Medycyna Weterynaryjna - Summary Medycyna Wet. 65 (2), 127-130, 2009

Medycyna Wet. 2009, 65 (2) 127

Praca oryginalna Original paper

Staphylococcus aureus stanowi jedn¹ z najczêst-szych przyczyn zapalenia wymienia krów (3, 5, 7, 18). Schorzenie to przyczynia siê do obni¿enia produkcji mleka i pogorszenia jego jakoœci. Profilaktykê i tera-piê mastitis utrudnia ró¿norodnoœæ czynników etiolo-gicznych (9). Szczepy gronkowca z³ocistego s¹ czêsto izolowane z mleka krów z ostr¹ postaci¹ zapalenia gruczo³u mlekowego, najczêœciej jednak od zwierz¹t nie wykazuj¹cych objawów klinicznych (1, 7). Zaka-¿enia gronkowcowe s¹ wynikiem inwazji bakterii do tkanek, a nastêpnie ich toksycznej i/lub enzymatycz-nej aktywnoœci (17). Wielu autorów podkreœla rolê, jak¹ w mastitis krów odgrywaj¹ wytwarzane przez te patogeny pirogenne egzotoksyny o w³aœciwoœciach su-perantygenów, do których nale¿¹ enterotoksyny gron-kowcowe – SEs (staphylococcal enterotoxins) oraz tok-syna zespo³u wstrz¹su toksycznego TSST-1 (toxic--shock syndrome toxin-1) (6, 7, 10, 22). Wykazano

tak¿e, i¿ zdolnoœæ do wytwarzania tych toksyn, zw³asz-cza enterotoksyny C (SEC) i toksyny TSST-1, nie jest konieczna do wywo³ania mastitis (2, 26). Ze wzglêdu na specyficzn¹ biologiê gronkowca z³ocistego, nie-zmiernie wa¿n¹ rolê odgrywa dok³adne typowanie szczepów (typizacja klonalna), u³atwiaj¹ce przeprowa-dzenie szerszych badañ, w tym analizy czynników zjad-liwoœci (15, 16, 18, 24). Stosuj¹c analizê klonaln¹ mo¿-na okreœliæ determimo¿-nanty genetyczne opornych mo¿-na pre-paraty przeciwbakteryjne szczepów S. aureus, a tym samym ustaliæ ich kr¹¿enie pomiêdzy organizmami zwierz¹t i ludzi, ze wskazaniem na g³ówny rezerwuar tych drobnoustrojów (20).

Wiarygodna identyfikacja i ró¿nicowanie szczepów gronkowców (tak¿e w obrêbie gatunku) maj¹ istotne znaczenie, zarówno z klinicznego, jak i epidemiolo-gicznego punktu widzenia. Zastosowanie technik mo-lekularnych, w tym testu RAPD-PCR (Randomly Amplified Polymorphic DNA-PCR) s³u¿¹cego do lo-sowej amplifikacji fragmentów bakteryjnego DNA,

Typowanie molekularne szczepów

Staphylococcus aureus wyizolowanych

z mleka krów chorych na mastitis*

)

PAWE£ NAWROTEK, JOLANTA KARAKULSKA, DANUTA CZERNOMYSY-FUROWICZ, JACEK BORKOWSKI, ANTONI J. FUROWICZ

Katedra Immunologii i Mikrobiologii Wydzia³u Biotechnologii i Hodowli Zwierz¹t AR, ul. Doktora Judyma 24, 71-466 Szczecin

Nawrotek P., Karakulska J., Czernomysy-Furowicz D., Borkowski J., Furowicz A. J.

Molecular typing of Staphylococcus aureus strains isolated from milk of mastitic cows Summary

The aim of these studies was the clonal analysis of 48 S. aureus strains, isolated from milk samples from 48 cows with clinical and subclinical mastitis. Specific markers were detected using PCR: gap gene as the genus marker for Staphylococcus spp. and nuc gene as the species marker for S. aureus. Clonal typing of S. aureus isolates was carried out using RAPD-PCR with two primers simultaneously. Clonal relatedness was deter-mined on the basis of the number and molecular mass of RAPD amplicons and analyzed using the unweighted pair group method with arithmetic mean (UPGMA) and Jaccard’s similarity coefficient. On the basis of RAPD-PCR and clonal analysis employing the UPGMA method with Jaccard coefficient it was determined that all of the analyzed S. aureus strains were identical on the genome level. This indicates that only one bacterial clonal type was responsible for mastitis caused by S. aureus in the analyzed herd. This denotes that the virulence of S. aureus isolated from mastitis cases is very high, and that the elimination of this strain is very difficult. The research showed the usefulness of RAPD-PCR in interspecies S. aureus strains typization and the prospect of employing it in routine epidemiological diagnostics of mastitis in cows. The contribution of S. aureus strains representing one clonal type in the etiology of mastitis in cows from one herd was also confirmed.

Keywords: Staphylococcus aureus, mastitis, RAPD-PCR, molecular epidemiology

*) _{Badania finansowane ze œrodków na naukê w latach 2008-2009 jako}

Medycyna Wet. 2009, 65 (2) 128

umo¿liwia przeprowadzenie dok³adnej analizy geno-typowej, znacznie zwiêkszaj¹cej potencja³ diagnosty-ki bakteriologicznej, w tym gronkowca z³ocistego (8, 13-16).

Celem badañ by³o przeprowadzenie analizy klonal-nej (ustalenie pokrewieñstwa genotypowego) szcze-pów S. aureus wyizolowanych z mleka krów chorych na mastitis.

Materia³ i metody

Materia³ stanowi³o 48 szczepów S. aureus, wyizolowa-nych z mleka 48 krów rasy holsztyno-fryzyjskiej z klinicz-n¹ lub podkliniczklinicz-n¹ postaci¹ mastitis. Szczepy te pocho-dzi³y z kolekcji Katedry Immunologii i Mikrobiologii Aka-demii Rolniczej w Szczecinie. Przechowywano je w temp. –20°C w pod³o¿u Tryptone Soya Broth (Oxoid) z 10% gli-cerolu.

Pochodzenie szczepów. Bakterie wyizolowano podczas badañ prowadzonych od wrzeœnia do grudnia 2004 r., w wielkotowarowym gospodarstwie zlokalizowanym w wo-jewództwie zachodniopomorskim. Stado liczy³o 200 krów. Szczepy S. aureus by³y wyosobniane z mleka 48 krów na podstawie przeprowadzonego przez lekarza weterynarii testu TOK oraz oceny stanu klinicznego wymienia. Krowy by³y utrzymywane w systemie wolnostanowiskowym, z boksami do le¿enia wyœcie³anymi trocinami, ze swobod-nym dostêpem do wody i paszy.

Izolacja i oczyszczanie materia³u genetycznego. DNA z komórek bakteryjnych wyekstrahowano przy u¿yciu go-towego zestawu Genomic Mini AX Bacteria (A&A Bio-technology, Gdynia), po uprzednim rozmro¿eniu i zwor-teksowaniu hodowli, a nastêpnie zawieszeniu 50 µL ho-dowli w 1 mL Tryptone Soya Broth i inkubacji w 37°C przez 18 h.

Identyfikacja S. aureus przy u¿yciu PCR. Przynale¿-noœæ systematyczn¹ badanych szczepów oznaczono na pod-stawie obecnoœci specyficznych markerów genetycznych: rodzajowego – gap i gatunkowego – nuc. Fragment genu gap, koduj¹cego bia³ko wi¹¿¹ce transferynê oraz genu nuc, koduj¹cego termostabiln¹ nukleazê, amplifikowano przy u¿yciu starterów przygotowanych na podstawie prac Yugue-rosa i wsp. (23) oraz Wilsona i wsp. (21), zgodnie z warun-kami reakcji podanymi przez tych autorów. Badania te re-alizowano wed³ug procedury przedstawionej we wczeœniej-szym opracowaniu (12).

Test RAPD-PCR. Charakterystyczny profil amplifika-cyjny (RAPD) dla poszczególnych izolatów uzyskano przy u¿yciu starterów przygotowanych na podstawie pracy Rei-noso i wsp. (16) oraz warunków PCR podanych przez tych autorów, a tak¿e w oparciu o w³asn¹ optymalizacjê reakcji. Jako najlepiej ró¿nicuj¹ce wybrano dwa 10-nukleotydowe startery: OLP11 ACGATGAGCC-3’) i OLP13 (5’--ACCGCCTGCT-3’), zawieraj¹ce 60-70% par G-C i sek-wencje niepalindromowe. Starterów u¿yto ³¹cznie, w celu otrzymania wiêkszej liczby amplikonów oraz uzyskania po-wtarzalnoœci wyników. Amplifikacjê prowadzono w mie-szaninie reakcyjnej o objêtoœci 20 µL, zawieraj¹cej: 10,60 µL wody dejonizowanej wolnej od nukleaz (Fermentas), 2 µL 10 × stê¿onego buforu dla Taq polimerazy z (NH₄)₂SO₄, 2,8 µL MgCl₂ (3,5 mM), 2 µL ka¿dego z dNTP (0,2 mM),

0,4 µL (2 U) rekombinowanej polimerazy Taq DNA (Fer-mentas), po 0,6 µL ka¿dego ze starterów (IBB PAN) w stê-¿eniu koñcowym 3 µM oraz 1 µL roztworu genomowego DNA. Reakcje nastawiano na stanowisku do PCR – DNA/ RNA UV-Cleaner, typ UVC/T-AR (Biosan). PCR przepro-wadzano w termocyklerze Mastercycler personal (Eppen-dorf), przy zachowaniu nastêpuj¹cych parametrów ampli-fikacji: denaturacja wstêpna (94°C/5 min.), 40 cykli sk³a-daj¹cych siê z: denaturacji (93°C/1 min.), przy³¹czania star-terów (37°C/1,5 min.) i wyd³u¿ania (72°C/1 min.) oraz koñcowe wyd³u¿anie starterów (72°C/8 min.). Reakcjê PCR przeprowadzano dwukrotnie, celem potwierdzenia powta-rzalnoœci wyników.

Detekcja produktów RAPD-PCR. Produkty amplifi-kacji rozdzielano elektroforetycznie w 1,5% ¿elu agarozo-wym (Prona), wybarwianym 1% wodnym roztworem brom-ku etydyny (Merck) (2,5 µL EtBr/80 mL ¿elu), w aparacie Sub-Cell GT Wide Mini z zasilaczem PowerPac Basic (Bio-Rad). Mieszaniny reakcyjne nanoszono na ¿el w iloœci 12 µL, po uprzednim wymieszaniu z 2 µL 6 × stê¿onego buforu obci¹¿aj¹cego (Fermentas). Rozdzia³ elektroforetyczny pro-wadzono w buforze 1 × TBE (Bio-Rad), przy sta³ym na-piêciu 100 V (5 V/1 cm ¿elu) przez 60 min. Amplikony porównywano z markerem mas molekularnych O’Gene-Ruler™ DNA Ladder Mix (Fermentas) w zakresie 10 000--100 pz. Wyniki analizowano jakoœciowo i iloœciowo oraz archiwizowano przy u¿yciu systemu do dokumentacji i ana-lizy ¿eli – IG/LHR InGenius LHR (Syngene).

Analiza klonalna szczepów S. aureus. Pokrewieñstwo genotypowe badanych szczepów oznaczano na podstawie liczby i masy molekularnej uzyskanych amplikonów RAPD, przy u¿yciu metody par skojarzonych z zastosowaniem œred-niej arytmetycznej (UPGMA – unweighted pair group me-thod with arithmetic mean) oraz wspó³czynnika podobieñ-stwa Jaccarda, wykorzystuj¹c oprogramowanie GeneTools (Syngene).

Walidacja testu RAPD-PCR. Specyficznoœæ i powta-rzalnoœæ testu RAPD-PCR wykazano przeprowadzaj¹c re-akcjê z DNA referencyjnych szczepów S. aureus PCM 2054 i S. aureus PCM 502 (kolekcja PCM, Instytut Immunologii i Terapii Doœwiadczalnej we Wroc³awiu). Ka¿dorazowo wykonywano tak¿e reakcje RAPD-PCR bez matrycy DNA, stanowi¹ce kontrole negatywne reagentów PCR.

Wyniki i omówienie

W wyniku reakcji RAPD-PCR, przeprowadzanej jednoczeœnie z dwoma starterami, ka¿dorazowo uzys-kiwano jeden powtarzalny wzór 6 produktów amplifi-kacji, o masie molekularnej w zakresie od 230 do 1000 pz. Zastosowane w teœcie RAPD-PCR startery, ³¹cz¹c siê losowo z mniej lub bardziej homologicznymi sek-wencjami DNA szczepów S. aureus, utworzy³y w wy-niku amplifikacji, a nastêpnie rozdzia³u elektrofore-tycznego, charakterystyczny uk³ad pr¹¿ków zdefinio-wany jako „profil RAPD-PCR” (profil genotypowy szczepów gronkowca z³ocistego) (ryc. 1). Interpreta-cja wyniku rozdzia³u elektroforetycznego, polegaj¹ca na porównaniu po³o¿enia amplikonów wzglêdem mar-kera mas molekularnych (GeneRuler™ DNA Ladder Mix), ocenie ich intensywnoœci oraz analizie

uzyska-Medycyna Wet. 2009, 65 (2) 129

nych danych, pozwoli³a na dok³adn¹ typizacjê bada-nych izolatów. Du¿¹ wartoœæ diagnostyczn¹ techniki RAPD oraz jej zastosowanie w epidemiologii chorób zakaŸnych, w tym mastitis na tle gronkowca z³ociste-go, prezentowano w licznych opracowaniach (13-16, 24). Analiza obrazu elektroforetycznego produktów RAPD-PCR przeprowadzona metod¹ par skojarzonych (UPGMA) ze wspó³czynnikiem podobieñstwa Jac-carda, dowiod³a, i¿ wszystkie analizowane szczepy S. aureus wykaza³y identycznoœæ na poziomie geno-mu (wzajemna korelacja genotypowa na poziomie 100%). W œwietle uzyskanych danych ustalono, ¿e mastitis krów na tle gronkowca z³ocistego w badanym stadzie wywo³ane zosta³o przez jeden typ klonalny tej bakterii. Zbli¿one wyniki uzyskali autorzy, którzy przy u¿yciu techniki PCR-fingerprinting przeprowadzali ge-notypowanie szczepów S. aureus wyizolowanych od krów pochodz¹cych z jednego lub kilku stad (cyt. za 18). O epidemii mastitis u krów wywo³anej przez je-den szczep gronkowca z³ocistego donosi³ równie¿ Smith i wsp. (cyt. za 5). Z kolei Sachanowicz i wsp. (18) zwrócili uwagê na znaczne zró¿nicowanie na po-ziomie genomowym szczepów S. aureus pochodz¹-cych z tego samego Ÿród³a. Wskazuj¹ na to równie¿ wyniki badañ KuŸmy i wsp. (5-7), którzy analizowali zró¿nicowane szczepy gronkowca z³ocistego izolowa-ne od krów chorych na mastitis, z tym ¿e krowy te pochodzi³y z ró¿nych stad.

Wykazana w badaniach w³asnych dominacja jedne-go szczepu gronkowca z³ocistejedne-go kr¹¿¹cejedne-go w anali-zowanym stadzie krów wskazuje na mo¿liwoœæ trans-misji szczepów S. aureus z zaka¿onych æwiartek

mienia poprzez mleko na inne æwiartki, wy-miona, a nastêpnie kolejne krowy (3). Œwiadczy to o wysokiej zaraŸliwoœci gron-kowca z³ocistego, wywo³uj¹cego zapalenie gruczo³u mlekowego u krów, co w bezpo-œredni lub pobezpo-œredni sposób wykazywane jest przez wielu badaczy zajmuj¹cych siê mas-titis na tle gronkowcowym (1, 3, 5, 8, 15). Ponadto, obecnoœæ szczepów S. aureus o jed-nakowym genotypie stanowi¹cych czynnik etiologiczny mastitis u krów pochodz¹cych z jednego stada, izolowanych w okresie kil-ku miesiêcy, mo¿e wskazywaæ na trudno-œci w ich eliminacji. Potwierdzaj¹ to wyni-ki badañ Myllys i wsp. (11), wed³ug któ-rych szczepy gronkowca z³ocistego o takim samym genotypie mog¹ byæ izolowane z mleka krów chorych na mastitis, zarów-no przed leczeniem, jak i po jego zakoñ-czeniu.

Zmiennoœæ fenotypowa bakterii uzasad-nia coraz czêstsze wprowadzanie do diagno-styki S. aureus metod molekularnych, takich jak standardowy test PCR czy RAPD-PCR, znacznie u³atwiaj¹cych detekcjê oraz zwiêk-szaj¹cych stopieñ dyskryminacji szczepów izolowanych z tego samego lub ró¿nych Ÿróde³ (4, 13, 16, 19, 25). Pereira i wsp. (15) stwierdzaj¹ nawet, ¿e typowanie molekularne szczepów S. aureus jest nie-zbêdne do prawid³owego przeprowadzenia procesu diagnostycznego. Przedstawiona w niniejszej pracy procedura badawcza, oparta na teœcie RAPD-PCR, jed-noznacznie wskazuje na jego przydatnoœæ do wew-n¹trzgatunkowej typizacji szczepów gronkowca z³o-cistego oraz mo¿liwoœæ zastosowania w rutynowej diagnostyce epidemiologicznej zapalenia gruczo³u mlekowego u krów. Wykonane badania potwierdzaj¹ tak¿e udzia³ jednego typu klonalnego szczepów S. au-reus w etiologii mastitis u krów utrzymywanych w jed-nym stadzie. Na dominuj¹c¹ rolê szczepów S. aureus reprezentuj¹cych takie same genotypy w wywo³ywa-niu zapalenia gruczo³u mlekowego wskazuj¹ tak¿e inni autorzy (5, 8, 18).

Piœmiennictwo

1.Bystroñ J., Kosek-Paszkowska K., Molenda J.: Wystêpowanie gronkowców enterotoksycznych w mleku surowym. Medycyna Wet. 2001, 57, 645-648. 2.Furowicz A. J., Borkowski J., Ferlas M.: Toxic-shock syndrome with special

regard to clinical aspects in animals. Adv. Agric. Sci. 2004, 9, 23-32. 3.K³ossowska A., Malinowski E., KuŸma K.: Zale¿noœæ liczby komórek

soma-tycznych w mleku zatokowym krów z mastitis od bakteryjnego czynnika etiologicznego. Medycyna Wet. 2005, 61, 53-57.

4.Krawczyk B.: Diagnostyka molekularna w zaka¿eniach szpitalnych. Post. Mikrobiol. 2007, 46, 367-378.

5.KuŸma K., Malinowski E., Lassa H., K³ossowska A.: Analysis of protein A gene polymorphism in Staphylococcus aureus isolates from bovine mastitis. Bull. Vet. Inst. Pulawy 2005, 49, 41-44.

6.KuŸma K., Malinowski E., Lassa H., K³ossowska A.: Detection of genes for enterotoxins and toxic shock syndrome toxin-1 in Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis. Bull. Vet. Inst. Pulawy 2003, 47, 419-426. 7.KuŸma K., Malinowski E., Lassa H., K³ossowska A.: Wytwarzanie

entero-toksyn oraz entero-toksyny zespo³u wstrz¹su toksycznego przez szczepy Staphylo-coccus aureus izolowane z mastitis u krów. Medycyna Wet. 2005, 61, 282-285.

Ryc. 1. Obraz elektroforetyczny profili RAPD-PCR otrzymanych z pro-duktów amplifikacji DNA analizowanych szczepów S. aureus wyizolowa-nych z mleka krów chorych na mastitis: M – marker mas molekularwyizolowa-nych GeneRuler™ DNA Ladder Mix, w zakresie 10 000-100 pz; 1-48 – poszcze-gólne œcie¿ki z profilami RAPD-PCR kolejnych analizowanych szczepów S. aureus

Medycyna Wet. 2009, 65 (2) 130

8.Lam T. J., Lipman L. J., Schukken Y. H., Gaastra W., Brand A.: Epidemiolo-gical characteristics of bovine clinical mastitis caused by Staphylococcus aureus and Escherichia coli studied by DNA fingerprinting. Am. J. Vet. Res. 1996, 57, 39-42.

9.Malinowski E.: Zapalenia wymienia a zaburzenia p³odnoœci u krów. Medy-cyna Wet. 2004, 60, 793-797.

10.Matsunaga T., Kamat S. I., Kakiichi N., Uchida K.: Characteristics of Staphylococcus aureus isolated from peracute and chronic bovine mastitis. J. Vet. Med. Sci. 1993, 55, 297-300.

11.Myllys V., Ridell J., Bjorkroth J., Biese I., Pyorala S.: Persistence in bovine mastitis of Staphylococcus aureus clone as assessed by random amplified polymorphic DNA analysis, ribotyping and biotyping. Vet. Microbiol. 1997, 57, 245-251.

12.Nawrotek P., Borkowski J., Karakulska J., Furowicz A.: Test do szybkiego wykrywania szczepów Staphylococcus aureus w surowym mleku krowim. Mat. konf.: Zoonozy – aktualne zagro¿enia. SGGW, Warszawa 2006, s. 69. 13.Olorunfemi O. B., Onasanya A. A., Adetuyi F. C.: Genetic variation and

rela-tionship in Staphylococcus aureus isolates from human and food samples using random amplified polymorphic DNAs. Afr. J. Biotechnol. 2005, 4, 611-614.

14.Osek J.: Zastosowanie metody losowej amplifikacji DNA technik¹ PCR w typowaniu molekularnym bakterii. Medycyna Wet. 2003, 59, 10-14. 15.Pereira M. S. V., Leal N. C., Leal T. C. A., Sobreira M., de Almeida A. M. P.,

Siqueira-Júnior J. P., Campos-Takaki G. M.: Typing of human and bovine Staphylococcus aureus by RAPD-PCR and ribotyping-PCR. Lett. Appl. Microbiol. 2002, 35, 32-36.

16.Reinoso E., Bettera S., Frigerio C., DiRenzo M., Calzolari A., Bogni C.: RAPD-PCR analysis of Staphylococcus aureus strains isolated from bovine and human hosts. Microbiol. Res. 2004, 159, 245-255.

17.Rodgers J. D., McCullagh J. J., McNamee P. T., Smyth J. A., Ball H. J.: Comparison of Staphylococcus aureus recovered from personnel in a poultry hatchery and in broiler parent-farms with those isolated from skeleted disease in broilers. Vet. Microbiol. 1999, 69, 189-198.

18.Sachanowicz J., Jakubczak A., Piechota M.: W³aœciwoœci fenotypowe i ge-notypowe szczepów Staphylococcus aureus wyizolowanych z mleka krów chorych na mastitis. Medycyna Wet. 2005, 61, 1370-1373.

19.Tenover F. C., Weigel L. M., Appelbaum P. C., McDougal L. K., Chaitram J., McAllister S., Clark N., Killgore G., O’Hara C. M., Jevitt L., Patel J. B., Bozdogan B.: Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus isolate from a pa-tient in Pennsylvania. Antimicrob. Agents Chemother. 2004, 48, 275-280. 20.Turutoglu H., Ercelik S., Ozturk D.: Antibiotic resistance of Staphylococcus

aureus and coagulase-negative staphylococci isolated from bovine mastitis. Bull. Vet. Inst. Pulawy 2006, 50, 41-45.

21.Wilson I. G., Cooper J. E., Gilmour A.: Detection of enterotoxigenic Staphy-lococcus aureus in dried skimmed milk: use of the polymerase chain reaction for amplification and detection of staphylococcal enterotoxin genes entB and entC1 and the thermonuclease gene nuc. Appl. Environ. Microbiol. 1991, 57,

1793-1798.

22.Younis A., Krifucks O., Heller E. D., Samra Z., Glickman A., Saran A., Leit-ner G.: Staphylococcus aureus exosecretions and bovine mastitis. J. Vet. Med. 2003, 50, 1-7.

23.Yugueros J., Temprano A., Berzal B., Sánchez M., Hernanz C., Luengo J. M., Naharro G.: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase-encoding gene as a useful taxonomic tool for Staphylococcus spp. J. Clin. Microbiol. 2000, 38, 4351-4355.

24.Zadoks R. N., Schukken Y. H.: Use of molecular epidemiology in veterinary practice. Vet. Clin. Food Anim. 2006, 22, 229-261.

25.Zd¿alik D., Dominiak A., Ga³kowska H., Interewicz B., Olszewski W. L., Stelmach E., £uczak M., Machowski Z.: Charakterystyka molekularna szcze-pów Staphylococcus aureus i Staphylococcus epidermidis wyizolowanych z materia³u klinicznego. Med. Doœw. Mikrobiol. 2006, 58, 269-274. 26.Zschoeck M., Riße K., Sommerhäuser J.: Occurrence and clonal relatedness

of sec/tst positive Staphylcococcus aureus isolates of quartermilk samples of cows suffering from mastitis. Lett. Appl. Microbiol. 2004, 38, 493-498.

Adres autora: dr in¿. Pawe³ Nawrotek, ul. Chopina 51/5, 71-450 Szczecin; e-mail: pawel.nawrotek@biot.ar.szczecin.pl