Andrzej Tokarz, Barbara Bobrowska, Grzegorz Grynkiewicz
1),
Magdalena Matysiak
WPŁYW WYBRANYCH POLIFENOLI NA PROCES UTLENIANIA BIAŁEK
W WA˛TROBACH SZCZURO
´
W Z NOWOTWORAMI INDUKOWANYMI DMBA
Katedra i Zakład Bromatologii Akademia Medyczna w Warszawie Kierownik Zakładu: prof. ndzw. dr hab. A. Tokarz
1)Instytut Farmaceutyczny w Warszawie Kierownik: doc. dr. W. Szelejewski
W pracy okres´lono zalez˙nos´c´ mie˛dzy stosowana˛ dieta˛, zro´z˙nicowana˛ pod wzgle˛dem zawartos´ci polifenoli (ich dawki i rozpuszczalnika, w kto´rym zwia˛zki były podawane), a procesem peroksydacji białek. Stosownym biowskaz´nikiem oksydacyjnych uszkodzen´ białek były grupy karbonylowe aminokwaso´w. W badaniach okres´lono stopien´ po-wstawania zwia˛zko´w karbonylowych jako skutek ro´wnoczesnego działania czynnika kancerogennego 9,10-dimetylobenzantracenu (DMBA). W wyniku przeprowadzonych badan´ stwierdzono, z˙e obecnos´c´ zwia˛zko´w polifenolowych w diecie moz˙e decydowac´ o intensywnos´ci przebiegu proceso´w oksydacyjnych w organizmie.
Hasła kluczowe: grupy karbonylowe, polifenole, DMBA.
Key words: Protein carbonyl, polyphenols, DMBA.
W wyniku działania reaktywnych form tlenu z elementami komo´rkowymi moz˙e
dochodzic´ do zmian w strukturze białek, lipido´w, cukro´w czy kwaso´w
nuk-leinowych (1, 2, 3).
Oksydacyjne uszkodzenia białek, polegaja˛ce na modyfikacji reszt
aminokwaso-wych, grup prostetycznych, agregacji lub fragmentacji cza˛steczki, prowadza˛
za-zwyczaj do utraty ich aktywnos´ci biologicznej. Z uwagi na liczne waz˙ne funkcje
pełnione przez białka (min. katalityczne, strukturalne, ochronne, regulatorowe,
transportowe) wszelkie modyfikacje, kto´rym one podlegaja˛, w konsekwencji moga˛
stac´ sie˛ niebezpieczne dla organizmu i byc´ przyczyna˛ wielu groz´nych choro´b,
takich jak choroby neurodegeneracyjne, nowotwory. Z tego wzgle˛du waz˙ne jest
poszukiwanie czynniko´w, kto´re mogłyby zapobiegac´ lub zmniejszac´ stopien´
uszkodzen´ wywołanych przez reaktywne formy tlenu (RFT) (1, 2, 3).
Taka˛ role˛ potencjalnie moga˛ spełniac´ przeciwutleniacze, a ws´ro´d nich zwia˛zki
polifenolowe. Istnieja˛ dowody potwierdzaja˛ce ich zdolnos´c´ do zmiatania wolnych
rodniko´w, tworzenia komplekso´w z jonami metali katalizuja˛cymi powstawanie
wolnych rodniko´w, a takz˙e do hamowania niekto´rych enzymo´w uczestnicza˛cych
w procesach oksydacyjnych. Jednak kierunek działania zwia˛zko´w polifenolowych
jest złoz˙ony i zalez˙y od wielu czynniko´w s´rodowiskowych, od stanu organizmu,
dawki i czasu stosowania tych zwia˛zko´w (4, 5, 6).
Celem podje˛tych badan´ było okres´lenie zalez˙nos´ci mie˛dzy stosowana˛ dieta˛,
zro´z˙nicowana˛ pod wzgle˛dem zawartos´ci polifenoli (ich dawki i rozpuszczalnika,
w kto´rym zwia˛zki były podawane), a procesem peroksydacji białek. Stosownym
biowskaz´nikiem oksydacyjnych uszkodzen´ białek były grupy karbonylowe
amino-kwaso´w. W badaniach okres´lono stopien´ powstawania zwia˛zko´w karbonylowych
jako skutek ro´wnoczesnego działania czynnika kancerogennego
9,10-dimetyloben-zantracenu (DMBA).
MATERIAŁ I METODYKA
W badaniach wykorzystano samice szczuro´w rasy Sprague-Dawley (o cie˛z˙arze ok. 200 g). Zwierze˛ta pochodziły z Pracowni Zwierza˛t Laboratoryjnych Katedry i Zakładu Patologii Ogo´lnej i Dos´wiadczalnej Akademii Medycznej w Warszawie. Badania uzyskały aprobate˛ Komisji Etycznej przy Akademii Medycznej w Warszawie. Szczury miały zapewniony cia˛gły doste˛p do wody i paszy.
Ryc. 1. Produkty oksydacyjnej modyfikacji lizyny, argininy, proliny i histydyny (1). Fig. 1. The structure of carbonyl derivatives produced by oxidation of lysine, arginine, proline and histidine (1).
Zwierze˛ta podzielono na dwie grupy badawcze:
Grupa I – grupa badana – szczury, kto´rym podawano 9,10-dimetylo-1,2-benzantracen (DMBA) w dawce 80 mg/kg masy ciała w celu wywołania nowotworo´w sutka.
Grupa II – grupa kontrolna – szczury, kto´re przebywały w identycznych warunkach jak zwierze˛ta z grupy badanej i kto´rym nie podawano DMBA.
Zwierze˛ta w obu grupach badawczych otrzymywały diety zro´z˙nicowane pod wzgle˛dem rodzaju i dawki zwia˛zko´w polifenolowych (resweratrol, kwercetyna, genisteina) oraz rodzaju rozpuszczalnika, w kto´rym je podawano (układ wodny i olej rzepakowy). Powyz˙sze diety podawano zwierze˛tom od 40 dnia do 20 tygodnia z˙ycia.
Materiał do badan´ stanowiły wa˛troby pobrane po dekapitacji szczuro´w w 20 tyg. z˙ycia. Zebrane wa˛troby przechowywano w temp. –70°C do czasu wykonywania analiz.
Metoda zastosowana w omawianej pracy wykorzystuje fakt, z˙e niekto´re RFT atakuja˛ aminokwasy w białkach (szczego´lnie histydyne˛, arginine˛, lizyne˛ i proline˛), utleniaja˛c je z wytworzeniem grup karbonylowych (ryc. 1). Grupy te reaguja˛c z 2,4-dinitrofenylohydrazyna˛ tworza˛ 2,4-dinitrofenylohyd-razony, kto´re naste˛pnie oznaczane sa˛ spektrofotometrycznie, przy dł. fali 370 nm (7, 8). W celu uzyskania odpowiedzi na pytanie, w jakim stopniu białko uległo peroksydacji, ste˛z˙enie zwia˛zko´w karbonylowych przeliczano na mg białka (9).
Otrzymane wyniki poddano weryfikacji statystycznej z zastosowaniem testu t-Studenta (10).
WYNIKI
Poro´wnanie zawartos´ci grup karbonylowych aminokwaso´w w wa˛trobach szczuro´w traktowanych i nietraktowanych DMBA, otrzymuja˛cych resweratrol, kwercetyne˛ lub genisteine˛ w zawiesinie olejowej (ryc. 2) pozwala stwierdzic´, z˙e ste˛z˙enia oznaczanych biowskaz´niko´w w grupie kontrolnej i badanej sa˛ zbliz˙one we wszystkich przypadkach. Dla z˙adnego z zastosowanych polifenoli nie uzyskano ro´z˙nic istotnych statystycznie. Podobnie w przypadku podawania wybranych polifenoli w zawiesinie wodnej, zawartos´ci grup karbonylowych aminokwaso´w w wa˛trobach były podobne u zwierza˛t otrzymuja˛cych,
Ryc. 2. Wpływ DMBA i wybranych polifenoli (resweratrolu, kwercetyny i genisteiny), podawanych zwierze˛tom w zawiesinie olejowej, na zawartos´c´ grup karbonylowych aminokwaso´w (nmol/mg białka). Fig. 2. Effect of DMBA and selected polyphenols (resveratrol, quercetin, genistein,) administered to
Ryc. 3. Wpływ wybranych polifenoli (resweratrolu, kwercetyny i genisteiny) podawanych w zawiesinie wodnej na zawartos´c´ grup karbonylowych aminokwaso´w (nmol/mg) białka] u zwierza˛t traktowanych
i nietraktowanych DMBA.
Fig. 3. Effect of selected polyphenols (resveratrol, quercetin, genistein) administered in aqueous suspension on aminoacid carbonyl group content (nmol/mg protein) in animals treated and non-treated
with DMBA.
ba˛dz´ nie DMBA (ryc. 3). Natomiast w przypadku stosowania diet bez dodatku zwia˛zko´w poli-fenolowych ro´z˙nice mie˛dzy grupa˛ kontrolna˛, a badana˛ sa˛ wyraz´ne. Przeprowadzone badania wykazały, z˙e w wa˛trobach szczuro´w karmionych dieta˛ standardowa˛, ba˛dz´ wzbogacona˛ w sam olej rzepakowy, zawartos´c´ grup karbonylowych aminokwaso´w jest znacznie wyz˙sza w grupie otrzymuja˛cej DMBA w poro´wnaniu do grupy kontrolnej (DMBA –) (ryc. 2 i 3). Uzyskano istotna˛ statystycznie ro´z˙nice˛ (przy
α= 0,05).
Stwierdzono, z˙e zawartos´c´ utlenionych form białek w wa˛trobach szczuro´w karmionych dietami wzbogaconymi w polifenole zmieniła sie˛ w stosunku do zwierza˛t, kto´rym nie podawano tych zwia˛zko´w. Wszystkie zastosowane zwia˛zki polifenolowe wykazywały taka˛ sama˛ tendencje˛ działania.
W przypadku szczuro´w traktowanych DMBA i zwia˛zkami polifenolowymi naste˛powało obniz˙enie ste˛z˙enia grup karbonylowych aminokwaso´w, w poro´wnaniu do grupy pozbawionej wsparcia ze strony polifenoli. Takie działanie polifenoli zaobserwowano zaro´wno przy podaniu ich w zawiesinie wodnej, jak i zawiesinie olejowej. Istotne statystycznie ro´z˙nice (przy α = 0,05) wysta˛piły dla wszystkich polifenoli podawanych w zawiesinie wodnej, wzgle˛dem danych dotycza˛cych diety standardowej (ryc. 3). Przy podaniu polifenoli w zawiesinie olejowej istotne statystycznie ro´z˙nice (przyα= 0,05) uzyskano tylko w przypadku kwercetyny (ryc. 2). W pozostałych dietach spadek zawartos´ci grup karbonylowych białek był wyraz´ny, lecz nie istotny statystycznie.
U zwierza˛t, nie otrzymuja˛cych DMBA, podawanie polifenoli w diecie prowadziło do podwyz˙szenia zawartos´ci grup karbonylowych aminokwaso´w w wa˛trobie. Istotne statystycznie ro´z˙nice (przyα= 0,05) wysta˛piły dla wszystkich polifenoli podawanych w zawiesinie wodnej. Natomiast przy podaniu ich w zawiesinie olejowej istotne statystycznie ro´z˙nice uzyskano tylko dla resweratrolu i genisteiny (przy
α= 0,1).
W badaniach starano sie˛ ro´wniez˙ uzyskac´ odpowiedz´, czy dawka danego zwia˛zku polifenolowego wpływa na siłe˛ jego działania. W tym celu poro´wnano zawartos´c´ grup karbonylowych w wa˛trobie szczuro´w otrzymuja˛cych genisteine˛ w zawiesinie wodnej w dawce 0,375 mg/cm3lub 0,1 mg/cm3. Nie stwierdzono istotnych ro´z˙nic w zawartos´ciach grup karbonylowych (ryc. 3). Mimo zastosowania ponad 3-krotnie wyz˙szej dawki, skutecznos´c´ działania przeciwutleniaja˛cego genisteiny nie zwie˛kszyła sie˛, nie zmieniła sie˛ takz˙e siła niepoz˙a˛danego działania prooksydacyjnego.
Ryc. 4. Wpływ wybranych polifenoli podawanych w zawiesinie wodnej i olejowej na zawartos´c´ grup karbonylowych aminokwaso´w u zwierza˛t nietraktowanych DMBA.
Fig. 4. Effect of selected polyphenols administered in aqueous or oil suspension on aminoacid carbonyl group content (nmol/mg protein) in animals non-treated with DMBA.
Ryc. 5. Wpływ wybranych polifenoli podawanych w zawiesinie wodnej i olejowej na zawartos´c´ grup karbonylowych aminokwaso´w u zwierza˛t traktowanych DMBA.
Fig. 5. Effect of selected polyphenols administered in aqueous or oil suspension on aminoacid carbonyl group content (nmol/mg protein) in animals treated with DMBA.
Ponadto otrzymane wyniki wyraz´nie wskazuja˛, z˙e ste˛z˙enie grup karbonylowych aminokwaso´w w wa˛trobach szczuro´w karmionych dietami wzbogaconymi w zawiesiny olejowe polifenoli, jest znacznie wyz˙sze niz˙ w przypadku podawania ich w zawiesinach wodnych (ryc. 4 i 5). Przy czym ro´z˙nice w zawartos´ci analizowanych biowskaz´niko´w jakie wysta˛piły mie˛dzy tymi grupami (wodne i olejowe) były istotne statystycznie (przyα= 0,05) dla wszystkich badanych polifenoli, zaro´wno w przypadku zwierza˛t otrzymuja˛cych, jak i nie otrzymuja˛cych DMBA. Moz˙na zatem wnioskowac´, z˙e podwyz˙szona zawartos´c´ tłuszczo´w w diecie jest czynnikiem stymuluja˛cym peroksydacje˛ białek.
DYSKUSJA
W ostatnich latach przybywa badan´, potwierdzaja˛cych wyste˛powanie podwyz˙szonego poziomu grup karbonylowych aminokwaso´w w wielu stanach patologicznych. Zwie˛kszona zawartos´c´ tak zmodyfiko-wanych oksydacyjnie białek moz˙e byc´ przyczyna˛ choroby lub pojawiac´ sie˛ w konsekwencji rozwoju danego schorzenia. Obecnie, do choro´b zwia˛zanych w ro´z˙ny sposo´b z obecnos´cia˛ grup karbonylowch aminokwaso´w, zalicza sie˛: chorobe˛ Alzheimera, chorobe˛ Parkinsona, cukrzyce˛, miaz˙dz˙yce˛, reumatoidal-ne zapalenie stawo´w, przewlekłe choroby płuc, dysplazje˛ oskrzelowo-płuca˛, przewlekła˛ niewydolnos´c´ nerek, mocznice˛, łuszczyce˛, zac´me˛, sepse˛, stwardnienie zanikowe boczne, zespo´ł ostrego wyczerpania oddechowego dorosłych, mukowiscydoze˛, nowotwory (11, 12, 13, 14).
Na uwage˛ zasługuje ro´wniez˙ fakt istnienia zalez˙nos´ci mie˛dzy procesem starzenia (naturalnego i w zespołach przedwczesnego starzenia), a zawartos´cia˛ grup karbonylowych (15). Wzrost ste˛z˙enia białkowych pochodnych karbonylowych zwia˛zanych z wiekiem wykryto m.in. w nerkach i wa˛trobie szczuro´w, w mo´zgu ludzi, w ludzkich czerwonych krwinkach, mie˛s´niach, fibroblastach (16). Zwia˛zki karbonylowe moga˛ byc´ biomarkerami w takich chorobach jak progeria Hutchinsona-Gilforda i zespo´ł
Wernera (zespoły przedwczesnego starzenia sie˛) (1).
Obecnos´c´ zwia˛zko´w polifenolowych w diecie moz˙e decydowac´ o intensywnos´ci przebiegu proceso´w oksydacyjnych w organizmie. S
´
wiadcza˛ o tym m.in. nasze badania, w kto´rych stwierdzilis´my, z˙e polifenole (resweratrol, genisteina i kwercetyna) hamuja˛ powstawanie oksydowanych białek stymulowa-ne działaniem kancerogenu (7,8-dimetylobenzantracenu), zas´ przy jego braku naste˛powało nasilenie powstawania uszkodzen´ oksydacyjnych. Spostrzez˙enia te potwierdzaja˛ wyniki prac innych autoro´w, nie mniej jednak istnieja˛ tez˙ doniesienia przedstawiaja˛ce odmienne dane. I tak np. Misra i wspo´łpr. (17), podaja˛c napar z czarnej herbaty (20 g/dm3) s´winkom morskim eksponowanym na działanie dymu papierosowego (5 papieroso´w na s´winke˛ na dzien´) wykazali ro´wniez˙ protekcyjne działanie polifenoli i obniz˙enie zawartos´ci grup karbonylowych białek w płucach, wa˛trobie i sercu badanych zwierza˛t w stosunku do grupy kontrolnej, kto´ra zamiast naparu herbaty otrzymywała wode˛.Young i wspo´łpr. (18) badaja˛c wpływ soku z czarnej porzeczki i soku jabłkowego (w
ilos´-ciach odpowiadaja˛cych 4,8; 6,4; 9,6 mg kwercetyny/dzien´) podawanych zdrowym pacjentom przez tydzien´ stwierdzili podwyz˙szenie ste˛z˙enia 2-aminoadipilosemialdehydu w osoczu (produktu oksyda-cyjnych uszkodzen´ lizyny) i brak wpływu na zawartos´c´ glutamylosemialdehydu (pochodna argininy) u badanych oso´b. Autorzy tej pracy tłumacza˛ jednak uzyskane wyniki prooksydacyjnego działania moz˙liwos´cia˛ wpływu innych składniko´w zawartych w wyz˙ej wymienionych sokach, a nie wyła˛cznie obecnos´cia˛ kwercetyny. Wzrost zawartos´ci karbonylowanych grup aminokwaso´w u zwierza˛t nie traktowanych DMBA moz˙e byc´ zwia˛zany mie˛dzy innymi z samym metabolizmem polifenoli i ich wpływem na układ cytochromo´w w wa˛trobie, jednak potwierdzenie tej tezy wymaga dalszych badan´ (19).
Natomiast Young i wspo´łpr. (20) podaja˛c przez 7 dni ekstrakt z pestek winogron (210 cm3 zawiera 31,3 mg polifenoli i katechiny) nie stwierdzili zmian w zawartos´ci 2-aminoadipilosemialdehydu w albuminach osocza oso´b badanych. Podobnie brak efektu na ste˛z˙enie tego samego biomarkera stwierdzono u oso´b, kto´re otrzymywały diete˛ wzbogacona˛ w pietruszke˛ dostarczaja˛ca˛ 3,73-4,49 mg apigeniny przez 7 dni (21).
Z badan´ Funabiki i wspo´łpr. (22) wynika, z˙e podawanie zwierze˛tom (szczurom) diety wzbogaconej w 2,5% wodny roztwo´r pochodnej rutyny (G-rutyny) przez 18 dni zmniejsza zawartos´c´ grup karbonylowych. W innej pracy osoby otrzymywały sok winogronowy w ilos´ci 10 cm3/kg/dzien´ przez 2 tyg. (23). U oso´b badanych stwierdzono obniz˙enie zawartos´ci białkowych grup karbonylowych w osoczu.
Działanie przeciwutleniaczy powinno prowadzic´ do obniz˙enia zawartos´ci biowskaz´niko´w, tymczasem podane przykłady badan´ pokazuja˛ jak nie jednoznaczne sa˛ uzyskane wyniki, co moz˙na tłumaczyc´ bardzo
skomplikowanymi mechanizmami zachodza˛cymi w organizmie, ale ro´wniez˙ byc´ moz˙e nie doskonałos´-cia˛ metod analitycznych stosowanych w prowadzonych analizach.
Naste˛pnym poruszanym w pracy zagadnieniem jest fakt, z˙e skutecznos´c´ działania antyoksydacyjnego danego przeciwutleniacza pozostaje w s´cisłym zwia˛zku z jego biodoste˛pnos´cia˛, kto´ra˛ okres´la mie˛dzy innymi s´rodowisko rozpuszczalnika. W cia˛gu ostatnich lat pojawiło sie˛ wiele doniesien´ o wynikach badan´ nad absorbcja˛, biodystrybucja˛, metabolizmem i wydalaniem polifenoli, prowadzonych w warun-kach in vitro i in vivo (24, 25). Szybkos´c´ i wydajnos´c´ wchłaniania jelitowego, a takz˙e charakter powstaja˛cych metabolito´w w duz˙ej mierze uzalez˙niony jest od chemicznej struktury i masy cza˛stecz-kowej zwia˛zku. Faktem jest, z˙e aglikony flawonoidowe z´le rozpuszczaja˛ sie˛ w wodzie. Azuma i wspo´łpr. wykazali, z˙e mieszanina lipido´w i emulgatoro´w moz˙e zwie˛kszac´ absorbcje˛ aglikono´w kwercetyny u szczuro´w (26). Wyniki przedstawione w pracy ukazuja˛, z˙e w tym przypadku, przy takim modelu badawczym kierunek działania zwia˛zko´w polifenolowych podawanych w zawiesinie wodnej, ba˛dz´ olejowej pozostawał taki sam, jednak dodatek oleju rzepakowego powodował wzrost zawartos´ci białkowych grup karbonylowych w wa˛trobach szczuro´w. We wczes´niej prowadzonych badaniach stwierdzono ro´wniez˙ taka˛ tendencje dla oliwy i oleju słonecznikowego (27). Tłuszcze zawarte w diecie wykazuja˛ działanie synergistyczne z czynnikiem kancerogennym (DMBA) stymuluja˛c tworzenie sie˛ grup karbonylowych aminokwaso´w.
WNIOSKI
1. Obecnos´c´ zwia˛zko´w polifenolowych w diecie moz˙e decydowac´ o
intensyw-nos´ci przebiegu proceso´w oksydacyjnych w organizmie.
2. Polifenole (resweratrol, genisteina, kwercetyna) hamuja˛ powstawanie
zok-sydowanych białek stymulowane działaniem kancerogenu DMBA, zas´ przy jego
braku naste˛puje nasilenie powstawania uszkodzen´ oksydacyjnych.
3. Tłuszcze zawarte w diecie wykazuja˛ działanie synergistyczne z czynnikiem
kancerogennym (DMBA), stymuluja˛c tworzenie sie˛ grup karbonylowych
amino-kwaso´w.
A. T o k a r z, B. B o b r o w s k a, G. G r y n k i e w i c z, M. M a t y s i a k THE INFLUENCE OF POLYPHENOLS UPON PROTEIN OXIDATION IN THE LIVER OF RATS WITH DMBA-INDUCED BREATS CANCERS
S u m m a r y
The aim of the present study was to assess the effect of diets with various content of polyphenols (polyphenol dose and solvent type) upon protein peroxidation. Aminoacid carboxyl groups were used as the biomarkers of the protein oxidative damage. The formation of carbonyl compounds was assessed as an effect of the simultaneous activity of a carcinogen, 9,10-dimethylbenzene anthracene (DMBA). Livers of 20-week Spraque-Dawley female rats killed by decapitation were used as the test material. Our results demonstrate that the polyphenol compounds in the diet may critically affect the intensity of the oxidative processes taking place in the system. The polyphenols (genistein, quercetin, resveratrol) acted to inhibit DMBA-induced formation of oxidated proteins; on the other hand, when DMBA was not present, the process of carbonyl group formation was more intense. The fats contained in the diet show a synergistic effect with the DMBA carcinogen to stimulate the process of aminoacid oxidation.
PIS
´
MIENNICTWO1. Bartosz G.: Druga twarz tlenu. PWN, Warszawa, 2004. – 2. Stadtman E.R., Levine R.L.: Protein oxidation. Ann. N.Y. Acad. Sci., 2000; 899: 191-208. – 3. Griffiths H.R., Møller L., Bartosz G. i wspo´łpr.: Biomarkers. Mol. Aspects Med., 2002; 23: 101-208. – 4. Rietjens I.M.C.M., Boersma M.G.,
de Haan L., Spenkelink B., Awad H.M., Cnubben N.H.P., van Zanden J.J., van der Woude H., Alink G.M., Koeman J.H.: The pro-oxidant chemistry of the natural antioxidants vitamin C, vitamin E,
carotenoids and flavonoids. Enviro. Toxicol. Phar., 2002; 11: 321-333. – 5. Heim K.E., Tagliaferro A.R.,
Bobilya D.J.: Flavonoid antioxidants: chemistry, metabolism and structure-activity relationships. J. Nutr.
Biochem., 2002; 13: 572-584. – 6. Soobrattee M.A., Neergheen V.S., Luximon-Ramma A., Aruoma O.I.,
Bahorun T.: Phenolics as potential antioxidant therapeutic agents: Mechanism and actions. Mutat. Res.,
2005; 579: 200-213. – 7. Reznick A.Z., Packer L.: Oxidative damage to proteins: spectrophotometric method for carbonyl assay. Method Enzymol., 1994; 233: 357-363. – 8. Evans P., Lyras L., Halliwell B.: Measurment of protein carbonyls in human brain tissue. Method Enzymol., 1999; 300: 145-156. – 9. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J.: Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 1951; 193: 265-275. – 10. Platt C.: Problemy rachunku prawdopodobien´stwa i statystyki matematycznej, PWN, Warszawa, 1980.
11. Dalle-Donne I., Giustarini D., Colombo R., Rossi R., Milzani A.: Protein carbonylation in human diseases. Trends Mol. Med., 2003; 9: 169-176. – 12. Beal M.F.: Oxidatively modified proteins in aging and disease. Free Rad. Biol. Med., 2002; 32(9): 797-803. – 13. Dalle-Donne I., Rossi R., Giustarini D.,
Milzani A., Colombo R.: Protein carbonyl groups as biomarkers of oxidative stress. Clin. Chim. Acta,
2003; 329: 23-38. – 14. Yilmaz I.A., Akcay T., Cakatay U., Telci A., Ataus S., Yalcin V.: Relation between bladder cancer and protein oxidation. Int. Urol. Nephrol., 2003; 35(3): 345-350. – 15. Levine R.L.,
Stadtman E.R.: Oxidative modification of proteins during aging. Exp. Gerontol., 2001; 36: 1495-1502.
– 16. Berlett B.S., Stadtman E.R.: Protein oxidation in aging, disease and oxidative stress. J. Biol. Chem., 1997; 272: 20313-20316. – 17. Misra A., Chattopapadhyay R., Banerjee S., Chattopapadhyay J.,
Chatterjee I.B.: Black tea prevents cigarette smoke-induced oxidative damage of proteins in guinea pigs.
J. Nutr., 2003; 133: 2622-2628. – 18. Young J.F., Nielsen S.E., Haraldsdo´ttir J., Daneshvar B.,
Lauridsen S.T., Knuthsen P., Crozier A., Sandström B., Dragsted L.O.: Effect of fruit juice intake on
urinary quercetin excretion and biomarkers of antioxidative status. Am. J. Clin. Nutr., 1999; 69: 87-94. – 19. Malin´ska D., Kiersztan A.: Flawonoidy – charakterystyka i znaczenie w terapii. Poste˛py Biochemii, 2004; 50(2): 182-196. – 20. Young J.F., Dragsted L.O., Daneshvar B., Lauridsen S.T., Hansen M.,
Sandstrom B.: The effect of grape-skin extract on oxidative status. Br. J. Nutr., 2000; 84(4): 505-513.
21. Nielsen S.E., Young J.F., Daneshvar B., Laurindsen S.T., Knuthsen P., Sandstrom B., Dragsted
L.O.: Effect of parsley (Petroselinum crispum) intake on urinary apigenin excretion, blood antioxidant
enzymes and biomarkers of oxidative stress in human subjects. Br. J. Nutr, 1999; 81(6): 447-455. – 22. Funabiki R., Takeshita K., Miura Y., Shibasato M., Nagasawa T.: Dietary supplement of G-rutin reduces oxidative damage in the rodent model. J. Agric. Food. Chem., 1999; 47(3): 1078-1082. – 23. O’Byrne D.J., Devaraj S., Grundy S.M., Jialal I.: Comparison of the antioxidant effects of Concord grape juice flavonoids alpha-tocopherol on markers of oxidative stress in healthy adults. Am. J. Clin. Nutr, 2002; 76(6): 1367-1374. – 24. Tyszka-Czochara M., Knapik-Czajka M., Goz´dzialska A., Francik
R., Jas´kiewicz J.: Polifenole w diecie. Wybrane aspekty metabolizmu i biodoste˛pnos´ci zwia˛zko´w
polifenolowych. Farmacja Polska, 2003; 59(13): 589-597. – 25. Birt D.F., Hendrich S., Wang W.: Dietary agents in cancer prevention: flavonoids and isoflavonoids. Pharmacol Therapeut, 2001; 90: 157-177. – 26. Murota K., Terao J.: Antioxidative flavonoid quercetin: implication of its intestinal absorbtion and metabolism. Arch. Biochem. Biophys., 2003; 417: 12-17. – 27. Tokarz A., Sadurska B.,
Bobrowska B.: Wpływ tłuszczo´w ros´linnych na zawartos´c´ grup karbonylowych białek w wa˛trobie
szczuro´w. Bromat. Chem. Toksykol., 2006; 237-241. Adres: 02-097 Warszawa, ul. Banacha 1.
