Jacek Mazurkiewicz | Jacek Szulc
Kolonizacja sieci wodnej szpitali pałeczkami
Legionella pneumophila na podstawie analizy
danych z badań mikrobiologicznych Wojskowego
Ośrodka Medycyny Prewencyjnej we Wrocławiu
– część 2: Monitoring i działania zapobiegawcze
Colonization of hospital water systems with Legionella pneumophila on the basis
of data analysis from microbiological tests of Military Preventive Medicine Center
in Wrocław – part 2: Monitoring and preventive actions
Zespół Diagnostyki Laboratoryjnej Wojskowego Ośrodka Medycyny Prewencyjnej we Wrocławiu
} Jacek Mazurkiewicz, Zespół Diagnostyki Laboratoryjnej Wojskowego Ośrodka Medycyny Prewencyjnej, ul. Weigla 5, 50-984 Wrocław, Tel.: (71) 766 00 19, Fax: (71) 766 02 11, e-mail: may@op.pl
Wpłynęło: 30.06.2011 Zaakceptowano: 15.06.2011
Streszczenie: W artykule przedstawiono zakres działań
zapo-biegawczych podejmowanych przez administratorów szpitali, zmierzających do minimalizacji zagrożeń powodowanych przez pałeczki Legionella. Przeprowadzono ocenę ryzyka oraz określo-no warunki techniczne, jakim powinna odpowiadać sieć wodna w obiektach służby zdrowia. Dokonano analizy oraz skuteczności metod dezynfekcji ciepłej wody użytkowej.
Słowa kluczowe: dezynfekcja i uzdatnianie wody | działania
zapo-biegawcze | legioneloza | monitoring | regulacje prawne
Abstract: The article presents the range of preventive actions
un-dertaken by hospital administrators in order to minimize threats caused by Legionella. There was performed the risk estimation and there were determined technical conditions, which should be met by water system in the objects of health service. There was conducted the analysis of efficiency of hot water disinfection me-thods.
Key words: disinfection and water treatment | legal regulations |
legionellosis | monitoring | preventive actions
Wstęp
Bakterie z rodzaju Legionella zasiedlają sieci wodociągowe wody ciepłej oraz zimnej, zaopatrujące budynki użyteczności publicznej, a także systemy przemysłowe (szpitalne
i hotelo-we). Źródłem zakażenia są urządzenia, w których dochodzi do wytwarzania aerozolu o średnicy poniżej 5 μm [1]. Bak-terie namnażają się w zbiornikach akumulacyjnych ciepłej wody, osadach separatorów i odmulaczy, ślepych odcinkach sieci, przewodach instalacyjnych, wylewkach baterii i nasad-kach sitkowych, w których znajdują się złogi kamienia ko-tłowego i osadów wapiennych. Ze względu na inhalacyjny charakter zakażeń, na szczególną uwagę zasługują urządzenia wytwarzające aerozol wodno-powietrzny o średnicy kropel 2–5 μm: nawilżacze powietrza, urządzenia klimatyzacyjne, natryskowe, nawilżające [2]. Właściciele lub operatorzy in-stalacji wodnych ponoszą pełną odpowiedzialność za jakość ciepłej wody pitnej i użytkowej w punktach jej czerpania. Zo-bowiązani są również do okresowego badania wody na obec-ność bakterii z rodzaju Legionella [3]. Nadzór oraz kontrola instalacji wodociągowej, wydawanie decyzji o jakości wody realizowana jest ustawowo przez organy sanitarno-epidemio-logiczne, na obszarze podległym Ministrowi Obrony Narodo-wej przez Wojskowe Ośrodki Medycyny Prewencyjnej.
Ocena rodzaju Legionella i wielkości sieci
Stosując się do wytycznych europejskiej grupy robo-czej ds. zakażeń bakteriami Legionella (EWGLI) zawartych w „Europejskich zaleceniach dot. zapobiegania i zwalczania legionelozy związanej z podróżowaniem” oraz Rozporzą-dzenia Ministra Infrastruktury w sprawie warunków
tech-jest zabronione i stanowi poważne naruszenie przepisów prawa autorskiego oraz grozi sankcjami prawnymi.
!
owanie, w sieci wodnej szpitali należy:
– utrzymywać w instalacjach wody zimnej temperaturę poniżej 20°C, a w instalacjach wody gorącej tempera-turę nie niższą niż 55°C;
– w punktach czerpalnych wody utrzymywać tempera-turę o wartości nie niższej niż 55°C i nie wyższą niż 60°C oraz umożliwić okresową dezynfekcję termiczną w zakresie 70–80°C, stosować urządzenia automatycz-nej stabilizacji temperatury w zakresie 55–60°C; – unikać stagnacji wody, która powoduje wzrost
biofil-mu (w tym bakterii Legionella);
– izolować od siebie instalację wody ciepłej i zimnej; – regularnie przeprowadzać kontrolę temperatury wody
(wpisy do dziennika);
– stosować perlatory i główki natrysków, które nie wy-twarzają mikroaerozolu o średnicy kropel 2,0–5,0 μm; – likwidować wszystkie ślepe odcinki instalacji;
– unikać stosowania w instalacjach wodnych materia-łów mogących sprzyjać wzrostowi mikroorganizmów; – ograniczać możliwość wytwarzania osadów oraz
koro-zji w instalacjach;
– stosować procesy uzdatniania wody [4, 6, 15, 16]. Na podstawie analiz (audytów) ryzyka stopnia zanieczysz-czenia sieci wodnej, uzyskujemy informacje o przedsięwzię-ciach niezbędnych do wdrożenia, celem spełnienia wymogów fizykochemicznych i mikrobiologicznych, ujętych w Rozpo-rządzeniu Ministra Zdrowia, w sprawie jakości wody prze-znaczonej do spożycia przez ludzi.
Szczególną uwagę podczas audytu zwraca się na:
– wydzielenie kompetentnego zespołu analitycznego oceniającego jakość sieci wodnej oraz przygotowanie szkoleń personelu w zakresie kontroli bieżącej; – stworzenie rejestru dokumentującego czynności
zwią-zane z konserwacją i oceną ryzyka;
– określenie metod kontroli i przygotowanie procedur operacyjnych;
– wyznaczenie punktów krytycznych z uwzględnieniem monitorowania temperatury ciepłej wody;
– określenie metod dezynfekcji wody;
– wyznaczenie punktów pobierania próbek wody do badań. Ocenę ryzyka należy przeprowadzić:
– w przypadku niewłaściwej jakości mikrobiologicznej wody;
– podczas robót modernizacyjnych instalacji; – w odstępach co najmniej jeden raz na 2 lata [4–6].
Monitoring i działania zapobiegawcze
Urządzenia i instalacje wodociągowe
Monitorowanie wody w kierunku obecności pałeczek
Legio-nella w obiektach służby zdrowia należy przeprowadzać
w spo-sób cykliczny (1–4 razy w roku), zależnie od stopnia skażenia lub jeden raz w miesiącu w obiektach, w których woda w sieci nie osiąga zalecanych parametrów (zimna poniżej 20°C, ciepła powyżej 55°C), lub w miejscu przebywania osób, u których wystąpiło podejrzenie lub stwierdzono zachorowanie na legio-nelozę [7]. W instalacji ciepłej wody, w której przewidziane są przerwy w działaniu stałego obiegu (wymaga się, aby przerwy nie trwały dłużej niż 8 godzin), dopuszcza się, aby temperatu-ra wody bezpośrednio po przerwie w punktach czerpalnych wynosiła ≤50°C [4, 6]. Problem zapobiegania namnażaniu pałeczek Legionella w systemach wodociągowych jest zależny w głównej mierze od rozwiązań technicznych [2]. Procedury postępowania w zależności od wyniku badania bakteriologicz-nego wody w instalacji wodociągowej obiektów służby zdro-wia, przedstawione zostały w pierwszej części pracy [8].
Zakres temperatur, w których namnażają się pałeczki
Le-gionella oraz w których podejmuje się działania
dezynfek-cyjne przedstawiono na Ryc. 1.
Analizując bezpośredni wpływ rodzaju materiału, z któ-rego wykonana jest instalacja sieci wodnej, nie stwierdzono, aby sprzyjał on w sposób szczególny namnażaniu bakterii. Wzrostowi bakterii oraz korozji sprzyja osad powstający w przewodach instalacyjnych ciepłej wody. Najmniejszą ilość bakterii z rodzaju Legionella stwierdza się w sieci wod-nej wykonawod-nej z miedzi [6, 9].
Woda w systemach chłodniczych
Bakterie Legionella mogą przedostawać się do instalacji wentylacyjnych i klimatyzacji z cząsteczkami gleby, kurzu, opadami atmosferycznymi, wodą używaną w komorach zraszania. Bakterie gromadzą się w miejscach zastoju wody
Ryc. 1. Zakres temperatur, w których namnażają się pałeczki Legionella.
Dezynfekcja termiczna zakres 70–80ºC
W temp. 66ºC Legionella ginie w ciągu 2 minut
W temp. 60ºC Legionella ginie w ciągu 32 minut W temp. 55ºC Legionella ginie w ciągu 5–6 godzin 80ºC
70ºC
50ºC
Optymalna temperatura namnażania dla Legionella sp. 35ºC–46ºC Zakres temperatur, w których namnaża się
Legionella sp. 20ºC–50ºC
20ºC
W sieci wodociągowej zimna woda powinna mieć temperaturę <20ºC
Bakterie Legionella przeżywają w temperaturze <20ºC, ale nie namnażają się 0ºC
film, co przyczynia się do wytwarzania aerozolu wodno-po-wietrznego o średnicy kropel 1–2 μm [4]. Otwarte systemy wody chłodniczej należy kontrolować na obecność pałe-czek Legionella jeden raz w miesiącu, dodatkowo jeden raz w miesiącu przeprowadzić badania ogólnej liczby drobno-ustrojów. Procedury postępowania, w zależności od wyni-ków badań bakteriologicznych próbek wody pochodzących z urządzeń chłodniczych, ujęte są w Tabeli 1 [5].
Wanny z hydromasażem
Głównym czynnikiem sprzyjającym występowaniu pałe-czek Legionella jest woda, która w tego typu urządzeniach przekracza 25°C oraz tworzący się tuż nad powierzchnią wody aerozol wodno-powietrzny. Urządzenia z hydromasa-żem należy po zakończeniu dnia umyć i poddać dezynfekcji, a filtry okresowo wymieniać. Monitoring wody należy prze-prowadzać jeden raz w miesiącu. Bakterie z rodzaju
Legio-nella nie powinny być obecne w 100 ml wody.
Unity stomatologiczne
Zanieczyszczenie pałeczkami Legionella instalacji wod-nej w urządzeniach stomatologicznych pochodzić może z sieci wodociągowej lub z niewłaściwie przechowywanej wody destylowanej, a narażenie powodowane jest powstają-cym podczas chłodzenia turbin dentystycznych aerozolem wodno-powietrznym. Urządzenia stomatologiczne przed rozpoczęciem pracy powinny być płukane przez 3–10 mi-nut. Woda magazynowana w pojemnikach turbin powinna być sterylizowana, a jej temperatura nie powinna przekra-czać 20°C. Pojemniki przed każdorazowym napełnieniem powinny być myte i dezynfekowane, przewody giętkie doprowadzające wodę do strzykawki wodno-powietrznej płukane silnym strumieniem wody przez około 20 minut. Gabinety stomatologiczne, w których leczeni są pacjenci z obniżoną odpornością powinny stosować wodę sterylną. Badania wody należy przeprowadzać co najmniej dwa razy w roku (badania w kierunku pałeczek Legionella oraz
Pseu-domonas aeruginosa).
Nawilżacze powietrza
Woda w nawilżaczach powinna być całkowicie wymie-niana. Przy każdej wymianie wody urządzenia należy czy-ścić z osadu i okresowo poddawać dezynfekcji.
Inhalatory
Do inhalacji stosować należy tylko płyny jałowe. Mycie, czyszczenie oraz dezynfekcję należy przeprowadzać przed każdorazowym użyciem.
Klimatyzacja
W przypadku parowego systemu nawilżania powietrza (temperatura pary wodnej 105–110°C) nie ma niebezpie-czeństwa zanieczyszczenia mikrobiologicznego nawilżo-nego powietrza. W innych systemach klimatyzacji należy dokonywać systematycznej kontroli wody stosowanej do zasilania urządzeń, przeprowadzać cykliczne procesy mycia i dezynfekcji. [5, 7, 10, 11, 17].
Metody dezynfekcji systemu ciepłej wody
Metoda termiczna
Wodę podgrzewa się w podgrzewaczach do temperatu-ry ≥70°C. Wszystkie punkty czerpalne do uzyskania prze-widzianej temperatury muszą być zamknięte. Dezynfekcję termiczną punktów czerpalnych przeprowadza się przez otwarcie i przepłukanie wszystkich kranów i pryszniców w sieci. Czas płukania powinien wynosić 5–30 minut (uza-leżniony jest od temperatury oraz grubości biofilmu). Jeśli temperatura wody wynosi 65°C, czas płukania należy wy-dłużyć do przynajmniej 10 minut, a przy temperaturze 60°C – do 30 minut. Proces należy przeprowadzać cyklicznie, aby ograniczyć rekolonizację drobnoustrojami (w tym bakteria-mi Legionella).
Wadami metody termicznej są: – zagrożenie oparzeniem,
– możliwość uszkodzenia instalacji przez złogi kamienia kotłowego,
Ogólna liczba bakterii w 1 ml w 30ºC/48 h Liczba bakterii Legionella sp. w 100 ml Postępowanie <104 <102
Ocena pozytywna. System jest właściwie eksploato-wany
104–105 102–103
Przegląd programów dzia-łania urządzeń. Badanie należy powtórzyć, jeśli wynik zostanie potwier-dzony, należy dokonać analizy stosowanych środków zapobiegawczych, lub wprowadzić działania dodatkowe
>105 >103
Natychmiast wdrożyć po-stępowanie dezynfekcyjne, następnie podjąć działania oczyszczające urządzenia i ponownie je zdezynfeko-wać. Dokonać analizy stanu technicznego i procedur działania urządzeń
cieplną,
– metoda ta nie likwiduje na stałe obecności biofilmu.
Naświetlanie
Ten typ dezynfekcji wykorzystywany jest w sterylizato-rach przepływowych UV, które montowane są przed prysz-nicami na oddziałach, gdzie przebywają osoby z obniżoną odpornością. Metoda jest skuteczna dla wody bezbarwnej i klarownej. Istotne znaczenie ma montowanie filtrów za-trzymujących osad i żelazo. Metoda ta jednak cechuje się małą skutecznością przy wysokim skażeniu bakteriami oraz przy obecności biofilmu.
Metoda elektrolityczna
Metoda wykorzystuje działanie biobójcze jonów miedzi i srebra. Proponowane stężenia, to 0,2–0,4 mg/l jonów mie-dzi oraz 0,02–0,04 mg/l jonów srebra. Stałe monitorowanie tych stężeń w wodzie jest bezwzględnie konieczne.
Dezynfekcja chlorowaniem
Metoda polega na dodawaniu do wody chloru gazowego, podchlorynu sodu lub podchlorynu wapnia. Czas dezynfek-cji uzależniony jest od stężenia preparatów chloru, obecno-ści związków organicznych oraz odczynu pH wody. Bakterie
Legionella charakteryzują się wysoką odpornością na
działa-nie chloru, nawet 40-krotdziała-nie wyższą niż bakterie E. coli. Pre-paraty podchlorynu nie penetrują biofilmu. Podczas dezyn-fekcji mogą tworzyć się związki halogenowe (kancerogenne) oraz procesy korozji sieci wodnej.
Hyperchlorowanie szokowe
Do dezynfekcji stosuje się związki chloru o wysokim stężeniu – 10 mg/l. Czas działania wynosi 2 godziny, tem-peratura wody ≤30°C. Po zakończeniu dezynfekcji system poddawany jest płukaniu do osiągnięcia stężenia wolnego chloru 0,1–0,3 mg/l, przy odczynie pH wody: 7,6–8,3.
Dezynfekcja dwutlenkiem chloru
Metoda ta cechuje się przedłużonym działaniem i jest skuteczniejsza od chloru w identycznym stężeniu, a tak-że niezależna od odczynu pH wody (wysoka skuteczność w zakresie odczynu pH wody wynoszącego 4–10). Podczas dezynfekcji nie powstają toksyczne chloraminy oraz związ-ki trójchlorowcopochodne, smak i zapach wody nie ulegają zmianie. Dwutlenek chloru penetruje biofilm i warstwy ko-rozji oraz działa na wolne drobnoustroje. Praktyczna dawka dwutlenku chloru nie powinna przekraczać 1,0 mg/l, a jego
stężenie po zakończeniu procesu dezynfekcji powinno wy-nosić 0,2–0,05 mg/l [7, 12–14, 16, 17].
Zakres działań prewencyjnych
wykonanych przez analizowane placówki
służby zdrowia w latach 2008–2010
Wyniki badań próbek mikrobiologicznych ciepłej wody pochodzących z instalacji analizowanych szpitali (patrz wy-niki badań ujęte w pierwszej części artykułu [8]), w których przekroczone były dopuszczalne ilości bakterii Legionella (wartość graniczna <100 jtk/100 ml próbki), zobligowały właścicieli obiektów do podjęcia czynności mających na celu zminimalizowanie kolonizacji sieci pałeczkami
Legio-nella oraz innymi bakteriami wchodzącymi w skład
biofil-mu. Ze względu na pojawiające się trudności w eliminacji drobnoustrojów, działania przebiegały wieloetapowo, z za-stosowaniem dekontaminacji, dezynfekcji termicznej oraz chemicznej.
Powołane zostały zespoły ds. zapobiegania i zwalcza-nia zagrożezwalcza-nia występowazwalcza-nia bakterii z rodzaju Legionella, których głównym zadaniem było podejmowanie komplek-sowych działań zmierzających do utrzymywania wody na poziomie bezpieczeństwa mikrobiologicznego. W
szym etapie próbę eliminacji bakterii realizowano za po-mocą dezynfekcji termicznej, podczas której w punktach czerpalnych wody temperatura wynosiła 75–78°C. Badania kontrolne przeprowadzone po kilku tygodniach wykazały 5-krotne zmniejszenie liczby bakterii Legionella. Dezyn-fekcję termiczną przeprowadzono kilkukrotnie, redukując poziom bakterii Legionella do wartości <100 jtk/100 ml. Równolegle stosowano zabiegi dekontaminacji (odkamie-nianie, czyszczenie wylewek, perlatorów i sitek natrysko-wych). Badania kontrolne przeprowadzane w odstępach kil-kumiesięcznych wykazały w trzech szpitalach wzrost liczby bakterii Legionella do poziomu >100 jtk/100 ml. Ze względu na rozległy układ sieci wodociągowej w dwóch szpitalach wymieniono główne ciągi, zmniejszając ich całkowitą po-wierzchnię przez zamontowanie mniejszych przekrojowo rur typu Pex/ Al/ Pex, charakteryzujących się odpornością na niskie i wysokie temperatury, odpornością na zarastanie kamieniem oraz zdolnością samokompensacji wydłużeń cieplnych.
W drugim etapie podjęto decyzje o zmianie metody uzdat-niania z zastosowaniem podchlorynu sodu oraz zastosowaniu: – w kotłowniach szpitali kompaktowych elektroli-tycznych urządzeń do uzdatniania wody typu KEU-V-TV(L) 02 (Ryc. 2), które doprowadzają wodę do równowagi wapniowo-węglanowej, zapobiegając po-wstawaniu osadów. Poprzez reakcję utleniania obec-nych w wodzie chlorków na wolny chlor oraz dwutle-nek chloru, działają dodatkowo dezynfekująco; – stabilizatorów temperatury ciepłej wody użytkowej
(Ryc. 3), które utrzymują temperaturę w parametrach granicznych ±1°C, w stosunku do temperatury zada-nej. Równomierny rozkład temperatury wody utrzy-mywany jest przez mieszanie wody o różnych i szybko zmieniających się temperaturach.
– zaworów antyskażeniowych (Ryc. 4) na układzie zim-nej wody oraz wymianie pomp cyrkulacyjnych i wy-mienników ciepła.
Wnioski
Działania zapobiegawcze w sieci wodnej budynków szpi-talnych przeprowadzane w analizowanym okresie przyczy-niły się do poprawy parametrów bakteriologicznych ciepłej wody użytkowej, osiągając wartość <100 jtk bakterii
Le-gionella /100 ml. Skuteczność zastosowanych metod
tech-nologicznych oraz dezynfekcyjnych uzależniona była od wielkości systemu, materiałów z jakich wykonane były rury, grubości biofilmu i właściwości fizyko-chemicznych wody.
Redukcja zagrożenia zakażeniem pałeczkami Legionella zależna jest od zapewnienia właściwego funkcjonowania systemu wodnego oraz wprowadzania odpowiednich dzia-łań naprawczych i kontrolnych.
Piśmiennictwo
1. Palusińska-Szycz M, Cendrowska-Pinkosz M. Występowanie i choro-botwórczość bakterii z rodziny Legionellaceae. Post Hig Med Dośw 2008;62(7):337–353.
2. Pancer K, Rabczenko D, Krogulska B et al. Mikrobiologiczna ocena za-grożenia legionelozą oraz zastosowane metody eliminacji Legionella
pneumophila z sieci wodnych budynków szpitalnych. Przegl Epidemiol
2008;62(2):439–446.
3. Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 29 marca 2007 r. w sprawie jako-ści wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi. Dz.U. z 2007 r. Nr 61, poz. 417 z późn. zm.; Dz.U z 2010 r. Nr 72, poz. 466.
4. Buczyńska E, Kozłowski B, Płuciennik M et al. Zalecenia do projektowania instalacji ciepłej wody, wentylacji i klimatyzacji minimalizujące namnaża-nie się bakterii Legionella. Cobrti Instal, Warszawa, 2005, zeszyt 11.
Ryc. 3. Stabilizatory temperatury ciepłej wody użytkowej.
i urządzeniach wytwarzających aerozol wodno-powietrzny w obiektach służby zdrowia. Projekt badawczy MNiL, nr 2 PO5D 026 26.Okres realizacji: 2004–2007. http://www.pzh.gov.pl/page/fileadmin/user_upload/kontro-la_01.pdf
6. European Guidelines for Control and Prevention of Travel associated Le-gionnaires Disease. EWGLI, January 2005. http://www.hpa.org.uk/web/ HPwebFile/HPAweb_C/1274093149925
7. Krogulska B, Matuszewska R. Problemy związane z występowaniem bak-terii z rodzaju Legionella w instalacjach wody ciepłej i urządzeniach
wy-twarzających aerozol wodno-powietrzny w obiektach opieki medycznej. Biuletyn Stowarzyszenia Higieny Lecznictwa 2007;31:1–2.
8. Mazurkiewicz J, Jakubowska O, Szulc J. Kolonizacja sieci wodnej szpitali pałeczkami Legionella pneumophila na podstawie analizy danych z badań mikrobiologicznych Wojskowego Ośrodka Medycyny Prewencyjnej we Wrocławiu – część 1. Forum Zakażeń 2011;2(1):1–6.
9. Leoni E, De Luca G, Legnani PP. Legionella waterline colonization: detec-tion of species in domestic, hotel and hospital hot water systems. J Appl Microbiol 2005;98(2):373–379.
10. Pankhurst CL. Risk assessment of dental unit waterline contamination. Prim Dent Care 2003;10(1):5–10.
12. Wytyczne dla zwalczania bakterii Legionella przy zastosowaniu syste-mów dezynfekcji wody dwutlenkiem chloru ClO2 Generator Oxiprem Pro,
Grundfos Alldos, http://www. grundfos.pl
13. Flannery B, Gelling LB, Vugia DJ et al. Reducing Legionella colonization of
water systems with monochloramine. Emerg Infect Dis 2006;12(4):588– 596.
14. Environmental Protection Agency. National primary drinking water regu-lations. Stage 2 disinfectans and disinfection by products rule, national primary and secondary drinking water regulations: approval of analytical methods for chemical contaminants. Federal Register 2003;68:49547– 49596.
15. Walczak M, Ostrowski J. Jak zapobiegać skażeniu systemu c.w.u. bakterią
Legionella – rozwiązania techniczne. Polski Instalator 2006;12:44.
16. Rozporządzenie Ministra Infrastruktury z dnia 12.04.2002 r. w sprawie warunków technicznych, jakim powinny odpowiadać budynki i ich usy-tuowanie. Dz.U. z 2002 r. Nr 75, poz. 690 z późn. zm.; Dz.U. z 2009 r. Nr 56, poz. 461; Dz.U. z 2010 r. Nr 239, poz. 1597.
17. Veronesi L, Capobianco E, Affanni P, Pizzi S, Vitali P, Tanzi ML. Legionella contamination in the water system of hospital dental settings. Acta Bio-med 2007;78(2):117–122.
