Vol. 16/007, nr 3 1
polimorfizmy genów związanych z krzepnięciem krwi a udar
niedokrwienny mózgu u dzieci – pilotowe badania rodzin
polymorphisms of genes encoding coagulation factors and brain ischemic stroke
in children – pilot study of families
1
Iwona Żak,
2Ilona Kopyta,
2Ewa Emich-Widera,
1Beata Sarecka,
1Anna Balcerzyk,
1Paweł Niemiec,
2Elżbieta Marszał
1
Katedra i Zakład Biochemii i Genetyki Medycznej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach
2Klinika Neurologii Wieku Rozwojowego Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach
STRESZCZENIE
Cel pracy. Analiza związku polimorfizmów: -455G>A
fibryno-genu β (FGB), 1691G>A fibryno-genu czynnika V oraz 20210G>A fibryno-genu protrombiny z przebytym w dzieciństwie udarem niedokrwien-nym mózgu, z uwzględnieniem trwałych następstw neurolo-gicznych po przebytym udarze. Materiał i metody. Badaniami objęto 111 białych osób rasy kaukaskiej, w tym: dzieci po udarze niedokrwiennym mózgu (n=17), ich rodziców (n=33), osoby zdrowe do 20 roku życia (n=18) oraz krwiodawców w wieku 21–40 lat bez obciążeń rodzinnych chorobami sercowo-naczyniowymi w ankiecie (n=43). Wszystkie badane polimor-fizmy genotypowano przy użyciu techniki PCR-RFLP. Uzyskane wyniki analizowano za pomocą programów Statistica 6.0 oraz
EpiInfo. Wyniki. Stwierdzono istotnie wyższy poziom
choleste-rolu całkowitego oraz cholestecholeste-rolu LDL (p=0,034 i p=0,001) w całej grupie chorych w porównaniu z grupą kontrolną w wieku do 20 lat. Poziom cholesterolu LDL był wyższy wśród pacjen-tów w stanie klinicznym dość dobrym w porównaniu z młod-szą kontrolą (p=0,03). W grupach pacjentów, dzieci zdrowych i krwiodawców zaobserwowano tendencję do występowania wyższego poziomu fibrynogenu wśród nosicieli allelu A (geno-typy AA i GA) w porównaniu ze stężeniem u osób z genotypem GG. Częstość homozygot AA genu FGB była najwyższa (jednak nieznamiennie) w grupie dzieci po udarze w stanie klinicznym dość dobrym w porównaniu z grupą kontrolną do 20 roku życia (17% vs 6%). Częstość występowania heterozygot GA w grupie dzieci po udarze była niższa w porównaniu z dziećmi zdrowymi (47% vs 61%). W grupie dzieci po udarze nie stwierdzono obec-ności alleli mutacyjnych zarówno w genie czynnika V, jak i w genie protrombiny.
Słowa kluczowe: udar niedokrwienny mózgu, fibrynogen beta,
czynnik II, czynnik V, polimorfizm
ABSTRACT
Aim. Analysis of association between -455G>A polymorphism
of the FGB gene, 1691G>A polymorphism of factor V gene and 20210G>A polymorphism of prothrombin gene and brain isch-emic stroke in children, considering the stroke consequences of the patients. Material and method. The population ana-lyzed in the study consisted of 111 white Polish Caucasians, including: children with brain ischemic stroke (patients’ group, n=17), their parents (n=33), healthy subjects under 20 years old (younger controls, n=18) and blood donors aged 21-40 without family history of cardiovascular diseases in interview (n=43). All studied polymorphisms were genotyped using a PCR-RFLP method. Obtained data were analyzed using
Statis-tica 6.0 and EpiInfo softwares. Results. The significantly higher
levels of total cholesterol and LDL-cholesterol were found in the patients’ group compared to younger control group (p=0.034 and p=0.001, respectively). The LDL-cholesterol level was also higher in patients in rather good state than in the younger controls (p=0.03). In the patients’ group, younger control and blood donors groups we observed tendency to higher level of fibrinogen among subjects carrying the A allele of the FGB gene (genotypes AA and GA) in comparison with subjects carrying GG genotype. The frequency of AA homozygotes of the FGB gene was highest in the group of children with stroke in rather good clinic state (but not significantly) compared to the younger control group (17% vs 6%). The frequency of GA heterozygotes in the stroke group was lower than in the younger control group (47% vs 61%). In the patients group we did not observe the presence of mutation allele of factor V and prothrombin genes.
Key words: brain ischemic stroke, fibrinogen beta, factor II,
WSTĘp
Udar ��ed�krw�e��y mó�gu �ależy d� w�el�c�y���k�wych ch�rób �ac�y���wych, �a k�órych ujaw��e��e mają wpływ �ł�ż��e ���er-akcje p�m�ęd�y c�y���kam� śr�d�w�sk�wym� � ge�e�yc��ym�. E���l�g�a udaru ��ed�krw�e��eg� mó�gu u d��ec� jes� ��ac���e sła-b�ej p���a�a ��ż u d�r�słych, jed�ak wydaje s�ę, że c�y���k ge�e-�yc��y m�że być s�c�egól��e �s����y �e w�ględu �a s��su�k�w� mały ud��ał c�y���ków śr�d�w�sk�wych. D� waż�ych eleme��ów w pa��ge�e��e udaru mó�gu �ależą �abur�e��a hema��l�g�c��e, predysp��ujące d� �akr�ep�cy. ��ws�awa��u �akr�ep�cy spr�yja �arów�� p�dwyżs���e s�ęże��e c�y���ków kr�ep��ęc�a krw�, jak � �b��ż��e s�ęże��e ��h�b���rów wykr�ep�a��a. Wśród d��ed��c��ych �abur�e� hema��l�g�c��ych �w�ą�a�ych � udarem wym�e��a s�ę m. ��. �espół a��yf�sf�l�p�d�wy, def�cy� b�ałka �, b�ałka C, a��y-�r�mb��y III, pla�m���ge�u [1]. Na ry�yk� udaru m�gą rów��eż wpływać p�l�m�rf��my ge�ów c�y���ków kr�ep��ęc�a � f�bry��-l��y, k�óre de�erm��ują p����m �ych c�y���ków w �s�c�u.
Jed�ym � p�wyżs�ych p�l�m�rf��mów jes� subs�y�ucja G>A w p��ycj� –455 p� w pr�m���r�e ge�u ła�cucha β f�bry��ge�u (FGB�. F�bry��ge� jes� d�meryc��ym b�ałk�em składającym s�ę � �r�ech �ypów ła�cuchów p�l�pep�yd�wych: α, β � γ k�d�wa�ych pr�e� �r�y ge�y. Jeg� pr�dukcję de�erm��uje sy��e�a ła�cucha β, dla�eg� p�l�m�rf��my w �bręb�e ge�u FGB m�gą m�eć s�l�y wpływ �a k��ce��rację f�bry��ge�u w �s�c�u.
Ce��ral�ym eleme��em układu kr�ep��ęc�a jes� c�y���k V, k�óry wra� � ak�yw�ym c�y���k�em X � w �bec��śc� j��ów wap��a �w�r�y k�mpleks ak�ywujący pr��r�mb��ę. Tr�mb��a pr�wad�� �as�ęp��e d� pr�eks��ałce��a f�bry��ge�u w f�bry�ę. D��ała��e c�y���ka V kr�ep��ęc�a jes� ���s���e w wy��ku jeg� degradacj� pr�e� ak�yw�e b�ałk� C, c� spr�yja �a�r�yma��u pr�cesu wykr�e-p�a��a. Mu�acja G>A w p��ycj� 1691 w ge��e c�y���ka V ���w. mu�acja Le�de�� pr�wad�� d� �am�a�y arg����y �a glu�am��ę w jed�ym � �r�ech m�ejsc pr��e�l��yc��eg� r��s�c�ep�e��a pr�e� ak�yw�e b�ałk� C. �praw�a ��, że degradacja c�y���ka V �ach�-d�� �k�ł� 10-kr����e w�l��ej. Dla�eg� mu�acja �a leży u p�ds�aw �jaw�ska �a�ywa�eg� �p�r��śc�ą �a ak�yw�e b�ałk� C. Op�r��ść �a jes� c�ęs�ą pr�yc�y�ą �akr�ep�cy, k�órej ry�yk� �w�ęks�a s�ę �k�ł� 80-kr����e u �sób � ge���ypem h�m��yg��yc��ym AA, �a��m�as� u ��s�c�el� �ge���yp he�er��yg��yc��y� ry�yk� jes� �k�ł� 7-kr����e wyżs�e [2].
Protrombina jest prekursorem trombiny – enzymu proteoli-�yc��eg�, k�óry pr�eks��ałca f�bry��ge� w m���mery, a �as�ęp-��e p�l�mery f�bry�y. �r��r�mb��a jes� k�d�wa�a pr�e� ge� �l�kal���wa�y �a chr�m�s�m�e 1. Najc�ęśc�ej �p�sywa�ym p�l�-m�rf��mem �eg� ge�u jes� �ra��ycja G>A w p��ycj� 20210 w ��e-k�dującym reg����e 3’, k�óry �ajprawd�p�d�b��ej peł�� r�lę w regulacj� ekspresj� ge�u. Obec��ść �mu��wa�eg� allelu �w�ęks�a ry�yk� �akr�ep�cy ��emal 3-kr����e [3].
Celem ����ejs�ej pracy jes� a�al��a �w�ą�ku p�l�m�rf��mów –455G>A ge�u f�bry��ge�u β, 1691G>A ge�u c�y���ka V �ra� 20210G>A ge�u pr��r�mb��y � pr�eby�ym w d��ec��s�w�e udarem ��ed�krw�e��ym mó�gu �ra� us�ale��e ge�e�yc��ych k�relacj� � �rwałym� �as�ęps�wam� �eur�l�g�c��ym� wys�ępują-cym� p� pr�eby�ym udar�e mó�gu.
MATERIAł I METODY
�ada��am� �bję�� 111 b�ałych �sób rasy kaukask�ej, w �ym d��ec� p� d�k��a�ym udar�e ��ed�krw�e��ym mó�gu, �ch r�d��ców, �s�by �dr�we d� 20 r�ku życ�a be� kl���c��ych �bjawów
�eur�-l�g�c��ych be� �bc�ąże� r�d����ych ch�r�bam� serc�w�-�ac�y-���wym� w wyw�ad��e �ra� d�br�w�l�ych dawców krw� w w�eku 21–40 la� be� �bc�ąże� r�d����ych ch�r�bam� serc�w�-�ac�y���-wym� w a�k�ec�e.
Grupę pacjentów s�a��w�ł� s�edem�aśc��r� d��ec� �
mł�-dych d�r�słych w w�eku �d 2 d� 27 la� �9 d��ewc�ą�, 8 chł�p-ców�, k�ór�y byl� h�sp��al���wa�� w �s�rej fa��e ��ed�krw�e��a mó�gu w Kl���ce Neur�l�g�� W�eku R��w�j�weg� �UM Ka��-w�ce � �adal są �bję�e �p�eką ambula��ryj�ą. D�k��a�y udar ��ed�krw�e��y mó�gu r��p���a�� �g�d��e � �b�w�ą�ującym� kry�er�am� kl���c��ym� � p��w�erd���� bada��am� �eur��bra�u-jącym� �TK � MR�. Oce�ę �eur�l�g�c��ą s�a�u pacje��ów �grupa 1� pr�epr�wad�a�� w skal� Org�g���, �a�ywa�ej pr�e� au��ra „skalą �ę���cy śr�dk�wej mó�gu”. �kala �a p��wala �a d�k��a-��e �b�ek�yw�ej �ce�y s�a�u św�ad�m�śc�, k���ak�u sł�w�eg�, ruchów �ra� �ap�ęc�a m�ęś���weg� w �bręb�e k��c�y�y gór�ej � d�l�ej, a �akże ruchów gł�wy � gałek �c��ych. U�yska��e 100 pu�k�ów ���ac�a, �ż pacje�� jes� w peł�ym, l�g�c��ym k���ak-c�e sł�w�ym, ��e s�w�erd�a s�ę �akże def�cy�ów �eur�l�g�c��ych �p�raże��a/��ed�włady k��c�y� �ra� m�ęś�� �war�y�, a ruchy gł�wy � gałek �c��ych są praw�dł�we. M��ejs�a �d 100 l�c�ba pu�k�ów ���ac�a �a��m�as� �bec��ść def�cy�ów ruch�wych, �abur�e� św�ad�m�śc� �/lub �abur�e� m�wy. �acje��ów p�d��e-l��� �a dw�e p�dgrupy w �ależ��śc� �d c�ężk�śc� s�a�u pacje��a w �kres�e �s�rym, �d p�c�ą�ku wys�ąp�e��a �bjawów kl���c�-�ych �ra� dals�eg� pr�eb�egu ch�r�by � w�d�c�kl���c�-�ych �dległych �as�ęps�w:
– pacje�c� w c�ężk�m s�a��e �śp�ąc�ka, p�raże��e lub ��ed�-wład ��ac��eg� s��p��a, p���żej 55 pu�k�ów w skal� Org�g���; �=9; w�ek w c�as�e �s�a���ch bada� k���r�l�ych �d 8 d� 27 la�� �p�dgrupa 1a�,
– pacje�c� w s�a��e d�ść d�brym ���ed�wład śred��� lub słab� wyraż��y, be� �abur�e� św�ad�m�śc�, p�wyżej 55 pu�k-�ów w skal� Org�g���; �=6; w�ek w c�as�e �s�a���ch bada� k��-�r�l�ych �d 2 d� 17 la�� �p�dgrupa 1b�.
Dw�e pacje��k� sp�śród całej grupy ch�rych ��e m�gły być �akwal�f�k�wa�e d� żad�ej � p�dgrup �e w�ględu �a brak w�d�c��ych �as�ęps�w p�udar�wych.
Grupę r�d��ców pacje��ów s�a��w�ł� �r�yd��es�u �r�ech �dr�-wych r�d��ców w w�eku �d 28 d� 53 la�. Ma�ka jed�eg� pacje��a �marła � p�w�du �ę���aków �ę���c �erk�wych �grupa 2�.
Grupę k���r�l�ą s�a��w�ł� 61 �sób be� kl���c��ych �bjawów �eur�l�g�c��ych � be� �bc�ąże� r�d����ych ch�r�bam� serc�w�-�ac�y���wym� w wyw�ad��e w w�eku �d 7 d� 40 la� �♀ �=12, ♂ �=49� �grupa 3�. Os�by �e były rekru��wa�e sp�śród pacje��ów Kl���k� Neur�l�g�� W�eku R��w�j�weg� ŚAM Ka��w�ce �ra� d�br�w�l�ych dawców krw�. Grupę �ą p�d��el��� �a dw�e p�d-grupy w �ależ��śc� �d w�eku: 1� �s�by d� 20 r�ku życ�a, �=18, ♀ �=6, ♂ �=12 �grupa 3a�, 2� �s�by m�ęd�y 21 a 40 r�k�em życ�a, �=43, ♀ �=6, ♂ �=37 �grupa 3b�.
Ws�ys�k�e �s�by włąc���e d� bada� wyra��ły chęć uc�es�-��c�e��a �g�d��e � �asadam� e�yc��ym� � �rga���acją bada� �auk�wych, �a k�óre u�yska�� �g�dę K�m�sj� ���e�yc��ej pr�y Śląsk�m U��wersy�ec�e Medyc��ym.
Analizy biochemiczne
��ęże��a wskaź��ków g�sp�dark� l�p�d�wej: ch�les�er�lu całk�w��eg�, ch�les�er�lu HDL � �rójgl�cerydów ���ac�a�� w św�eż� p�bra�ej sur�w�cy �a p�m�cą g���wych �es�awów f�rmy A�alc� �
spek�r�f�-Vol. 17/007, nr 3 1 ��me�ru UV-VI� MINI 1240 f�rmy �ch�mad�u. ��ęże��e ch�les�er�lu
LDL �bl�c���� wg w��ru Fr�edewalda [4]. ��ęże��e f�bry��ge�u ���ac�a�� w św�eż� p�bra�ym �s�c�u �a p�m�cą g���wych �es�a-wów f�rmy b��Mér�eux � k�agul�me�ru STArt 4 f�rmy R�che.
Analizy genetyczne
I��lację DNA � l�mf�cy�ów krw� �bw�d�wej wyk��ywa�� � uży-c�em g���weg� �es�awu Mas�er�ureTM Ge��m�c DNA �ur�f�ca����
K�� �Ep�ce��re Tech��l�g�es�. ��ęże��e � c�ys��ść ���la�ów DNA m�er���� w spek�r�f���me�r�e UV-V�s m��� 1240 ��ch�mad�u� pr�y λ=260/280 �m. D� �de��yf�kacj� � ge���yp�wa��a ws�ys�-k�ch p�l�m�rf��mów �as��s�wa�� me��dę RFL� �a�g. Restriction
Fragment Length Polymorphism�, k�óra �p�era s�ę �a p�w�ele��u
wybra�eg� fragme��u ge�u �ech��ką ła�cuch�wej reakcj� p�l�me-ra�y ��CR – a�g. Polymerase Chain Reaction�, a �as�ęp��e �raw�e-��u g� specyf�c��ym e��ymem res�rykcyj�ym.
Ampl�f�kację fragme��u ge�u FGB pr�epr�wad���� pr�y użyc�u pary s�ar�erów:
5’ AAg AAT TTg ggA ATg CAA TCT CTg CTA CCT 3’ 5’ CTC CTC ATT gTC gTT gAC ACC TTg ggA C 3’ Zas��s�wa�� waru�k� wg włas�ej m�dyf�kacj�: ws�ęp�a de�a�uracja: 95o – 5 m��, 30 cykl�: de�a�uracja: 95o – 1 m��,
pr�y-łąc�a��e s�ar�erów: 65,7o – 1 m�� 30 s, wydłuża��e: 72o – 2 m��,
k��c�we wydłuża��e: 72o – 30 m�� schł�d�e��e: 4o. Produkty
reakcj� �CR � w�elk�śc� 1301 p� �raw���� e��ymem res�ryk-cyj�ym HaeIII w �empera�ur�e 37o pr�e� 16 g�d���. Traw�e��e
res�ryk�a�ą HaeIII d�s�arc�a s�ałeg� fragme��u � w�elk�śc� 343 p� ��e�ależ��e �d ge���ypu. ����s�ałe fragme��y u�yska�e p� a�al���e res�rykcyj�ej charak�ery�ują s�ę w�elk�śc�am� �kreśl�-�ym� dla da�eg� ge���ypu. Ge���yp�w� GG �dp�w�adają �r�y pr�duk�y � w�elk�śc� 575 p�, 383 p� � 343 p�, ge���yp�w� GA c��ery – 958 p�, 575 p�, 383 p� � 343 p�, ge���yp�w� AA dwa pr�duk�y � w�elk�śc� 958 p� � 343 p�.
Reakcję PCR dla genu czynnika V pr�epr�wad�a�� pr�y
użyc�u �as�ępującej pary s�ar�erów:
F5’ – GGG CTA ATA GGA CTA CTT CTA ATC -3’
R5’ – TCT CTT GAA GGA AAT GCC CCA TTA –3’
Zas��s�wa�� �as�ępujące waru�k� reakcj� �CR: ws�ęp�a de�a-�uracja: 94o– 5 m��, 30 cykl�: de�a�uracja: 95o–1 m��,
pr�yłąc�a-��e s�ar�erów: 61o– 0,5 m��, wydłuża��e: 72o–1,5 m��, k��c�we
wydłuża��e: 72o – 7 m��. �r�duk� �raw���� e��ymem
res�rykcyj-nym MnlI, u�yskując dla allelu G fragme��y � dług�śc�ach 118 � 43 p�, �a��m�as� dla allelu A -fragme�� � dług�śc� 161 p�.
W celu powielenia fragmentu genu protrombiny uży��
�as�ępującej pary s�ar�erów:
F5’ – ATA GCA CTG GGA GCA TTG AA*G C -3’
R5’ – TCT AGA AAC AGT TGC CTG GC –3’
Zas��s�wa�� �as�ępujące waru�k� reakcj� �CR: ws�ęp�a de�a-�uracja: 94o – 5 m��, 30 cykl�: de�a�uracja: 94o – 1 m��, pr�yłąc�a��e
s�ar�erów: 55o – 1 m��, wydłuża��e: 72o – 1 m��. �r�duk�y ampl�f�kacj�
�raw���� e��ymem res�rykcyj�ym HindIII, r��d��ela�� �a 8% żelu p�l�akrylam�d�wym � 5% gl�cer�lem � wybarw�a�� a���a�em srebra. �r�duk�em allelu G jes� fragme�� � dług�śc� 345 p�. W pr�ypadku allelu A u�yskuje s�ę fragme��y � dług�śc�ach 322 � 23 p�. Ws�ys�k�e reakcje ampl�f�kacj� pr�epr�wad�a�� w �erm�cykler�e grad�e���wym Tgrad�e�� 96 f�rmy ���me�ra. �r�duk�y �raw�e��a r��d��ela�� w 8% żelu p�l�akrylam�d�wym � 5% gl�cer�lem � wybarw�a�� a���a�em srebra. Żele sus���� � d�kume���wa�� pr�y użyc�u sys�emu d�ku-me��acj� żel� D�cpr��� c�re UV-V�s f�rmy V�lber L�urma�.
Analiza statystyczna
U�yska�e wy��k� a�al���wa�� �a p�m�cą pr�gramów Statistica
6.0 ��TAT�OFT; ��a��s��ca, Tulsa, OK, U�A� � EpiInfo 6 (Centers
f�r D�sease C���r�l a�d �reve����� [CDC], A�la��a, GA, U�A�. Da�e �l�śc��we �ce��a�� p�d w�ględem �g�d��śc� � r��kładem ��rmal�ym pr�y użyc�u �es�u �hap�r�-W�lksa. Dla da�ych � r��kła-d��e ��rmal�ym śrer��kła-d��e p�rów�ywa�� �es�em ANOVA, �a��m�as� pr�y braku r��kładu ��rmal�eg� s��s�wa�� �es� U Ma��a-Wh��-�eya. C�ęs��śc� allel� us�ala�� �a p�ds�aw�e c�ęs��śc� ge���ypów, �g�d��ść r��kładu � rów��wagą Hardy-We��berga �kreśl��� �a p�m�cą �es�u χ2. ��rów�a��e c�ęs��śc� ge���ypów � allel� m�ęd�y
grupam� bada�ym� wyk��a�� �es�em χ2. W pr�ypadkach, gdy
l�c�ba da�ych w grup�e była m��ejs�a ��ż 10, s��s�wa�� p�prawkę F�shera. Za �s����e s�a�ys�yc���e róż��ce pr�yjm�wa�� �e war��śc�, dla k�órych p<0,05.
��łę as�cjacj� p�s�c�egól�ych allel� � ge���ypów � d�k��a�ym udarem ��ed�krw�e��ym mó�gu lub p�udar�wym� def�cy�am� �eur�l�g�c��ym� �kreśla�� �a p�ds�aw�e war��śc� współc�y�-nika ilorazu szans (odds ratio – OR� � pr�ed��ałem uf��śc� 95% (confidence interval – CI�.
Tes� TDT �transmission disequilibrium test� wyk�r�ys�a�� d� �ce�y s��p��a pr�eka�ywa��a allel� p�l�m�rf�c��ych pr�e� r�d��ców he�er��yg��yc��ych d��ec��m � udarem ��ed�krw�e��ym mó�gu.
WYNIKI
W chw�l� wys�ąp�e��a �s�reg� ��ed�krw�e��a mó�gu w�ek pacje�-�ów wahał s�ę w gra��cach �d 14 m�es�ąca życ�a d� 15 r�ku życ�a. �ada��a k���r�l�e pr�epr�wad�a�� w waru�kach ambula��ryj�ych ��s�a���e bada��e p� upływ�e 10 m�es�ęcy d� 12 la� �d wys�ąp�e��a udaru�. Udar mó�gu u ws�ys�k�ch pacje��ów d��yc�ył pr�ed��eg� kręgu u�ac�y��e��a mó�gu �ACI �a�g. Partial Anterior
Circula-tion Infarct�. Na �bra� kl���c��y w chw�l� wys�ąp�e��a �s�reg�Na �bra� kl���c��y w chw�l� wys�ąp�e��a �s�reg� ��ed�krw�e��a mó�gu składały s�ę: ��ed�wład p�ł�w�c�y �ws�yscy pacje�c��, ��war�ys�ący �śr�dk�wy ��ed�wład �erwu VII �wa-r��weg� p� s�r���e ��ed�władu p�ł�w�c�eg� �p�ęc�u pacje��ów�, �abur�e��a św�ad�m�śc� �c��erech pacje��ów�, ból gł�wy ��r�ech pacje��ów�, �abur�e��a c�uc�a–afa�ja �jede� pacje���. W �s�rej fa��e ch�r�by �ce�a s�a�u pacje��ów ks��ał��wała s�ę w �akres�e 35–55 pu�k�ów w skal� Org�g��� �100 pu�k�ów w �ej skal� ���a-c�a peł�ą spraw��ść�. U�yska�e wy��k� bada��a TCD były �g�d�e � �bra�em kl���c��ym, �ajc�ęśc�ej s�w�erd�a�� ��epraw�dł�w�-śc� pr�emaw�ające �a �dc��k�wym �węże��em lub ��edr�ż����epraw�dł�w�-śc�ą �ac�y�, pr�ede ws�ys�k�m �ac�y� pr�ed��eg� kręgu u�ac�y��e��a. U ws�ys�k�ch pacje��ów w �s�rej fa��e ch�r�by wyk��a�� bada��a �eur��bra��we �me��dam� TK � MRI�, k�óre ujaw��ły: w TK �bec-��ść �g��ska hyp�de�syj�eg�, k�óremu �dp�w�adał �bs�ar � p�d-wyżs���ej ���e�syw��śc� syg�ałów w sekwe�cj� �E/T2 � �D �ra� �b��ż��ej ���e�syw��śc� w sekwe�cj� �E/T1 w bada��u MRI.
Wy��k� bada� k���r�l�ych wyka�ały, że s�eśc�u pacje��ów był� w s�a��e kl���c��ym d�ść d�brym � ��ed�władem śred��� lub słab� wyraż��ym, a w skal� Org�g��� u�yskal� p�wyżej 55 pu�k�ów �grupa 1b�. D��ew�ęc�u pacje��ów był� w s�a��e kl�-��c��ym c�ężk�m � wyka�ywał� def�cy� �eur�l�g�c��y a w skal� Org�g��� u�yskal� ��� p���żej 55 pu�k�ów. Dw�e pacje��k� sp�-śród całej grupy ch�rych ��e ��s�ały �akwal�f�k�wa�e d� żad�ej � p�dgrup �e w�ględu �a brak w�d�c��ych �as�ęps�w udaru.
�ada��a �eur��bra��we wyka�ały �bec��ść �m�a� p���ed�-krw�e��ych �malacyj�ych lub jam p�re�cefal�c��ych� w m�ej-scach ��epraw�dł�wych syg�ałów s�w�erd�a�ych w �s�rej fa��e
ch�r�by. Nas�ęps�wem pr�eby�eg� �s�reg� ��ed�krw�e��a mó�gu jes� def�cy� �eur�l�g�c��y wy��kający � sameg� ��ed�władu p�ł�w�c�eg�, pr�eważ��e śred��eg� s��p��a �u �r�ech pacje��ów� lub ��ed�władu p�ł�w�c�eg� pr�eważ��e śred��eg� s��p��a wra� � ��war�ys�ącym� dysfu�kcjam� �u s�edm�u pacje��ów� � charak-�er�e p�g�rs�e��a fu�kcj� ���elek�ual�ych �u p�ęc�u pacje��ów� lub padac�k� �u �r�ech pacje��ów�.
We wc�eś��ejs�ym d���es�e��u wyka�a�� [5], że u bada�ych d��ec� � d�k��a�ym udarem ��ed�krw�e��ym mó�gu współwy-s�ęp�wały róż�e c�y���k� ry�yka ch�rób �ac�y���wych mó�gu, �ajc�ęśc�ej dysl�p�dem�e, w �ym h�perch�les�er�lem�a u s�eś-c�upacje��ów, h�per�rójgl�cerydem�a u dwu pacje��ów, h�perl�-p�pr��e��em�a u c��erech pacje��ów, dysl�p�dem�a m�es�a�a u jed�eg� pacje��a, d�da�k�w� �espół a��yf�sf�l�p�d�wy u dwu pacje��ów, def�cy� b�ałka � u c��erech pacje��ów, �p�r��ść �a ak�yw�ą p�s�ać b�ałka C A�CR �a�g. Activated Protein C
Resi-stance� u dwóch pacje��ów � def�cy� b�ałka C u jed�eg� pacje��a.
��w�erd���� współwys�ęp�wa��e pr�y�ajm��ej dwóch c�y���-ków ry�yka u d��ew�ęc��rga d��ec�.
Wy��k� wskaź��ków g�sp�dark� l�p�d�wej sur�w�cy �ra� p����m f�bry��ge�u w �s�c�u pr�eds�aw���� w �abel� 1.
��w�erd���� �s����ą s�a�ys�yc���e róż��cę p�m�ęd�y grupą ch�rych �gr. 1�, a grupą k���r�l�ą d� 20 r�ku życ�a �gr. 3a� w s�ę-że��u ch�les�er�lu całk�w��eg� �ra� ch�les�er�lu LDL �p=0,034 � p=0,001�. Śred�� p����m ch�les�er�lu frakcj� LDL był wyżs�y w grup�e pacje��ów p� udar�e w d�ść d�brym s�a��e kl���c��ym w p�rów�a��u � k���r�lą w w�eku d� 20 r�ku życ�a �p=0,03�. Z�a-m�e���e wyżs�y p����m ch�les�er�lu frakcj� HDL wys�ęp�wał w grup�e r�d��ców d��ec� p� udar�e �gr. 2� ��ż w grup�e k���r�l�ej w w�eku 20–40 la� �gr. 3b� �p=0,036�.
Śred��e s�ęże��a f�bry��ge�u w �s�c�u m�eśc�ły s�ę w gra-��cach ��rmy we ws�ys�k�ch bada�ych grupach. N�e wyka�a�� ��ac�ących róż��c p�m�ęd�y grupą d��ec� ch�rych �gr. 1� a grupą krw��dawców p���żej 20 r�ku życ�a �gr. 3a�, jak rów��eż p�m�ę-d�y r�d��cam� ch�rych d��ec� �gr. 2� a krw��dawcam� p�wyżej 20 r�ku życ�a �gr. 3b�. W grupach pacje��ów, d��ec� �dr�wych � krw��dawców �a�bserw�wa�� �e�de�cję d� wys�ęp�wa��a wyż-s�eg� p����mu f�bry��ge�u wśród ��s�c�el� allelu A �ge���ypy AA � GA� w p�rów�a��u �e s�ęże��em u �sób � ge���ypem GG. Róż��ce �e ��e były jed�ak �s����e s�a�ys�yc���e.
A�al��a dys�rybucj� p�l�m�rf�c��ych war�a��ów ge�u f�bry-��ge�u β wśród bada�ych grup wyka�ała p�rów�ywal�e c�ęs��-śc� ge���ypu AA w grup�e pacje��ów � w grup�e d��ec� �dr�wych �5,9% vs 5,6%�. C�ęs��ść h�m��yg�� AA była �ajwyżs�a �jed�ak ��e��am�e���e� w grup�e d��ec� p� udar�e w s�a��e kl���c��ym d�ść d�brym w p�rów�a��u � grupą k���r�l�ą d� 20 r�ku życ�a �17% vs 6%�. L�c�ba he�er��yg�� GA była ��żs�a w grup�e d��ec� p� udar�e �ra� w grup�e r�d��ców w p�rów�a��u � d��ećm� �dr�-wym� �47% vs 45,5% vs 61%�, jed�ak róż��ce �e ��e były �s����e s�a�ys�yc���e. N�e �a�bserw�wa�� rów��eż ��am�e��ych s�a�y-s�yc���e róż��c w c�ęs��śc� allelu A p�m�ęd�y bada�ym� grupam� ��ab. 2�. A�al��a �es�em TDT wyka�ała, że s��p�e� pr�eka�ywa��a allel� p�l�m�rf�c��ych pr�e� he�er��yg��yc��ych r�d��ców d��e-c��m � udarem ��e �db�ega ��ac�ąc� �d l�s�weg�.
W grup�e d��ec� p� udar�e ��e s�w�erd���� �bec��śc� allel� mu�acyj�ych �arów�� w ge��e c�y���ka V, jak � w ge��e pr�-�r�mb��y. C�ęs��śc� �ych allel� w całej grup�e k���r�l�ej
wy��-s�ły �dp�w�ed���: 3,3% dla allelu A ge�u c�y���ka V �ra� 2,5% dla allelu A ge�u pr��r�mb��y ��ab. 3 � 4�.
DYSKUSJA
��dwyżs���y p����m f�bry��ge�u jes� c�y���k�em predysp��u-jącym �arów�� d� ch�r�by ��ed�krw�e��ej serca, jak � d� udaru mó�gu [6]. Wc�eś��ejs�e da�e wska�ują �a �w�ą�ek allelu A p�l�-m�rf��mu –455 G>A w ge��e k�dującym ła�cuch β f�bry��ge�u (FGB� � p����mem b�ałka u �sób d�r�słych [7]. W p�pulacj� w�eku r��w�j�weg� ��e s�w�erd���� �ak�ej �ależ��śc� [8]. Nas�e bada-��a wyka�ują jedy��e �e�de�cję d� wyżs�eg� s�ężebada-��a f�bry��ge�u u bada�ych, k�ór�y są ��s�c�elam� allelu A �GA+AA�. C�ęs��ść allelu A w grup�e k���r�l�ej jes� �a p�rów�ywal�ym p����m�e � ���ym� p�pulacjam� kaukask�m� [9, 10]. D��ychc�as�we bada-��a �w�ą�ku p�l�m�rf��mu –455 G>A � udarem ��ed�krw�e��ym mó�gu pr�epr�wad�a�� jedy��e w p�pulacj� d�r�słych, u k�órych wyka�a��, że allel A wpływa �a p����m f�bry��ge�u w �s�c�u � ma �w�ą�ek � ch�r�bą [11, 12].
W bada�ej pr�e� �as grup�e ch�rych ��e s�w�erd���� �bec-��śc� allel� mu�acyj�ych ge�ów c�y���ka V �ra� pr��r�mb��y. C�ęs��śc� �ych allel� w grup�e k���r�l�ej były �a��m�as� p�rów-�ywal�e � c�ęs��śc�am� charak�erys�yc��ym� dla ���ych p�pu-lacj� eur�pejsk�ch �4,4% dla ge�u c�y���ka V �ra� 1,2% dla ge�u pr��r�mb��y� [2, 3]. Wc�eś��ejs�e prace wska�ują �a s�l�y �w�ą�ek �arów�� p�l�m�rf��mu ge�u c�y���ka V, jak � ge�u pr�-�r�mb��y � ry�yk�em wys�ąp�e��a �akr�ep�cy żyl�ej [2, 3]. M��ej jed����ac��e są wy��k� d��yc�ące �w�ą�ku �ych p�l�m�rf��mów � udarem ��ed�krw�e��ym mó�gu u d�r�słych [13–16]. N�el�c��e prace d��yc�ą ud��ału c�y���ków ge�e�yc��ych w pa��ge�e��e udaru ��ed�krw�e�eg� mó�gu u d��ec�. N�wak-Gö��l � wsp. [17] badając grupę ch�rych d��ec� w w�eku �d 6 m�es�ęcy d� 16 la� s�w�erd��l�, że p�l�m�rf��my w ge�ach c�y���ka V, pr��r�mb��y �ra� reduk�a�y me�yle���e�rahydr�f�l�a��wej są c�y���kam� ry�yka sp���a��c��eg� udaru. Wy��k� �e p��w�erd���e ��s�ały u ��w�r�dków pr�e� Gü��her � wsp. �ylk� w �d��es�e��u d� p�l�-m�rf��mu c�y���ka V [18].
�ada��a �w�ą�ku p�l�m�rf��mów ge�e�yc��ych � udarem ��ed�krw�e��ym mó�gu w�eku r��w�j�weg�, pr�wad���e pr�e� �as wc�eś��ej �a �ej samej grup�e ch�rych d��ec�, wyka�ały �w�ą-�ek allelu C p�l�m�rf��mu 561A>C ge�u selek�y�y-E � udarem, a �włas�c�a � c�ężk�m s�a�em pacje��a p� udar�e � � w�d�c�-�ym� �dległym� �as�ęps�wam� [19]. Za�bserw�wal�śmy rów��eż k�relację m�ęd�y allelem ε4 ge�u APOE, a udarem �ra� c�ęs�s�e wys�ęp�wa��e allelu I p�l�m�rf��mu ��sercyj��/delecyj�eg� ge�u
ACE u d��ec� p� udar�e w s�a��e kl���c��ym c�ężk�m [20]. Wy��k�
u�yska�e w ����ejs�ej pracy, jak � w pracach wc�eś��ejs�ych wymagają jed�ak p��w�erd�e��a �a w�ęks�ej grup�e pacje��ów. Obec��e �as�e d��ała��a �m�er�ają d� �bjęc�a bada��am� ge�e-�yc��ym� d��ec� p� pr�eby�ym udar�e ��ed�krw�e��ym mó�gu � ���ych reg���ów ��lsk�. Dla�eg� �eż, m�m� r�adk�eg� wys�ęp�-wa��a �eg� sch�r�e��a w p�pulacj� w�eku r��w�j�weg�, m�żl�we będ��e ��ac�ące p�w�ęks�e��e grupy bada�ej w pr�ys�ł�śc�.
Vol. 17/007, nr 3 3
Tab. I. Wskaźniki gospodarki lipidowej w surowicy oraz poziom fibrynogenu w osoczu wśród badanych grup. Parameters of serum lipids
levels and plasma fibrinogen level among study groups
Cholesterol
całkowity
(mmol/l)
Cholesterol HDL
(mmol/l)
Cholesterol LDL
(mmol/l)
Triacyloglicerole
(mmol/l)
Fibrynogen
(mg/dl)
Pacjenci (grupa 1)
Mediana
(min.-max.)
4,53 (3,81–5,96)*
1,11 (0,67–2,05)
3,13 (1,71–4,32)*
1,10 (0,54–2,54)
(118,0–349,0)
262,0
Pacjenci w stanie ciężkim (grupa 1a)
Mediana
(min.-max.)
4,53 (3,91–5,96)
1,11 (0,67–2,05)
3,00 (1,71–4,32)
1,01 (0,54–2,54)
(153,0–349,0)
252,0
Pacjenci w stanie dość dobrym (grupa 1b)
Mediana
(min.-max.)
4,87 (4,14–5,83)
1,37 (0,85–1,55)
3,26 (2,28–4,12)*
1,14 (0,62–2,06)
(118,0–349,0)
265,0
Rodzice pacjentów (grupa 2)
Średnia ± SD
4,49 ± 1,04
1,07 ± 0,42**
2,84 ± 1,12
1,24 ± 0,68
343,5 ±74,70
Kontrola do 20 roku życia (grupa 3a)
Mediana
(min.-max.)
4,00 (2,61–6,16)
1,23 (0,59–2,59)
2,46 (1,29–3,13)
0,95 (0,40–1,69)
(165,0–370,0)
264,0
Kontrola powyżej 20 roku życia (grupa 3b)
Średnia ± SD
4,46 ± 0,96
0,87 ± 0,31
9,99 ± 0,94
1,29 ± 0,51
305,7± 97,48
* Dane znamienne statystycznie przy p<0,05 w porównaniu z grupą kontrolną do 20 roku życia ** Dane znamienne statystycznie przy p<0,05 w porównaniu z grupą kontrolną w wieku 20–40 lat
Tab. II. Częstości genotypów i alleli polimorfizmu –455G>A genu FGB wśród badanych grup Frequencies of genotypes and alleles of
–455G>A polymorphism of FGB gene among study groups
Grupa
n
GG
Genotypy
GA
AA
G
Allele
A
Pacjenci (1)
17
częstość
n
0,47
8
0,47
8
0,06
1
0,71
24
0,29
10
(1a) w stanie
ciężkim
19
n
częstość
0,44
4
0,56
5
0
0
0,72
13
0,28
5
(1b) w stanie
dość dobrym
26
częstość
n
0,50
3
0,33
2
0,17
1
0,67
8
0,33
4
Rodzice pacjentów (2)
33
n
częstość
0,51
17
0,46
15
0,03
1
0,74
49
0,26
17
Gr. kontrolna (3)
61
częstość
n
0,41
25
0,49
30
0,10
6
0,66
80
0,34
42
(3a) do 20 lat
18
częstość
n
0,33
6
0,61
11
0,06
1
0,64
23
0,36
13
(3b) 21–40 lat
43
n
częstość
0,44
19
0,44
19
0,12
5
0,66
57
0,38
29
1 Porażenie lub niedowład znacznego stopnia, śpiączka, poniżej 55 punktów w skali Orgogozo
Tab. III. Częstości genotypów i alleli polimorfizmu 20210G>A genu F II wśród badanych grup Frequencies of genotypes and alleles of
20210G>A polymorphism of F II gene among study groups
Grupa
n
GG
Genotypy
GA
AA
G
Allele
A
Pacjenci (1)
17
częstość
n
1,00
17
0
0
0
0
1,00
34
0
0
(1a) w stanie
ciężkim
19
n
częstość
1,00
9
0
0
0
0
1,00
18
0
0
(1b) w stanie
dość dobrym
26
częstość
n
1,00
6
0
0
0
0
1,00
12
0
0
Rodzice pacjentów (2)
33
n
częstość
0,97
32
0,03
1
0
0
0,99
65
0,01
1
Gr. kontrolna (3)
61
n
częstość
0,95
58
0,05
3
0
0
0,98
119
0,02
3
(3a) do 20 lat
18
częstość
n
0,94
17
0,06
1
0
0
0,97
35
0,03
1
(3b) 21–40 lat
43
n
częstość
0,95
41
0,05
2
0
0
0,98
84
0,02
2
1 Porażenie lub niedowład znacznego stopnia, śpiączka, poniżej 55 punktów w skali Orgogozo
2 Niedowład średnio lub słabo wyrażony, bez zaburzeń świadomości, powyżej 55 punktów w skali Orgogozo
Tab. IV. Częstości genotypów i alleli polimorfizmu 1691G>A genu F V wśród badanych grup Frequencies of genotypes and alleles of
1691G>A polymorphism of F V gene among study groups
Grupa
n
GG
Genotypy
GA
AA
G
Allele
A
Pacjenci (1)
17
n
częstość
1,00
17
0
0
0
0
1,00
34
0
0
(1a) w stanie
ciężkim
19
n
częstość
1,00
9
0
0
0
0
1,00
18
0
0
(1b) w stanie
dość dobrym
26
częstość
n
1,00
6
0
0
0
0
1,00
12
0
0
Rodzice pacjentów (2)
33
n
częstość
0,94
31
0,06
2
0
0
0,97
64
0,03
2
Gr. kontrolna (3)
61
n
częstość
0,93
57
0,06
4
0
0
0,97
118
0,03
4
(3a) do 20 lat
18
częstość
n
0,94
17
0,06
1
0
0
0,97
35
0,03
1
(3b) 21–40 lat
43
n
częstość
0,93
40
0,07
3
0
0
0,97
83
0,03
3
1 Porażenie lub niedowład znacznego stopnia, śpiączka, poniżej 55 punktów w skali Orgogozo
Vol. 17/007, nr 3
pIŚMIENNICTWO
[1] Hart R.G., Kanter M.C.: Hematologic disorders and ischemic stroke. A selective review. Stroke, 1990:21, 1111.
[2] Rees D.C., Cox M., Clegg J.B.: World distribution of factor V Leiden. Lancet, 1995, 346:1133.
[3] Poort S.R., Rosendaal F.R., Reitsma P.H. et al.: A common genetic variation in the 3’-untranslated region of the prothrombin gene is associated with elevated plasma prothrombin levels and an increase in venous thrombo-sis. Blood, 1996:88, 3698.
[4] Friedewald W.T., Levy R.I., Fredrickson D.S.: Estimation of the concentra-tion of low-density lipoprotein cholesterol in plasma without the use of preparative centrifuge. Clin. Chem., 1972:18, 499.
[5] Kopyta I., Emich-Widera E., Marszał E.: Brain ischemic stroke in children – case analysis with the focus on risk factors. Neurol. Dziec., 2002:11, 21.
[6] Ernst E., Resch K.L.: Fibrinogen as a cardiovascular risk factor: a meta-analysis and review of the literature. Ann. Intern. Med., 1993:118, 956.Ann. Intern. Med., 1993:118, 956. [7] Tybjaerg-Hansen A., Agerholm-Larsen B., Humphries S.E. et al.: A commonTybjaerg-Hansen A., Agerholm-Larsen B., Humphries S.E. et al.: A common
mutation (G-455--> A) in the beta-fibrinogen promoter is an independent predictor of plasma fibrinogen, but not of ischemic heart disease. A study of 9,127 individuals based on the Copenhagen City Heart Study. J. Clin. Invest., 1997:99, 3034.
[8] Shea S., Isasi C.R., Couch S. et al.: Relations of plasma fibrinogen level in children to measures of obesity, the (G-455-->A) mutation in the beta-fibrinogen promoter gene, and family history of ischemic heart disease: the Columbia University BioMarkers Study. Am. J. Epidemiol., 1999:150,Am. J. Epidemiol., 1999:150,1999:150, 737.
[9] Green F., Hamsten A., Blomback M. et al.: The role of beta-fibrinogen genotype in determining plasma fibrinogen levels in young survivors of myocardial infarction and healthy controls from Sweden. Thromb. Hae-most., 1993:70, 915.
[10] Humphries S.E., Ye S., Talmud P. et al.: European Atherosclerosis Research Study: genotype at the fibrinogen locus (G-455-A beta-gene) is associated with differences in plasma fibrinogen levels in young men and women from different regions in Europe. Evidence for gender-genotype-environ-ment interaction. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 1995:15, 96.
[11] Liu Y., Pan J., Wang S. et al.: beta-fibrinogen gene –455A/G polymor-phism and plasma fibrinogen level in Chinese stroke patients. Chin. Med. J., 2002:115, 214.
[12] Nishiuma S., Kario K., Yakushijin K. et al.: Genetic variation in the promoter region of the beta-fibrinogen gene is associated with ischemic stroke in a Japanese population. Blood. Coagul. Fibrinolysis., 1998:9, 373.
[13] Lalouschek W., Aull S., Serles W. et al.: C677T MTHFR mutation and factor V Leiden mutation in patients with TIA/minor stroke: a case-control study. Thromb. Res., 1999:93, 61.
[14] Ridker P.M., Hennekens C.H., Lindpaintner K. et al.: Mutation in the gene coding for coagulation factor V and the risk of myocardial infarc-tion, stroke, and venous thrombosis in apparently healthy men. N. Engl. J. Med., 1995:332, 912.
[15] De Stefano V., Chiusolo P., Paciaroni K. et al.: Prothrombin G20210A mutant genotype is a risk factor for cerebrovascular ischemic disease in young patients. Blood, 1998:91, 3562.
[16] McColl M.D., Chalmers E.A., Thomas A. et al.: Factor V Leiden, prothrom-bin 20210G-->A and the MTHFR C677T mutations in childhood stroke. Thromb. Haemost., 1999:81, 690.
[17] Nowak-Göttl U., Strater R., Heinecke A. et al.: Lipoprotein (a) and genetic polymorphisms of clotting factor V, prothrombin, and methylenetetrahy-drofolate reductase are risk factors of spontaneous ischemic stroke in childhood. Blood, 1999:94, 3678.Blood, 1999:94, 3678.
[18] G�nther G., Junker R., Strater R. et al.: Symptomatic ischemic stroke inG�nther G., Junker R., Strater R. et al.: Symptomatic ischemic stroke in full-term neonates: role of acquired and genetic prothrombotic risk factors. Stroke, 2000:31, 2437.
[19] Żak I., Sarecka B., Balcerzyk A. et al.: Polimorfizm Pstl 561A-C genu selek-tyny-E i udar niedokrwienny mózgu u dzieci: pilotowe badanie związków. Część I. Neurol. Dziec., 2004:13, 23.
[20] Żak I., Balcerzyk A., Sarecka B. et al.: Polimorfizm epsilon genu apolipopro-teiny E i polimorfizm insercyjno-delecyjny genu ACE a udar niedokrwienny mózgu u dzieci: pilotowe badanie związków. Neurol. Dziec., 2005:14, 15.
Adres do korespondencji:
Katedra i Zakład Biochemii i Genetyki Medycznej Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, ul. Medyków 18, 40-752 Katowice