Ziemniak Polski 2011 nr 2 1
Hodowla i genetyka
Z
Z
Z
A
A
A
S
S
S
T
T
T
O
O
O
S
S
S
O
O
O
W
W
W
A
A
A
N
N
N
II
I
E
E
E
K
K
K
R
R
R
II
I
O
O
O
K
K
K
O
O
O
N
N
N
S
S
S
E
E
E
R
R
R
W
W
W
A
A
A
C
C
C
JJ
J
II
I
D
D
D
O
O
O
P
P
P
R
R
R
Z
Z
Z
E
E
E
C
C
C
H
H
H
O
O
O
W
W
W
Y
Y
Y
W
W
W
A
A
A
N
N
N
II
I
A
A
A
Z
Z
Z
A
A
A
S
S
S
O
O
O
B
B
B
Ó
Ó
Ó
W
W
W
G
G
G
E
E
E
N
N
N
O
O
O
W
W
W
Y
Y
Y
C
C
C
H
H
H
Z
Z
Z
II
I
E
E
E
M
M
M
N
N
N
II
I
A
A
A
K
K
K
A
A
A
mgr Paulina Smyda
IHAR – PIB, Oddział w Młochowie, ul. Platanowa 19, 05-831 Młochów e-mail: p.smyda@ihar.edu.pl
Metody przechowywania zasobów genowych
W obecnych czasach obserwuje się postępu-jące zmiany w naturalnych środowiskach przyrody, prowadzące do ubożenia świata roślinnego. Zabezpieczenie bioróżnorodności dzikich i uprawnych gatunków roślin, w tym ziemniaka uprawnego Solanum tuberosum L. i jego dzikich krewnych, to ważne zadanie kolekcji zasobów genowych roślin. Na świe-cie istnieje wiele kolekcji, które zgromadziły i utrzymują dużą i różnorodną pulę genową
Solanum. W kolekcjach roślin stosuje się
różne metody przechowywania genotypów ziemniaka, jak rozmnożenia polowe lub szklarniowe, nasiona, rośliny in vitro.
Zasoby genowe ziemniaka, rośliny roz-mnażanej wegetatywnie, często są utrzymy-wane w kolekcjach polowych (Wasilewicz- -Flis i in. 2009). Jest to metoda tradycyjna, wymagająca dużych nakładów pracy. Poza tym kolekcje polowe nie są dostępne przez cały rok, a materiał kolekcyjny jest narażony na stresy biotyczne i abiotyczne w okresie wegetacyjnym oraz w czasie przechowywa-nia, które mogą prowadzić do jego utraty.
Inną powszechnie stosowaną metodą jest zabezpieczenie genotypów ziemniaka w kul-turach in vitro. W kolekcjach in vitro wpływ niekorzystnych czynników środowiskowych jest wyeliminowany, ponieważ genotypy są przechowywane w kontrolowanych warun-kach. Metoda ta pozwala na szybkie namna-żanie materiałów wolnych od patogenów. Jednak w materiale przechowywanym długo-terminowo w postaci roślin in vitro może
po-jawić się zmienność somaklonalna w obrębie genotypu (Belokurova 2010, Engelmann 2010).
Ziemniak wytwarza również nasiona, które mogą być przechowywane przez długi czas. Pula roślin otrzymanych z nasion nie jest jednorodna, dlatego metoda ta nie ma więk-szego znaczenia w zabezpieczaniu cennych pojedynczych genotypów (Engelmann 2010).
Alternatywą dla przedstawionych metod jest kriokonserwacja, technika pozwalająca na długotrwałe przechowywanie żywotnego materiału roślinnego w niskich temperatu-rach. Technika ta jest uznawana za bardzo dobrą metodę długoterminowego przecho-wywania zasobów genowych roślin rozmna-żanych wegetatywnie, do których należy ziemniak (Dhital i in. 2009, Kaczmarczyk i in. 2008). Materiał roślinny jest przechowywany
w ciekłym azocie (LN) w temperaturze -196oC. Niska temperatura powoduje
za-trzymanie wszystkich podziałów komórko-wych i procesów metabolicznych, co – teore-tycznie – pozwala przechowywać materiał roślinny nieograniczony czas (Gonzalez-Arnao 2008). Zaletą tej metody są także ni-skie koszty i niewielka powierzchnia potrzeb-na do przechowywania materiału (Mikuła, Rybczyński 2006). Problemem w stosowaniu techniki kriokonserwacji jest zróżnicowana regeneracja merystemów, czasami stosun-kowo niska, zależnie od gatunku i genotypu (Dhital i in. 2009).
Ziemniak Polski 2011 nr 2
2
Proces kriokonserwacji składa się z trzech etapów: 1. wyboru i przygotowania materiału roślinnego do zamrożenia, 2. opracowania optymalnej metody zamrażania oraz 3. pro-cesu regeneracji roślin po odmrożeniu (Dhital i in. 2009).
1. etap, przygotowanie materiału roślin-nego, obejmuje wybór najlepszego do za-mrażania elementu tkanki lub narządu rośli-ny, czyli tzw. eksplantatu, następnie ustale-nie odpowiednich warunków kultury in vitro (np. składu pożywki, intensywności światła) oraz hartowanie roślin w niskich temperatu-rach w celu zwiększenia ich odporności na stres wywołany procesem zamrażania. Ele-menty roślinne najczęściej przechowywane w ciekłym azocie to zarodki somatyczne, kalusy, protoplasty lub zawiesiny komórek.
W przypadku ziemniaka najczęściej eks-plantatem są młode merystemy wierzchoł-kowe. Komórki merystematyczne są odporne na niską temperaturę, ponieważ zawierają małą liczbę wakuoli oraz mają gęstą cytopla-zmę i dlatego nie są zbyt mocno uwodnione (Belokurova 2010).
Materiał przeznaczony do zamrożenia najczęściej pochodzi z kultur in vitro i jest wolny od patogenów. Powinien być także bardzo młody i w tej samej fazie rozwoju (Kryszczuk 2002). Większość komórek ro-ślinnych zawiera dużą ilość wody, przez co są bardzo wrażliwe na niskie temperatury. Z tego powodu materiał przeznaczony do za-mrażania powinien zostać odwodniony, aby uniknąć tworzenia się kryształków lodu, które rozrywają strukturę komórkową. Należy jed-nak pamiętać, aby zbytnio nie osuszyć mate-riału, ponieważ to również prowadzi do de-gradacji komórki (Gonzalez-Bonito i in. 2004). W celu zwiększenia przeżywalności komórek w niskiej temperaturze stosuje się ochronne związki chemiczne, zwane kriopro-tektantami. Nie jest do końca wyjaśnione, w jaki sposób chronią one komórki w procesie zamrażania (Belokurova 2009). Do najczę-ściej wykorzystywanych krioprotektantów można zaliczyć związki przenikające przez błonę komórkową: dimetylosulfotlenek (DMSO), glicerol i glikol propylenowy oraz związki nieprzenikające, takie jak glikol polie-tylenowy i cukry (Kryszczuk 2002).
2. etap to dobór odpowiedniej metody zamrażania. Klasyczne techniki
kriokonser-wacji opierają się na dwuetapowym, powol-nym zamrażaniu tkanki roślinnej. Materiał roślinny traktowany jest niskim stężeniem krioprotektantów, następnie powoli oziębiany i na koniec bezpośrednio zamrażany w cie-kłym azocie. W czasie powolnego oziębiania w roztworze pozakomórkowym tworzy się lód, a woda znajdująca się w komórkach wypływa na zewnątrz, co prowadzi do ich odwodnienia. Zapobiega to tworzeniu się kryształków lodu wewnątrz komórek. Ta me-toda sprawdza się w przypadku jednolitych, małych struktur komórkowych, takich jak kalusy czy zawiesiny komórkowe (Gonzalez--Bonito i in. 2004). Trudniej jest, gdy mamy do czynienia ze złożonymi strukturami, takimi jak merystemy wierzchołkowe.
Znanych jest kilka przykładów udanego wykorzystania tej techniki w kriokonserwacji merystemów wierzchołkowych ziemniaka (Gonzalez-Arnao i in. 2008). Pierwszą udaną próbę metodą dwuetapową przeprowadził Towill (1981), jednak procent regenerujących się roślin z odmrożonych merystemów był ni-ski. Kriokonserwacja dwuetapowa, ze wzglę-du na słabą regenerację roślin i wzglę-duże koszty związane ze specjalistycznym sprzętem, coraz częściej jest zastępowana nowymi metodami kriokonserwacji.
Wśród nowych, jednoetapowych, technik kriokonserwacji wyróżnia się dwie główne: witryfikację i zamrażanie kapsułkowanych eksplantatów. Witryfikacja to zeszklenie uwodnionej tkanki z ominięciem procesu krystalizacji (Mikuła, Rybczyński 2006). W procesie witryfikacji materiał roślinny jest inkubowany w roztworze krioprotektantów, a następnie szybko zanurzany w ciekłym azo-cie, co zabezpiecza przed powstawaniem kryształków niszczących tkankę.
Zamrażanie kapsułkowanych eksplanta-tów natomiast jest oparte na technologii pro-dukcji sztucznych nasion. Materiał roślinny przed zamrożeniem jest zamykany w spe-cjalnych kapsułkach, chroniących eksplantat przed mechanicznym uszkodzeniem. W celu zwiększenia przeżywalności
zamrażanych elementów
roślin opracowano kilka mo-dyfikacji tych metod, np. kap-sułkowanie eksplantatów połączone z ich odwodnie-niem czy kapsułkowanie
po-Ziemniak Polski 2011 nr 2 3
łączone z witryfikacją. Większość zmodyfi-kowanych metod kriokonserwacji wypróbo-wano do przechowywania merystemów wierzchołkowych ziemniaka (Kryszczuk 2006). Nie można jednoznacznie wybrać najlepszej metody kriokonserwacji meryste-mów ziemniaka, ponieważ efektywność każ-dej z metod zależna jest od wielu czynników, w tym od genotypu. Aby zwiększyć przeży-walność i stopień regeneracji zamrażanych merystemów, potrzebna jest optymalizacja każdej wybranej metody dla każdego geno-typu.
3. etap to sprawdzenie zdolności zamro-żonych eksplantatów do regeneracji. Efek-tywność regeneracji na tym etapie określa poprawność zastosowanej procedury. Eks-plantaty najczęściej rozmraża się w tempera-turze pokojowej lub w ciepłej wodzie (35- -40oC). Rozmrażanie powinno być szybkie, aby uniknąć procesu rekrystalizacji, czyli ponownego tworzenia się kryształków lodu. Rozmrożone eksplantaty przekłada się na pożywkę regeneracyjną (Gonzalez-Benito i in. 2004).
Zastosowanie kriokonserwacji
w kolekcji ziemniaka IHAR w Młochowie Są ośrodki naukowe na świecie, które wyko-rzystują technikę kriokonserwacji do długo-terminowego przechowywania materiału ro-ślinnego. Metoda ta jest rutynowo stosowana np. w Instytucie Hodowli Roślin (FAL) w Brunszwiku lub w Instytucie Genetyki i Ho-dowli Roślin (IPK) w Gatersleben w Niem-czech.
W oddziale IHAR w Młochowie kolekcja ziemniaka diploidalnego istnieje od ponad 30 lat. Jest to mała kolekcja, zabezpieczająca głównie genotypy wytworzone w Młochowie w procesie hodowli rekombinacyjnej, ale tak-że genotypy zagraniczne. Przez wiele lat utrzymywana była jedynie w rozmnożeniach bulwowych. W latach 80. ubiegłego wieku wprowadzono technikę in vitro, przede wszystkim do zabezpieczania wybranych, najcenniejszych genotypów, a od 2005 roku stosuje się metody kriokonserwacji (Krysz-czuk 2006). Początkowo zamrażanymi ele-mentami roślinnymi były merystemy wierz-chołkowe ziemniaka (rys. 1), a w roku 2006 rozpoczęto zamrażanie pyłku (rys. 2). Prace
te zainicjował Artur Kryszczuk, kontynuowali Tomasz Komoń i Konrad Dębski, a obecnie prowadzi je Paulina Smyda.
Rys. 1. Merystemy wierzchołkowe ziemniaka przygotowywane do zamrożenia (fot. K. Dębski) Rys. 2. Pyłek ziemniaka za-mrażany w cie-kłym azocie (fot. A. Hara) W Młocho-wie idea sto-sowania kriokonserwacji merystemów jest taka, by genotypy zabezpieczane w kolekcji
in vitro stopniowo wprowadzać do
długotrwa-łego przechowywania w ciekłym azocie, z jednej strony zmniejszając prace w in vitro, z drugiej – tworząc kopie najcenniejszych, nie-powtarzalnych genotypów. Merystemy wierz-chołkowe jednego z cennych genotypów ziemniaka diploidalnego, DG 92-227, są przechowywane w depozycie patentowym w Niemczech. W Młochowie merystemy ziem-niaka są zamrażane metodą witryfikacji. Jako krioprotektantów używa się roztworów glice-rolu, DMSO i glikolu etylenowego. Średnio zamrażanych jest 60 merystemów wierzchoł-kowych z genotypu. Równocześnie
spraw-Ziemniak Polski 2011 nr 2
4
dzana jest żywotność i zdolność do regene-racji zamrożonych merystemów. Merystemy rozmrażane są w ciepłej wodzie (ok. 35oC),
płukane w roztworze bogatym w sacharozę i przekładane na pożywkę regeneracyjną z hormonami.
Efektywność regeneracji jest zróżnicowa-na i zależzróżnicowa-na od klonu. W latach 2005-2010 żywotność regenerowanych merystemów wynosiła średnio od 10 do 70%, zależnie od genotypu. Klony, u których stwierdzono niską regenerację merystemów, wymagają dopra-cowania procedury zamrażania.
Do długotrwałego przechowywania wpro-wadzany jest pyłek form rodzicielskich wy-różniających się wysoką efektywnością zapy-leń w prowadzonych programach krzyżowań, jako sposób zabezpieczenia tego genotypu. Pyłek zamraża się poprzez bezpośrednie zanurzenie w ciekłym azocie kriofiolki z su-chym pyłkiem. Pyłki przechowywane w cie-kłym azocie były wykorzystywane po odmro-żeniu w programach krzyżowań, wykazywały żywotność i wysoką efektywność zapyleń. Dotychczas w IHAR w Młochowie w latach 2005-2010 w ciekłym azocie zamrożono 51 genotypów ziemniaka w postaci merystemów wierzchołkowych oraz pyłek 77 genotypów.
Technika kriokonserwacji jest metodą co-raz chętniej wykorzystywaną w bankach ge-nów zasobów roślinnych, pozwalającą na długotrwałe i bezpieczne zachowanie cen-nych genotypów roślin. Wciąż trwają badania nad ulepszaniem tej metody. Metoda krio-konserwacji ma dużą szansę, by w niedale-kiej przyszłości była rutynowo wykorzysty-wana w dużych bankach genów.
Literatura
1. Belokurova V. B. 2010. Methods of Biotechnology in System of Efforts Aimed at Plant Biodiversity
Preservation (Review). – Cytol. Genet. 44: 174-185; 2. Dhi-tal S. P., Manandhar H. K., Lim H. T. 2009. Preservation of In Vitro Grown Shoot of Potato (Sola-num tuberosum L.) by Different Methods of Cryopres-ervation. – Nepal J. Sci. Tech 10: 15-20; 3. Engel-mann F. 2010. Use of biotechnologies for the conser-vation of plant biodiversity. – In vitro Cell. Dev. Biol.- Plant DOI: 10.1007/s11627-010-9327-2 Published online: 03 November 2010;4.Gonzalez-Arnao M. T., Panta A., Roca W. M., Escobar R. H., Engelmann F. 2008. Development and large scale application of cry-opreservation techniques for shoot and somatic em-bryo cultures of tropical crops. – Plant Cell Tiss Organ Cult. 92: 1-13; 5. Gonzalez-Benito M. E., Clavero-Ramirez I., Lopez-Aranda J. M. 2004. Review. The use of cryopreservation for germplasm conservation of vegetatively propagated crops. – Span. J. Agric. Res. 2(3): 341-351; 6. Kaczmarczyk A., Shvachko N., Lupysheva Y., Hajirezaei M. R., Keller E. R. J. 2008. Influence of alternating temperature preculture on cry-opreservation results for potato shoot tips. – Plant Cell Rep. 27: 1551-1558; 7. Kryszczuk A. 2002.
Kriokon-serwacja – nowoczesna metoda długotrwałego
prze-chowywania materiału roślinnego. – Biul. IHAR 223/224: 57- -65; 8. Kryszczuk A., Keller J., Grübe M., Zimnoch- -Guzowska E. 2006. Cryo-preservation of potato (Solanum tuberosum L.) shoot tips using vitrification and droplet method. – J. Food, Agric. Env. 4(2): 196-200; 9. Mikuła A., Rybczyński J. 2006. Krioprezerwacja narzędziem długoterminowe-go przechowywania komórek, tkanek i organów po-chodzących z kultur in vitro. – Biotechnologia 4 (75): 145-163; 10. Towill L. E. 1981. Survival at low tem-peratures of shoot tips from cultivars of Solanum
tu-berosum group tutu-berosum. – Cryo-Letters 2: 373-382;
11. Wasilewicz-Flis I., Strzelczyk--Żyta D., Hara A., Dębski K., Jakuczun H. 2009. Metody przechowywa-nia materiałów kolekcyjnych ziemprzechowywa-niaka w IHAR Mło-chów. [W:] Nauka dla hodowli roślin uprawnych. Stresz-czenia. Konf. nauk. Zakopane, 2-6. 02.2009. IHAR Zakł. Rośl. Zboż. Kraków:240
