Małgorzata Grembecka, Magdalena Bola, Elżbieta Jasińska, Piotr Szefer
OPTYMALIZACJA WARUNKÓW
CHROMATOGRAFICZNEGO OZNACZANIA CHOLINY I BETAINY W SUPLEMENTACH DIETY I PRODUKTACH
DLA OSÓB AKTYWNYCH FIZYCZNIE Katedra i Zakład Bromatologii
Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego Kierownik: prof. dr hab. P. Szefer
Dokonano optymalizacji warunków oznaczania choliny i betainy w wybra-nych suplementach diety i produktach dla osób aktywwybra-nych fi zycznie z wyko-rzystaniem wysokosprawnej chromatografi i cieczowej w układzie faz odwró-conych.
Hasła kluczowe: cholina, betaina, HPLC-Corona, suplementy diety. Key words: choline, betaine, HPLC-Corona, diet supplements.
Cholina (β-hydroksyetylotrimetyloamina) i betaina (N,N,N-trimetyloglicyna) są składnikami niezbędnym do prawidłowego przebiegu wielu ważnych procesów metabolicznych w organizmie człowieka (1, 2). Cholina i jej metabolity (w tym betaina) odgrywają kluczową rolę w: zapewnieniu integralności błon komórko-wych (fosfolipidy), metylacji homocysteiny (betaina), neuroprzekaźnictwie chonergicznym (acetylocholina), a także sygnalizacji komórkowej i metabolizmie li-pidów (3–6). Natomiast betaina oprócz pełnienia funkcji donora grup metylowych w wielu przemianach biochemicznych, działa hepatoprotekcyjnie, chroni komórki przed stresem oksydacyjnym oraz wpływa na regenerację organizmu w przypadku niektórych chorób np. homocysteinemii (7).
Głównym ich źródłem jest pożywienie, zarówno pochodzenia roślinnego i zwie-rzęcego, ale są one również składnikami preparatów dla sportowców, produktów wspomagających odchudzanie, a także suplementów diety. Tak duża dostępność tych związków stwarza realne zagrożenie przekroczenia maksymalnych tolerowa-nych dzientolerowa-nych dawek, zwłaszcza u osób zażywających suplementy diety.
Celem badań było opracowanie i optymalizacja metody oznaczania choliny i be-tainy w suplementach diety i produktach dla osób aktywnych fi zycznie z wykorzy-staniem wysokosprawnej chromatografi i cieczowej sprzężonej z detektorem Corona CADTM.
MATERIAŁ I METODY
Materiał badawczy stanowiło 7 suplementów diety ogólnie dostępnych w sprze-daży (Hepatil, Hepaslimin, Proliver, Hepacholina, na wątrobę forte, Hepanar, TMG) oraz 2 preparaty dla sportowców (Condense, Fat Transporter).
Badane produkty poddano homogenizacji, która polegała na dokładnym roz-tarciu w moździerzu wcześniej zważonych tabletek, kapsułek (bez otoczek) bądź proszku. Z każdego suplementu diety pobierano po trzy 1 g odważki, które prze-niesiono ilościowo do kolb stożkowych za pomocą 50 cm3 wody dejonizowanej MilliQ. Kolby wraz zawartością wstawiano do łaźni ultradźwiękowej na okres 60 min (moc: 300 W, częstotliwość drgań ultradźwiękowych: 40 kHz). Po upły-wie tego czasu roztwory sączono przez sączki bibułowe MN6151/4 (Ø 110 mm), a następnie przez sączki CHROMAFIL® Xtra 0,45 μm (RC Membrane). Goto-we ekstrakty były przechowywane w zamkniętych pojemnikach plastikowych w temp. 4°C.
Optymalne rozdzielenie chromatografi czne choliny i betainy uzyskano z zasto-sowaniem kolumny Atlantis HILIC Silica 2,5 μm (4,6 × 150 mm) dla przebiegu izokratycznego fazy ruchomej o składzie woda/metanol 25/75 v/v w temp. 25°C. Zastosowana metodyka została poddana walidacji metodą dodawania wzorca.
WYNIKI I ICH OMÓWIENIE
Na podstawie dostępnych źródeł literaturowych, jak również uwzględniając charakter analizowanych związków (polarność), najpierw dobrano odpowied-nią kolumnę chromatografi czną, tj. Atlantis silica HILIC 100Å, 150 × 4,6 mm, 2,5 μm. Następnie przystąpiono do optymalizacji warunków chromatografi czne-go oznaczania, czyli dokonano m.in. wyboru optymalnej fazy ruchomej. Wstęp-nie pod uwagę wzięto takie układy faz jak woda/acetonitryl oraz woda/metanol w przebiegu izokratycznym, jak również gradientowym, z dodatkiem lub bez 0,1% kwasu trifl uorooctowego (TFA). Jednocześnie, określono wpływ tempera-tury i prędkości przepływu fazy ruchomej na przebieg analizy. Stwierdzono, że najlepsze wyniki uzyskano przy temp. 25°C i prędkości przepływu 0,7 cm3/min dla fazy ruchomej, o składzie woda/metanol 25/75 v/v. Ponadto wykazano, że przebieg izokratyczny umożliwił uzyskanie optymalnego rozdzielenia nie tylko choliny i betainy, ale również β-alaniny i tauryny (ryc. 1). Przed przystąpieniem do analizy potwierdzono liniowość metody w oparciu o 12 krzywych kalibracyj-nych, a uzyskane wysokie współczynniki korelacji (0,9990–0,9995) wskazywały, że opracowana metoda jest metodą liniową w zakresie stężeń od 0,25 μg/cm3 do 75,0 μg/cm3. Dokładność i precyzję zweryfi kowano metodą dodawania wzorca, poprzez wzbogacenie próbki suplementu wzrastającą ilością choliny i betainy. Odzysk mieścił się w granicach od 99,3 do 109%, a precyzja od 0,41 do 3,51%. Granica wykrywalności (LOD) i oznaczalności (LOQ) dla choliny wynosiła 0,16 μg/cm3 i 0,47 μg/cm3, podczas gdy dla betainy 0,11 μg/ cm3 oraz 0,33 μg/cm3, odpowiednio.
Ryc. 1. Chromatogram próbki roztworu wzorcowego zawierającego cholinę, betainę, taurynę i β-alaninę o stężeniu 25 μg/cm3 (0,7 cm3/min, 25%H
2O/75%MetOH).
Fig. 1. Chromatogram of the standard sample solution containing choline, betaine, taurine and β-alanine at 25 μg/cm3 (0.7 cm3 /min, 25% H
2O/75% MetOH).
Betaina została oznaczona jedynie w 2 preparatach (Condense i TMG), co było zgodne z deklaracją producentów. Średnia oznaczona zawartość tego związku wy-nosiła od 3,76 g/saszetkę preparatu Condense do 451 mg/kapsułkę TMG, co sta-nowiło od 90,2 do 100% wartości deklarowanej. Natomiast w przypadku choliny większość analizowanych suplementów (Hepatil, Hepaslimin, Proliver, Na wątrobę forte, Hepanar) odznaczała się wartościami znacznie przewyższającymi deklarację producenta. Jednakże mogło to być spowodowane koelucją w czasie retencji choliny innych substancji obecnych w analizowanych próbkach, tj. L-asparaginianu-L-orni-tyny oraz innych związków pochodzących z wyciągów z ziela karczocha i zielonej herbaty. W ten sposób, została potwierdzona selektywność metody względem in-nych składników obecin-nych zarówno w suplemencie Hepacholina jak i w preparacie wspomagającym odchudzanie Fat transporter tj. inozytolu, winianu L-karnityny, L-metioniny i witamin z grupy B wymienionych przez producenta na opakowaniu. Średnia zawartość choliny w preparacie Hepacholina oraz Fat transporter wynosi-ła odpowiednio 71,4 mg oraz 422 mg/tabletkę. Jednocześnie wykazano obecność choliny w preparacie Condense (2442±73,0 mg/saszetka), który według deklaracji producenta nie powinien zawierać tego związku.
Zalecane dzienne spożycie choliny (AI) dla kobiet wynosi 425 mg/osobę/dzień, podczas gdy dla mężczyzn 550 mg/osobę/dzień. Maksymalną tolerowaną dzienną dawkę (UL) dla osoby dorosłej określono na poziomie 3,5 g (2). Biorąc pod uwagę zalecenia producenta, co do dawkowania (2–3 tabletek dziennie dla Hepacholiny i 2 tabletki 2 razy dziennie dla preparatu Fat transporter) suplement Hepacholina
dostarcza 50,4% zalecanego dziennego spożycia dla choliny (AI), zaś dla mężczyzn 38,9%, co stanowi 6,11% maksymalnej dziennej dawki tolerowanej. Natomiast dla preparatu Fat Transporter wartość procentowa AI wynosi 397% dla kobiet, zaś dla mężczyzn 307%, co stanowi 48,2% UL. W przypadku preparatu Condense spożycie nawet tylko jednej saszetki powoduje przekroczenie zalecanej dziennej dawki (AI) dla choliny o 474% dla kobiet i 344% dla mężczyzn.
Dzienne zapotrzebowanie na betainę dla dorosłego, zdrowego człowieka wyno-si od 100 do 300 mg na dobę (8). Spożycie zarówno preparatu TMG (2 kapsułki dziennie), jak również produktu dla osób aktywnych fi zycznie – Condense, do-starcza znaczne ilości betainy, co stanowi odpowiednio 333% oraz 1250% normy. Równocześnie należy uwzględnić fakt, że na opakowaniu tego drugiego preparatu brakuje informacji o częstości spożycia. Jedynie w przypadku hiperhomocysteine-mii zalecana jest większa dawka betainy wynosząca 6 g.
Podsumowanie
Chromatografi a odziaływań hydrofi lowych (HILIC) jest skutecznym narzędziem, które pozwala na dokładne i precyzyjne oznaczenie zawartości choliny oraz betainy. Jednocześnie wykazano, że opracowana metoda jest nieselektywna względem nie-których substancji tj. L-asparaginianu-L-ornityny, obecnych w suplementach diety. Z tego też względu konieczne jest kontynuowanie prac nad optymalizacją opra-cowanej metody, skupiając się w szczególności nad zwiększeniem selektywności etapu ekstrakcji. Ponadto, wskazane jest monitorowanie suplementów diety pod kątem zawartości betainy i choliny ze względu na realne zagrożenie przekroczenia maksymalnych tolerowanych dziennych dawek, zwłaszcza u osób zażywających tego typu produkty.
M. G r e m b e c k a, M. B o l a, E. J a s i ń s k a, P. S z e f e r
SELECTION OF CHROMATOGRAPHIC CONDITIONS OF CHOLINE AND BETAINE ANALYSIS IN DIET SUPPLEMENTS AND PRODUCTS FOR PHYSICALLY ACTIVE PEOPLE
S u m m a r y
Introduction. Choline and betaine are food components necessary for the proper functioning of
many metabolic processes in the human body.
Aim. The aim of the present work was the optimization and development of HPLC coupled with
Corona CADTM method for the determination of choline and betaine analysis in diet supplements and products for physically active people.
Material and methods. The fi nal chromatographic analyses were performed on an Atlantis HILIC
Silica 2.5 μm (4.6 × 150 mm) in an isocratic elution, methanol/water 75/25 v/v, at a fl ow rate of 0.7 cm3/min at the temperature of 25°C. There was performed validation of the applied methodology, and the obtained data were highly satisfactory, since the recovery varied between 99.3 and 109%, and the precision between 0.41 and 3.51%.
Results. The developed method for the determination of choline and betaine in food products
us-ing high-performance liquid chromatography coupled with the Corona CADTM detector characterized with linearity, high precision and accuracy. The analysed products characterised with varied levels of betaine and choline. However, betaine was determined in only two products, which was in agreement with the manufacturers’ declaration.
Conclusions. Hydrophilic interaction chromatography (HILIC) is an effective tool that allows precise
PIŚMIENNICTWO
1. Biswas S., Giri S.: Importance of choline as essential nutrient and its role in prevention of various toxicities. Prague Med. Rep., 2015; 116(1): 5-15. – 2. Food and Nutrition Board, Institute of Medicine (US).: Dietary reference intakes: thiamin, ribofl avin, niacin, vitamin B-6, vitamin B-12, pantothenic acid, biotin, and choline. National Academy of Sciences. National Academic Press, Washington DC 1998; 390-422. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK114308/); Data dostępu: 17.03.2018 r. – 3. Hol-lenbeck C.B.: The importance of being choline. J. Am. Diet. Assoc., 2010; 110: 1162-1165. – 4. Sanders L.M., Zeisel S.H.: Choline: dietary requirements and role in brain development. Nutrition Today, 2007; 42: 181-186. – 5. Zeisel S.H.: Gene response elements, genetic polymorphisms and epigenetics infl uence the human dietary requirement for choline. IUBMB Life, 2007; 59: 380-387. – 6. Zeisel S.H., Da Costa K.A.: Choline: an essential nutrient for public health. Nutrition Reviews, 2009; 67: 615-623. – 7. Craig S.A.S.: Betaine in human nutrition. Am. J. Clin. Nutr., 2004: 80: 539-549. – 8. Ueland P.M.: Choline and betaine in health and disease. J. Inherit. Metab. Dis. 2010; 34: 3-15.
