.
CHENJ., DEVIVOM., DINGUSJ., HARRYA., LIJ., SUIJ., CARTY D. J., BLANKJ. L., EXTONJ. H., STOFFELR. H., INGLESEJ., LEFKOWITZR. J., LOGOTHETISD. E., HILDEBRANDTJ. D., IYENGARR., 1995. A region of adenylyl cyclase 2
critical for regulation by G protein beta gamma subunits. Science 268, 1166–1169.
CHENY., WENGG., LIJ., HARRYA., PIERONIJ., DINGUSJ., HILDEBRANDTJ. D., GUARNIERIF., WEINSTEINH., I YEN-GARR., 1997. A surface on the G proteinb-subunit
inolved in interactions with adenylyl cyclases.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 2711–2714. CHENS., DELLE. J., LINF., SAIJ., HAMMH. E., 2004. RACK1
regulates specific functions of Gbg. J. Biol. Chem.
279, 17861–17863.
CHERFILSJ., CHABREM., 2003. Activation of G-protein
Galpha subunits by receptors through Gal-pha-Gbeta and Galpha-Ggamma interactions.
Trends Biochem. Sci. 28, 13–17.
CLAPHAMD. E., 1994. Direct G protein activation of ion
channels? Annu. Rev. Neurosci. 17, 441–464.
CLAPHAM D., NEER E. J., 1988. Activation of atrial
muscarinic-gated K+channels by beta gamma-su-bunits of G proteins. Am. J. Physiol. 254,
H192–197.
CLAPHAMD. E., NEERE. J., 1997. G proteinbg subunits. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37, 167–203. CLARKK. L., DIGNARDD., THOMASD. Y., WHITEWAYM.,
1993. Interactions among the subunits of the G
protein involved in Saccharomyces cerevisiae ma-ting. Mol. Cell Biol. 13, 1–8.
COLEG. .M., REEDS. I., 1991. Pheromone-induced
pho-sphorylation of a G protein beta subunit in S. ce-revisiae is associated with an adaptive response to mating pheromone. Cell 64, 703–716.
CUELLOF., SCHULZER. A., HEEMEYERF., MEYERH. E., LUTZ S., JAKOBSK. H., NIROOMANDF., WIELANDT., 2003.
Activation of heterotrimeric G proteins by a high energy phosphate transfer via nucleoside dipho-sphate kinase (NDPK) B and Gbeta subunits. Complex formation of NDPK B with Gbeta gam-ma dimers and phosphorylation of His-266 in Gbeta. J. Biol. Chem. 278, 7220–7226.
DAAKAY., PITCHERJ. A., RICHARDSONM., STOFFELR. H., ROBISHAWJ. D., LEFKOWITZR. J., 1997. Receptor and
G betagamma isoform-specific interactions with G protein-coupled receptor kinases. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 94, 2180–2185.
DASCALN., 2001. Ion-channel regulation by G proteins. Trends Endocrinol. Metab. 12, 391–398.
DIETRICHA., MEISTERM., BRAZILD., CAMPSM., GIERSCHIK P., 1994. Stimulation of phospholipase C-beta 2 by
recombinant guanine-nucleotide-binding prote-in beta gamma dimers produced prote-in a baculovi-rus/insect cell expression system. Requirement of gamma-subunit isoprenylation for stimulation of phospholipase C. Eur. J. Biochem. 219, 171–178.
DOERINGC.J., KISILEVSKYA. E., FENGZ. P., ARNOTM. I., PELOQUINJ., HAMIDJ., BARRW., NIRDOSHA., SIMMSB., WINKFEINR. J., ZAMPONIG. W., 2004. A single Gbeta
subunit locus controls cross-talk between protein kinase C and G protein regulation of N-type cal-cium channels. J. Biol. Chem. 279, 29709–29717.
DOYLED. A., MORAISCABRALJ., PFUETZNERR. A., KUOA., GULBISJ. M., COHENS. L., CHAITB. T., MACKINNONR., 1998. The structure of the potassium channel:
mo-lecular basis of K+ conduction and selectivity.
Science 280, 69–77.
EICHMANNT., LORENZK., HOFFMANNM., BROCKMANNJ., KRASELC., LOHSEM. J., QUITTERERU., 2003. The
ami-no-terminal domain of G-protein-coupled recep-tor kinase 2 is a regularecep-tory Gbeta gamma binding site. J. Biol. Chem. 278, 8052–8057.
EVANKO D. S., THIYAGARAJAN M. M., SIDEROVSKI D. P., WEDEGAERTNERP. B., 2001. Gbeta gamma isoforms
selectively rescue plasma membrane localization and palmitoylation of mutant Galphas and Gal-phaq. J. Biol. Chem. 276, 23945–23953.
FABCZAKH., SOBIERAJSKAK., FABCZAKS., 2003. Fosducy-na i jej izoformy- regulatory aktywności białek G. Postępy Biologii Komórki 30, 745–761.
FIGLERR. A., GRABERS. G., LINDORFERM. A., YASUDAH., LINDENJ., GARRISONJ. C., 1996. Reconstitution of
re-combinant bovine A1 adenosine receptors in Sf9 cell membranes with recombinant G proteins of defined composition. Mol Pharmacol. 50, 1587–1595.
FORD C. E., SKIBAN. P., BAEH., DAAKA Y., REUVENYE., SHEKTERL. R., ROSALR., WENGG., YANGC. S., IYENGAR R., MILLERR. J., JANL. Y., LEFKOWITZR. J., HAMMH.E., 1998. Molecular basis for interactions of G
prote-in betagamma subunits with effectors. Science
280, 1271–1274.
FUKADAY., TAKAOT., OHGUROH., YOSHIZAWAT., AKINO T., SHIMONISHIY., 1990. Farnesylated
gamma-su-bunit of photoreceptor G protein indispensable for GTP-binding. Nature 346, 658–660.
GARCIA D. E., LI B., GARCIA-FERREIRO R. E., H ERNAN-DEZ-OCHOAE. O., YANK., GAUTAMN., CATTERALLW. A., MACKIEK., HILLEB., 1998. G-protein
beta-subu-nit specificity in the fast membrane-delimited in-hibition of Ca2+ channels. J. Neurosci. 18,
9163–9170.
GARRITSENA., SIMONDSW. F., 1994. Multiple domains of
G protein beta confer subunit specificity in beta gamma interaction. J Biol Chem. 269, 24418–24423.
GAO B,. N., GILMAN A. G., 1991. Clonning and
expression of a widely distributed (type IV) adeny-lyl cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,
10178–10182.
GAUDETR., BOHMA., SIGLERP. B., 1996. Crystal structure
at 2,4Ĺ resolution of the complex of transducinbg and its regulators, phosducin subunits of G-protei-ns. Cell 87, 577–588.
GAUDETR., SAVAGEJ. R., MCLAUGCHLINN., WILLARDSONB. M., SIGLERP. B., 1999. A molecular mechanism for
the phosphorylation-dependent regulation of he-teromeric G proteins by phosducin. Mol. Cell 3,
649–660.
GAUTAM N., BAETSCHERM., AEBERSOLD R, SIMON M. I., 1989. A G protein gamma subunit shares
homol-ogy with ras proteins. Science 44, 971–974.
GAUTAMN., 2003. A conformational switch regulates
receptor-G protein interaction. Structure (Camb)
11, 359–360.
GAUTAMN, DOWNESG. B, YANK, KISSELEVO., 1998. The
G-protein betagamma complex. Cell. Signal., 10,
447–455.
GILMANA. G., 1984.G proteins and dual control of ade-nylate cyclase.Cell 36, 577–579.
GILMANA. G., 1987. G proteins: transducers of
recep-tor-generated signals. Ann. Rev. Biochem. 56,
615–649.
GUATTEOE., FUSCOF. R., GIACOMINIP., BERNARDIG., M ER-CURIN. B., 2000. The weaver mutation reverses the
function of dopamine and GABA in mouse dopa-minergic neurons. J. Neurosci. 20, 6013–6020.
HAGA T., HAGAK., KAMEYAMAK., 1994. G
protein—co-upled receptor kinases. J. Neurochem. 63, 400–412.
HANCOCKJ. F., PATERSONH., MARSHALLC. J., 1990. A
poly-basic domain or palmitoylation is required in ad-dition to the CAAX motif to localize p21ras to the plasma membrane. Cell 63, 133–139.
HASSON M. S., BLINDER D., THORNER J., JENNESS D. D., 1994. Mutational activation of the STE5 gene
pro-duct bypasses the requirement for G protein beta and gamma subunits in the yeast pheromone re-sponse pathway. Mol. Cell Biol. 14, 1054–1065.
HAWESB. E., TOUHARAK., KUROSEH., LEFKOWITZR. J., In-glese J., 1994. Determination of the Gbg-binding
domain of phosducin, A regulatable modular of Gb g signaling. J. Biol. Chem. 269, 29825–29830.
HEITHIERH, FROHLICHM, DEESC., BAUMANNM, HARINg M., GIERSCHIKP., SCHILTZE., VAZW. L., HEKMANM., HELMREICHE. J., 1992. Subunit interactions of
GTP-binding proteins. Eur. J. Biochem. 204, 1169–1181.
HERLITZES., GARCIAD. E., MACKIE K., HILLEB., SCHEUER T., CATTERALL W. A., 1996. Modulation of Ca2+
channels by G-protein beta gamma subunits.
Na-ture 380, 258–262.
HERRMANNR., HECKM., HENKLEINP., HENKLEINP., KLEUSS C., HOFMANNK. P, ERNSTO. P., 2004. Sequence of
in-teractions in receptor-G protein coupling. J. Biol.
Chem. 279, 24283–24290.
HIGASHIJIMAT., FERGUSONK. M, STERNWEISP. C, SMIGELM. D, GILMANA. G., 1987. Effects of Mg2+and the beta gamma-subunit complex on the interactions of guanine nucleotides with G proteins. J. Biol.
Chem. 262, 762–766.
HIGGINSJ. B., CASEYP. J., 1994. In vitro processing of
re-combinant G protein gamma subunits. Require-ments for assembly of an active beta gamma com-plex. J. Biol. Chem. 269, 9067–9073.
HILLEB., 1994. Modulation of ion-channel function by
G-protein-coupled receptors. Trends Neurosci. 17,
531–536.
HIRSCHMANJ. E., JENNESSD. D., 1999. Dual lipid
modifi-cation of the yeast gamma subunit Ste18p deter-mines membrane localization of G betagamma.
Mol. Cell Biol. 19, 7705–7711.
HOHENEGGERM., MITTERAUERT., VOSST., NANOFFC., F RE-ISSMUTH M., 1996. Thiophosphorylation of the G
protein beta subunit in human platelet membra-nes: evidence against a direct phosphate transfer reaction to G alpha subunits. Mol. Pharmacol. 49,
73–80.
HOLLINGERS., HEPLERJ. R., 2002. Cellular regulation of RGS proteins: modulators and integrators of G protein signaling. Pharmacol. Rev. 54, 527–559.
HUANGC. L., SLESINGERP. A., CASEYP. J., JANY. N., JANL. Y., 1995. Evidence that direct binding of G beta
gamma to the GIRK1 G protein-gated inwardly rectifying K+ channel is important for channel activation. Neuron 15, 1133–1143.
IKEDA S. R., 1996. Voltage-dependent modulation of
N-type calcium channels by G-protein beta gam-ma subunits. Nature 380, 255–258.
INANOBE A., MORISHIGE K. I., TAKAHASHI N., ITO H., YAMADAM., TAKUMI T., NISHINA H., TAKAHASHI K., KANAHO Y., KATADAT., KURACHI Y., 1995. G beta
gamma directly binds to the carboxyl terminus of the G protein-gated muscarinic K+ channel, GIRK1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 212,
1022–1028.
INIGUEZ-LLUHIJ. A., SIMONM. I., ROBISHAWJ. D., GILMANA. G., 1992. G protein beta gamma subunits
synthe-sized in Sf9 cells. Functional characterization and the significance of prenylation of gamma. J. Biol.
Chem. 267, 23409–23417.
INGLESEJ., KOCHW. J., TOUHARAK., LEFKOWITZR. J., 1995.
G beta gamma interactions with PH domains and Ras-MAPK signaling pathways.Trends Biochem.
Sci. 20, 151–156.
IVANOVA-NIKOLOVA T. T., BREITWIESER G. E., 1997.
Effector contributions to G beta gamma-mediated signaling as revealed by muscarinic potassium channel gating. J. Gen. Physiol. 109, 245–253.
JELSEMAC. L., AXELRODJ., 1987. Stimulation of
phospho-lipase A2 activity in bovine rod outer segments by the beta gamma subunits of transducin and its in-hibition by the alpha subunit. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 84, 3623–3627.
KALYANARAMANS, KALYANARAMANV, GAUTAm N., 1995. A brain-specific G protein gamma subunit.
Bio-chem. Biophys. Res. Commun. 216, 126–132.
KAMMERMEIERP. J., XIAOB., TUJ. C., WORLEYP. F., IKEDAS. R., 2000a. Homer proteins regulate coupling of
group I metabotropic glutamate receptors to N-ty-pe calcium and M-tyN-ty-pe potassium channels. J.
Neurosci., 20, 7238–7245.
KAMMERMEIERP. J., RUIZ-VELASCOV., IKEDAS. R., 2000b. A voltage-independent calcium current inhibitory pathway activated by muscarinic agonists in rat sympathetic neurons requires both Galpha q/11 and Gbeta gamma. J. Neurosci. 20, 5623–5629.
KAWANO T., CHEN L., WATANABE S. Y., YAMAUCHI J., KAZIROY., NAKAJIMAY., NAKAJIMAS., ITOHH., 1999.
Importance of the G protein gamma subunit in activating G protein-coupled inward rectifier K+ channels. FEBS Lett. 463, 355–359.
KELLEHERD. J., JOHNSONG. L., 1988. Transducin
inhibi-tion of light-dependent rhodopsin phosphoryla-tion: evidence for beta gamma subunit interac-tion with rhodopsin. Mol. Pharmacol. 34, 452–460.
KERCHNERK. R., CLAY R. L., MCCLEERYG., WATSON N., MCINTIREW. E., MYUNGC. S., GARRISONJ. C., 2004.
Differential sensitivity of phosphatidylinositol 3-kinase p110{gamma} to isoforms of Gprotein {beta}{gamma} dimers. J. Biol. Chem. 279,
44554–44562.
KISSELEVO. G., ERMOLAEVAM. V., GAUTAMN., 1994. A
far-nesylated domain in the G protein gamma
subu-nit is a specific determinant of receptor coupling.
J. Biol. Chem. 269, 21399–21402.
KISSELEVO., ERMOLAEVAM., GAUTAMN., 1995a. Efficient
interaction with a receptor requires a specific type of prenyl group on the G protein gamma subunit.
J. Biol. Chem. 270, 25356–25358.
KISSELEV O., PRONIN A., ERMOLAEVA M., GAUTAM N., 1995b. Receptor-G protein coupling is established
by a potential conformational switch in the beta gamma complex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,
9102–9106.
KISSELEV O. G., MEYER C. K., HECK M., ERNST O. P., HOFMANN K. P., 1999. Signal transfer from
rho-dopsin to the G-protein: evidence for a two-site sequential fit mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 96, 4898–4903.
KOCHW. J., INGLESEJ., STONEW. C., LEFKOWITZR. J., 1993.
The binding site for the beta gamma subunits of heterotrimeric G proteins on the beta-adrenergic receptor kinase. J. Biol. Chem. 268, 8256–8260.
KOWLURUA., SEAVEYS. E., RHODESC. J., METZS. A., 1996.
A novel regulatory mechanism for trimeric GTP-binding proteins in the membrane and secretory granule fractions of human and rodent beta cells.
Biochem. J. 313, 97–107.
LAMBRIGHTD. G., SONDEKJ., BOHMA., SKIBAN. P., HAMM H. E., SIGLERP. B., 1996. The 2.0 A crystal structure
of a heterotrimeric G protein. Nature 379,
311–319.
LANGHANS-RAJASEKARANS. A., WANY., HUANGX.Y., 1995.
Activation of Tsk and Btk tyrosine kinases by G protein beta gamma subunits. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 92, 8601–8605.
LEEC., MURAKAMIT., SIMONDSW. F., 1995. Identification
of a discrete region of the G protein gamma subu-nit conferring selectivity in beta gamma complex formation. J. Biol. Chem. 270, 8779–8784.
LEER. H., LIEBERMANB. S., LOLLEYR. N., 1987. A novel
complex from, bovine visual cells of 33000-dalton phosphoprotein with b- and g-transducin: purif-ication and subunit structure. Biochemistry 26,
3983–3990.
LEER. H., BROWNB. M., LOLLEYR. N., HOY. K., 1990.
Pro-tein kinase A phosphorylates retinal phosducin on serine 73 in situ. J. Biol. Chem. 265,
15860–15866.
LIY, STERNWEISP. M., CHARNECKIS., SMITHT. F., GILMANA. G., NEERE. J., KOZASAT., 1998. Sites for Galpha
bin-ding on the G protein beta subunit overlap with si-tes for regulation of phospholipase Cbeta and ade-nylyl cyclase. J. Biol. Chem. 273, 16265–16272. LODOWSKID. T., BARNHILLJ. F., PITCHERJ. A., CAPELW. D.,
LEFKOWITZ R. J., TESMERJ. J., 2003a. Purification,
crystallization and preliminary X-ray diffraction studies of a complex between G protein-coupled receptor kinase 2 and Gbeta1gamma2. Acta
Cry-stallogr. D. Biol. CryCry-stallogr. 59, 936–939.
LODOWSKID. T., PITCHERJ. A., CAPELW. D., LEFKOWITZR. J., TESMERJ. J., 2003b. Keeping G proteins at bay: a
complex between G protein-coupled receptor ki-nase 2 and Gbetagamma. Science 300, 1256–1262.
LOEWA., HOY. K., BLUNDELLT., BAXB., 1998. Phosducin
induces a structural change in transducin b.
Structure 6, 1007–1019.
LOGOTHETISD., E., KURACHIY., GALERJ., NEERE. J., C LA-PHAMD. E., 1987. The Gbg subunits of GTP-binding
proteins activate the muscarinicK+channel in he-art. Nature 325, 321–326.
LUQ., ATKISSONM. S., JARVISS. E., FENg Z. P., ZAMPONIG. W., DUNLAP K., 2001. Syntaxin 1A supports
vol-tage-dependent inhibition of alpha1B Ca2+ chan-nels by Gbetagamma in chick sensory neurons. J.
Neurosci. 21, 2949–2957.
LÜSCHERC., JANL. Y., STOFFELM., MALENKAR. C., NICOLL R. A.,1997. G protein-coupled inwardly rectifying
K+ channels (GIRKs) mediate postsynaptic but not presynaptic transmitter actions in hippo-campal neurons. Neuron 19, 687–695.
MAEDA T., WURGLER-MURPHY S. M., SAITO H., 1994. A
two-component system that regulates an osmos-ensing MAP kinase cascade in yeast. Nature 369,
242–245.
MATTINGLYR. R, MACARAI. G., 1996.
Phosphorylation-dependent activation of the Ras-GRF/CDC25Mm exchange factor by muscarinic receptors and G-protein beta gamma subunits. Nature 382,
268–272.
MEISTERM., DIETRICHA., GIERSCHIKP., 1995.
Identifica-tion of a three-amino-acid region in G protein gamma 1 as a determinant of selective beta gam-ma heterodimerization. Eur. J. Biochem. 34,
171–177.
MIRSHAHIT., MITTALV., ZHANGH., LINDERM. E., L OGOTHE-TIS D. E., 2002. Distinct sites on G protein beta
gamma subunits regulate different effector func-tions. J. Biol. Chem. 277, 36345–36350.
MORISHITAR., UEDAH., KATOK., ASANOT., 1998.
Identifi-cation of two forms of the gamma subunit of G protein, gamma10 and gamma11, in bovine lung and their tissue distribution in the rat. FEBS Lett.
428, 85–88.
MÜLLERS., STRAUBA., BAUERP. H., LOHSEM. H., 1996.
In-teractions of phosducin with defined G protein bg-subunits. J. Biol. Chem. 271, 11781–11788.
MURRAYD., MCLAUGHLINS., HONIGB., 2001. The role of
electrostatic interactions in the regulation of the membrane association of G proteinbg heterodi-mers. J. Biol. Chem. 276, 45153–45159.
MYUNGC. S., YASUDAH., LIUW. W., HARDENT. K, G ARRI-SONJ, C., 1999. Role of isoprenoid lipids on the
he-terotrimeric G protein gamma subunit in deter-mining effector activation. J. Biol. Chem. 274,
16595–16603.
NEERE. J., CLAPHAMD. E., 1988. Roles of G protein
subu-nits in transmembrane signalling. Nature 333,
129–134.
NEERE. J, SCHMIDTC. J., NAMBUDRIPADR., SMITH T. F., 1994. WD repeat proteins: an ancient family of
re-gulatory proteins. Nature 371, 297–300.
NEPTUNEE. R., BOURNEH. R., 1997. Receptors induce
chemotaxis by releasing the betagamma subunit of Gi, not by activating Gq or Gs. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 94, 14489–14494.
ONGO. C., YAMANEH. K., PHANK. B., FONGH. K., BOKD., LEER. H., FUNGB. K., 1995. Molecular cloning and
characterization of the G protein gamma subunit of cone photoreceptors. J. Biol. Chem. 270,
8495–8500.
OHGUROH., NAKAGAWAT., KITAMURAK., AKINOT., 1992.
Lack of association of Ca2+-calmodulin with the beta gamma-subunits of the photo-receptor G pro-tein (transducin). Biochem. Int. 26, 51–57.
PAGEK. M., STEPHENSG. J., BERROWN. S., DOLPHINA. C., 1997. The intracellular loop between domains I
and II of the B-type calcium channel confers aspects of G-protein sensitivity to the E-type cal-cium channel. J. Neurosci. 17, 1330–1338.
PANCHENKOM. P., SAXENAK., LIY., CHARNECKIS., S TERN-WEISP. M., SMITHT. F., GILMANA. G., KOZASAT., NEER E. J., 1998. Sites important for PLCbeta2
activa-tion by the G protein betagamma subunit map to the sides of the beta propeller structure. J. Biol.
Chem. 273, 28298–28304.
PATERSONA, BOYERJ. L., WATTSV. J., MORRISA. J., PRICEE. M., HARDEN T. K., 1995. Concentration of
enzy-me-dependent activation of PLC-beta 1 and PLC-beta 2 by G alpha 11 and beta gamma-subu-nits. Cell Signal. 7, 709–720.
PENGL., MIRSHAHIT., ZHANGH., HIRSCHJ. P., LOGOTHETIS D. E., 2003. Critical determinants of the G protein
gamma subunits in the Gbetagamma stimulation of G protein-activated inwardly rectifying potas-sium (GIRK) channel activity. J. Biol. Chem. 278,
50203–50211.
PENGY. W., ROBISHAWJ. D., LEVINEM. A., YAUK. W., 1992. Retinal rods and cones have distinct G
pro-tein beta and gamma subunits. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89, 10882–10886.
PERACINOB., BORLEISJ., JINT., WESTPHALM., SCHWARTZJ. M., WU L., BRACCO E., GERISCH G., DEVREOTES P., BOZZAROS., 1998.G protein beta subunit-null mu-tants are impaired in phagocytosis and chemota-xis due to inappropriate regulation of the actin cy-toskeleton. J. Cell Biol. 141, 1529–1537.
PESSIAM., BONDC. T., KAVANAUGHM. P., ADELMANJ. P., 1995. Contributions of the C-terminal domain to
gating properties of inward rectifier potassium channels. Neuron 14, 1039–1045.
PHILLIPS W. J., CERIONE R. A., 1992a. Rho-dopsin/transducin interactions. I. Characteriza-tion of the binding of the transducin-beta gamma subunit complex to rhodopsin using fluorescence spectroscopy. J. Biol. Chem. 267, 17032–17039.
PHILLIPSW. J., WONGS. C., CERIONER. A., 1992b.
Rho-dopsin/transducin interactions. II. Influence of the transducin-beta gamma subunit complex on the coupling of the transducin-alpha subunit to rhodopsin. J. Biol. Chem. 267, 17040–17046.
PITCHERJ. A., INGLESEJ., HIGGINSJ. B., ARRIZAJ. L., CASEY P. J., KIMC., BENOVICJ. L., KWATRAM. M., CARONM. G., LEFKOWITZR. J., 1992. Role of beta gamma
su-bunits of G proteins in targeting the beta-adrener-gic receptor kinase to membrane-bound recep-tors. Science 257, 1264–1267.
PRONIN A. N., GAUTAM N. 1992. Interaction between
G-protein beta and gamma subunit types is selec-tive. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6220–6224.
PUMIGLIAK. M., LEVINEH., HASKET., HABIBT., JOVER., DECKERS. J., 1995. A direct interaction between
