Hanna Kruczkowska, Helena Pawłowska, Barbara Skucińska
Akademia Rolnicza w Krakowie, Katedra Hodowli Roślin i Nasiennictwa
Haploidyzacja rzepaku:
badania podstawowe i zastosowania
Haploid plant production of oilseed rape: basic aspects and applications
Androgenetyczne dihaploidy rzepaku są już wykorzystywane w hodowli krzyżówkowej i mieszańcowej. Prace genetyczne i induko-wanie mutacji przy użyciu haploidów mogą przyczynić się do dalszego postępu w hodowli tego gatunku. Wyjaśnienie mechanizmu działa-nia stresów prowadzących do zmiany drogi roz-wojowej mikrospory pozwoli na zwiększenie wydajności haploidyzacji i ograniczenie jej zmienności.
Androgenetic dihaploids of oilseed rape already find their application in cross- and hybrid breeding. Genetic research and induction of mutation with the help of haploids may contribute to further progress in the breeding of this species. Understanding the mechanics of the stresses which lead to the change of microspore developmental pathway will make it possible to increase the efficiency of haploidy and to limit its variability.
Wstęp
Indukcja androgenetycznych dihaploidów rzepaku osiągnięta najpierw przez wykładanie niedojrzałych pylników na pożywkę in vitro (Keller, Armstrong 1978), a następnie przez pobudzanie do embriogenezy zawiesiny mikrospor (Lichter 1982) stosunkowo szybko została wprowadzona do programów hodowlanych. U wielu innych gatunków, dla których również opracowano sposób indukowania androgenezy, przedział czasu między badaniami a praktycznym zastosowaniem był dłuższy lub w ogóle metoda haploidyzacji nie została wykorzystana przez hodowców. Szybkie zastosowanie linii DH w hodowli rzepaku miało kilka przyczyn, głównie jednak wynikało ze znacznego wzrostu zainteresowania rzepa-kiem po wprowadzeniu odmian podwójnie ulepszonych, a następnie z potrzeby dalszego postępu hodowlanego dzięki kreowaniu odmian mieszańcowych. W hodowli in vitro ulepszone metody indukcji mikrospor do podziałów (Keller, Armstrong 1983; Chuong, Beversdorf 1985) okazały się dostatecznie wydajne dla dawców rosnących zarówno w fitotronie, jak i w szklarni czy w polu, a mani-pulowanie mikrosporami chronionymi grubą warstwą egzyny było łatwiejsze niż u innych gatunków, np. zbóż. W Polsce pierwsze wydajne kultury mikrospor rzepaku uzyskano w 1992 roku w Katedrze Hodowli i Nasiennictwa AR w
Krako-wie stosując metodę opracowaną w Kanadzie (Coventry i in. 1988). Po zbadaniu kilku odmian (tab. 1) okazało się, że mimo mniejszej skłonności do embriogenezy in vitro form ozimych w porównaniu z jarymi (badania metodyczne prowadzono głównie na rzepaku jarym), wśród polskich odmian rzepaku ozimego znaleziono dawców o dobrej wydajności androgenezy jak odmiana Mar (Kruczkowska i in. 1994).
Tabela 1 Wydajność embriogenezy w polskich odmianach i liniach DH pochodzących z odmiany Mar — The frequency of embryo production in Polish cultivars and DH lines developed from cv. Mar
Liczba zarodków — No. of embryos
Dawca — Donor na 105 mikrospor per 105 microspores z 1 pylnika per anther Bolko 13 2 Polo 97 15 Mar Linie DH — DH lines
— silnie embriogeniczne — highly embryogenic — słabo embriogeniczne — weakly embryogenic
167
powyżej 400 — more than 400 do 30 — not more than 30
25 60 4
Badania podstawowe
Mechanizm skierowujący mikrosporę lub niedojrzały pyłek z drogi rozwoju gametofitycznego na sporofityczny nadal pozostaje nie wyjaśniony. Wiadomo, że dla indukcji androgenezy potrzebne są dwa czynniki stresowe: stres wysokiej temperatury, co najmniej przez 6–8 godzin, i stres osmotyczny pożywki o podwyż-szonej zawartości cukru. Nie wiadomo jednak, dlaczego tylko część mikrospor znajdujących się w pylniku reaguje na warunki stresowe i przekształca się w zarod-ki, i dlaczego tylko część tych zarodków ma zdolność pełnej konwersji w kwitnące i wydające nasiona rośliny. Na kilkanaście tysięcy mikrospor znajdujących się w pylniku przeciętnie ok. 40% podejmuje podziały, 5–10% tworzy dojrzałe zarodki (Custers i in. 1994), z których 50–70% ulega konwersji (Foisset i in. 1997; Cegielska-Taras, Szała 1997).
Zgodnie z badaniami Hause, Hause (1996) w warunkach in vitro są możliwe 2 ścieżki rozwoju. Jeśli indukcja nastąpi w fazie mikrospory, zaburzenia mikro-tubularnego cytoszkieletu powstałe pod wpływem stresu prowadzą do symetrycz-nego podziału jądra. Jeśli indukcja ma miejsce w pyłku dwujądrowym, tuż po mitozie, stres powoduje powrót komórki wegetatywnej do cyklu komórkowego i również jej podział symetryczny. Jądra pochodzące z symetrycznego podziału mogą ulec fuzji dając początek zarodkowi o podwojonej liczbie chromosomów.
Opisano również inną możliwość fuzji: jąder lub komórek wegetatywnej i genera-tywnej (Cebrat i in. 1994b). Różnicowanie się zarodka musi nastąpić w obrębie ściany pyłku; jeśli ściana pęknie wcześniej, tworzy się haploidalny kalus zamiast zarodka. Według Nitta i in. (1997) gruba ściana pyłku może również powstrzymać zarodek przed wydostaniem się i dalszym rozwojem. Te przyczyny oraz wzajemny wpływ rozwijających się mikrospor, o czym świadczą doświadczenia z gęstością zawiesiny i kondycjonowaniem pożywek, mogą ograniczać liczbę powstałych zarodków w stosunku do mikrospor, które podjęły podziały.
Stymulowanie androgenezy jest możliwe przez zastosowanie niskich dawek mutagenów na początku kultury mikrospor. Najczęściej zalecana jest kolchicyna, która, podobnie jak podwyższona temperatura, powoduje zaburzenia mikro-tubularnego szkieletu (Zaki, Dickinson 1995). Stymulację androgenezy przez mutageny fizyczne (promienie UV i gamma, prędkie neutrony) oraz kolchicynę i MNH (N-nitrozo-N-metylomocznik) wykazano również w materiałach polskich (tab. 2). Stwierdzono przy tym współdziałanie stymulacji z genotypem (tab. 3) i gęstością zawiesiny mikrospor (rys. 1). Ze wzrostem dawek mutagenów wzrasta liczba zarodków źle wykształconych (Jędrzejaszek i in. 1994; Kruczkowska, Pawłowska 1997).
Tabela 2 Stymulacja embriogenezy pod wpływem różnych mutagenów
Stimulation of embryogenesis under the influence of various mutagens
Stymulacja [% kontroli]
Stimulation [per cent of control]
Mutagen
Dawki stymulujące
Stimulating
doses średnio — mean maksimum
Zarodki nienormalne [%] Abnormal embryos Promienie γ 10–30 Gy 128 450 Nf 1–5 Gy 350 800 0–100 MNH 0,1–0,5 mM 168 351 33–65 Kolchicyna 50 mg/L 142 162 16–62 UV 10–30 s 180 207 37–57 Tabela 3 Wpływ kolchicyny na embriogenezę (liczba zarodków na 105 mikrospor)
The effect of colchicine on embryogenesis (embryos/105 microspores)
Genotyp
Genotype
Kontrola
Control
Kolchicyna — Colchicine 50 mg/L [% kontroli] — [per cent of control]
Mar 214 163
Linia DH F 399 39
Linia DH W 283 178
Rys. 1. Zależność między gęstością zawiesiny mikrospor a reakcją na kolchicynę (linia DH F)
Relation between microspore density and reaction to colchicine (DH line F)
Rozwój zarodków w pożywce nie jest synchroniczny. Za gotowe do kon-wersji uważa się dobrze wykształcone zarodki w stadium liścieniowym, które osiągnęły wielkość co najmniej 2 mm i są dojrzałe fizjologicznie do regeneracji. Krótki okres dojrzewania (kilka dni) jest porównywalny z okresem spoczynku zarodków zygotycznych (Iwanowska i in. 1997). Konwersji sprzyja podsuszenie zarodków i wzrost w niskiej temperaturze (Coventry i in. 1988). Podwajanie liczby chromosomów, o ile nie nastąpiło spontanicznie przez fuzję jąder, dokonuje się za pomocą kolchicyny zastosowanej we wczesnym okresie kultury in vitro (Zhao i in. 1996) lub przed przeniesieniem roślin do ziemi albo przez kolchicynowanie młodych roślin, które wykształciły kilka liści (Cebrat i in. 1994c).
Jak wynika z analizy androgenezy, potencjalna wydajność haploidyzacji pozostaje tylko częściowo wykorzystana, chociaż dla celów hodowlanych jest na ogół wystarczająca. Do najważniejszych czynników, które mają wpływ na wydaj-ność androgenezy zalicza się genotyp i stan fizjologiczny rośliny — dawcy (tab. 4). Różnice genotypowe są widoczne na każdym etapie androgenezy, jednak u rzepaku zazwyczaj nie spotyka się genotypów całkowicie opornych na indukcję. Stan fizjologiczny rośliny jest pojęciem mało precyzyjnym, jednak jest źródłem zmienności osobniczej nawet w obrębie linii homozygotycznej. Dawcy o tym samym genotypie rosnący w jednakowych, kontrolowanych warunkach różnią się
zdolnością do embriogenezy, optymalnym terminem pobrania pąków i innymi cechami (tab. 5). „Pamięć” zegara biologicznego również może mieć wpływ na efekt androgenezy (Kruczkowska i in. 1997).
Tabela 4 Czynniki, od których zależy wydajność haploidyzacji i podwojenia liczby chro-mosomów u rzepaku — Factors influencing the effectiveness of haploidy and chromosome doubling in oilseed rape
Genotyp — Genotype
Stan fizjologiczny rośliny–dawcy — Physiological state of donor plant
wiek — age
stadium kwitnienia — flowering stage
położenie pąka na roślinie — bud position on the plant temperatura — temperature
promieniowanie świetlne: natężenie, fotoperiod — light radiation: intensity, photoperiod sezon — season
odżywianie — nutrition
zdrowotność — freedom from disease and pests
Stadium rozwojowe mikrospory — Stage of microspore development Warunki kultury — Culture conditions
skład pożywki (stres osmotyczny) — composition (osmotic stress) temperatura (stres temperatury) — temperature (thermal stress) promieniowanie świetlne — light radiation
gęstość zawiesiny — microspore density stymulacja (mutageny) — stimulation (mutagens)
Konwersja — Conversion
dojrzałość morfologiczna i fizjologiczna zarodków
morphological and physiological maturity of embryos
stymulacja (temperatura, podsuszanie) — stimulation (temperature, dessication)
Podwojenie liczby chromosomów — Chromosome doubling
spontaniczne — spontaneous
stymulacja (temperatura, kolchicyna) — stimulation (temperature, colchicine)
Należy zwrócić uwagę, że z czynników środowiskowych największy wpływ na proces androgenezy rzepaku ma temperatura. Korzystne jest, aby rośliny–dawcy rosły w niskiej temperaturze, 15/10–10/5oC (Keller i in. 1987), stres temperatury 30–35oC przyczynia się do zmiany drogi rozwoju mikrospor, niska temperatura, 4oC, sprzyja konwersji zarodków, zamrożenie mikrospor zwiększa spontaniczną diploidyzację. Wiadomo, że temperatura wpływa na poziom endogennych regula-torów wzrostu i odżywienie komórek, jednak nie wykazano dotąd możliwości zastąpienia wpływu temperatury przy pomocy fitohormonów i innych czynników.
Tabela 5 Wpływ stanu fizjologicznego dawcy na embriogenezę (liczba zarodków na 105 mikrospor) — The influence of physiological state of the donor plant on embryogenesis (No. of embryos/105 microspores)
Linie DH — DH lines Roślina–dawca Donor plant A B C G H W Z 1 256 101 43 126 45 9 0 2 109 294 583 0 36 104 0 3 247 254 25 143 127 160 11
Zastosowanie w hodowli i pracach genetycznych
Podwojone haploidy rzepaku (linie DH) są stosowane w hodowli krzyżów-kowej, heterozyjnej i mutacyjnej (tab. 6). Główną zaletą haploidyzacji jest możli-wość bardzo szybkiego uzyskania homozygot z mieszańców, bez oczekiwania na ujawnienie efektu segregacji w kolejnych pokoleniach. Ponadto w ten sposób otrzymuje się rozszczepienie w korzystniejszych dla selekcji stosunkach licz-bowych. W kilku pracach zwrócono jednak uwagę, że segregacja w populacjach androgenicznych odbiega od mendlowskiej. Przyczyną może być sprzężenie z genami sprzyjającymi haploidyzacji lub sposób podwajania haploidów (Foisset i in. 1997). Zarodki lub zregenerowane rośliny, zarówno w formie haploidalnej jak i podwojonej, mogą być selekcjonowane pod względem różnych cech agrono-micznych, w tym cech jakościowych (Cegielska-Taras i in. 1997) i odporności na choroby (Starzycki i in. 1996). Skuteczną selekcję można przeprowadzić nawet w małej populacji, jak to miało miejsce w przypadku żółtonasiennych form rzepaku (Henderson, Pauls 1992).
W hodowli heterozyjnej linie DH pozwalają uniknąć długotrwałego chowu wsobnego. Linie DH były też używane do zablokowania autogamii, zarówno przy wykorzystaniu samoniezgodności (Havel 1997) jak i genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności. W tym ostatnim przypadku — przy poszukiwaniu termo-stabilnych genotypów dopełniających dla linii CMS-polima (Bartkowiak-Broda i in. 1997) oraz restorerów o niskiej zawartości glukozynolanów dla linii CMS ogura (Cegielska-Taras i in. 1997).
Haploidy mogą być wykorzystane w hodowli mutacyjnej na dwa sposoby: przez indukowanie mutacji w kulturze mikrospor, a następnie wyszukiwanie homozygotycznych mutantów oraz przez działanie mutagenem na nasiona i selekcję zmutowanych linii DH wyprowadzonych z roślin M1. Należy jednak wziąć pod uwagę, że mimo dużej odporności mikrospor i tkanek rzepaku na czynniki mutagenne (Cebrat i in. 1994a), zdolność do androgenezy i konwersji przy obu sposobach indukcji może być znacznie upośledzona (tab. 7).
Tabela 6 Wykorzystanie dihaploidów rzepaku — Utilization of oilseed rape dihaploids
A) w hodowli roślin — in plant breeding
• w hodowli krzyżówkowej: szybkie otrzymanie homozygot, w korzystniejszych dla selekcji rozszczepieniach — in crossbreeding: fast production of homozygous lines with gametic
segregation suitable for selection purposes
• w hodowli heterozyjnej: szybkie otrzymanie (bez chowu wsobnego) homozygotycznych linii potrzebnych do wytworzenia mieszańców — in hybrid breeding: fast obtaining (without
inbreeding) of homozygous components required for hybrid production
• w hodowli mutacyjnej: szybki efekt fenotypowy
in mutation breeding: fast phenotypic effect
B) w pracach genetycznych — in genetic applications
• badanie kariotypu, aberracji chromosomowych i otrzymywanie aneuploidów
research on karyotype, chromosome aberrations and aneuploids production
• badanie filogenezy i resynteza rzepaku — studies of oilseed rape phylogenesis and resynthesis • przechowywanie materiału genetycznego — germplasm storage
• mieszańce somatyczne — somatic hybrids • trasformowanie genomu — genome transformation
Tabela 7 Regeneracja młodych roślin z kultur mikrospor poddanych działaniu mutagenów oraz mikrospor pochodzących z roślin M1 — Regeneration of young plants obtained from microspore cultures treated with mutagens and from microspores of M1 plants
Mutagen Dawki — Doses Regeneracja [% kontroli] Regeneration [per cent of control]
Traktowane mikrospory — Microspores treated Promienie γ Nf UV MNH 10– Gy 10–16 Gy 15–30 s 0,5–1,5 mM 213,4 96,1 34,3 38,0 Traktowane nasiona — Seeds treated
Wydaje się, że haploidy rzepaku są dotąd wykorzystywane w pracach genetycznych w mniejszym zakresie niż w hodowli. Dysponowanie roślinami o gametycznej liczbie chromosomów na pewno ułatwia badanie kariotypu, aberracji chromosomowych i otrzymywanie aneuploidów. U rzepaku, który jest gatunkiem alloploidalnym, haploidy mogą mieć duże znaczenie w badaniach filogenetycznych oraz resyntezie tego gatunku z odpowiednio dobranych komponentów. Fuzja haploidalnych protoplastów pozwala na uniknięcie zaburzeń chromosomalnych, często występujących przy fuzji komórek somatycznych. Zwiększenie ograniczonej hodowlą odmian ulepszonych zmienności rzepaku jest też możliwe przez indukowanie i wykorzystanie zmienności gametoklonalnej.
Mikrospory i zarodki haploidalne rzepaku doskonale nadają się do przecho-wywania materiału genetycznego. Dobrze znoszą zamrażanie, które nawet wzmaga skłonność do spontanicznej diploidyzacji (Chen, Beversdorf 1992). W normalnej temperaturze można przechowywać wysuszone zarodki haploidalne w stadium liścieniowym (Brown i in. 1993, cyt. za Palmer i in. 1996). Obie te możliwości mają znaczenie dla ewentualnej produkcji sztucznych nasion rzepaku.
Wykorzystanie haploidów do transformacji rzepaku wskazuje na znaczną przewagę tego systemu nad trasformowaniem tkanek somatycznych: haploidy mają duży potencjał regeneracyjny i transgeny można łatwo przeprowadzić w stan homozygotyczny, szczególnie jeśli przenosiłoby się je wprost do mikrospor. Najczęściej stosowaną dotychczas metodą u rzepaku jest transformacja tkanek haploidalnych, np. fragmentów zarodka przy pomocy Agrobacterium tumefaciens. Bezpośrednie przenoszenie DNA do mikrospor przy pomocy różnych metod jest jeszcze mało zaawansowane (Palmer i in. 1996).
Podsumowanie
1. Haploidyzacja rzepaku in vitro znalazła już szerokie zastosowanie w hodowli krzyżówkowej i heterozyjnej.
2. Małe zróżnicowanie odmian podwójnie ulepszonych wskazuje na potrzebę większego wykorzystania zmienności gametoklonalnej i indukcji zmienności mutacyjnej przy użyciu haploidów.
3. Prace genetyczne nad fuzją protoplastów, filogenezą i resyntezą gatunku oraz transformacją przy zastosowaniu mikrospor, komórek czy tkanek haploidal-nych mogą stanowić źródło dalszego postępu w hodowli rzepaku.
4. Wyjaśnienie mechanizmu powodującego zmianę kierunku rozwoju mikrospory z gametofitycznego na sporofityczny oraz rozszerzenie badań fizjologicznych i biochemicznych nad tym zjawiskiem przyczyni się do zwiększenia wydaj-ności androgenezy i jej powtarzalwydaj-ności.
Literatura
Bartkowiak-Broda I., Popławska W., Liersch A., Gazecka B. 1996. Badania nad genowo-cytoplaz-matyczną męską niepłodnością typu CMSpol u rzepaku ozimego. Rośliny Oleiste XVII: 21-32. Cebrat J., Kruczkowska H., Skucińska B. 1994a. Wpływ napromieniowania na embriogenezę
w kulturach pylników rzepaku ozimego. Rośliny Oleiste XV: 55-60.
Cebrat J., Kruczkowska H., Pawłowska H., Skucińska B. 1994b. Effect of irradiation on embryogenesis in microspore culture of rapeseed. Abstr. VIIIth Internat. Congr. Plant Tiss. and Cell Cult., Firenze 12-17 VI 1994: 83.
Cebrat J., Pawłowska H., Skucińska B. 1994c. Podwajanie liczby chromosomów u dihaploidów rzepaku ozimego. Rośliny Oleiste XV: 61-66.
Cegielska-Taras T., Szała L. 1997. Regeneracja roślin z mikrosporowych zarodków rzepaku ozimego
Brassica napus L. Rośliny Oleiste XVIII: 21-30.
Cegielska-Taras T., Szała L., Gazecka B., Liersch A., Popławska W., Bartkowiak-Broda I. 1997. Wczesna selekcja androgenicznych linii rzepaku ozimego z genem restorerem dla systemu CMS ogura i niską zawartością glukozynolanów. Z. Nauk. AR w Krakowie, s. Sesja Naukowa 50: 329-332.
Chen J. L., Beversdorf W. D. 1992. Production of spontaneous diploid lines in isolated microspores following cryopreservation of spring rapeseed (Brassica napus L.). Plant Breed. 108: 324-327. Chuong P. V., Beversdorf W. D. 1985. High frequency embryogenesis through isolated microspore
culture of B. napus and B. carinata Braun. Plant Sci. 39: 219-226.
Coventry J., Kott L., Beversdorf W. D. 1988. Manual for Microspore Culture Technique for Brassica
napus. Dept. of Crop Sci. Techn. Bull. OAC Publication 0489, Univ. of Guelph, Guelph.
Custers J. B. M., Cordewener J. H. G., Nöllen Y., Dons H. J. M., Van Lookeren Compagne M. M. 1994. Temperature controls both gametophytic and sporophytic development in microspore cultures of Brassica napus. Plant Cell Rep. 13: 267-271.
Foisset N., Delourme R., Lucas M. O., Renard M. 1997. In vitro androgenesis and segregation distortion in Brassica napus L.: spontaneous versus colchicine-doubled lines. Plant Cell Rep. 16: 464-468.
Hause G., Hause B. 1996. Induction of embryogenesis in microspores and pollen of Brassica napus L. cv. Topas. Diss. in Agric. Univ. of Wageningen, the Netherlands.
Havel J. 1996. Hodowla roślin oleistych w Republice Czeskiej. Rośliny Oleiste XVII: 107-112. Henderson C. A. P., Pauls K. P. 1992. The use of haploidy to develop plants that express several
recessive traits using light-seeded canola (Brassica napus) as an example. Theor. Appl. Genet. 83: 476-479.
Iwanowska A., Tykarska T., Chomicz B., Kuraś M. 1997. Development and conversion of microspore-derived embryos of Brassica napus L. cv. Topas. Z. Nauk. AR w Krakowie, s. Sesja Naukowa 50: 321-324.
Jędrzejaszek K., Kruczkowska H., Pawłowska H., Skucińska B. 1994. Stymulujący wpływ mutagenów na regenerację roślin rzepaku ozimego in vitro. Prace Ogrodu Botanicznego PAN 5/6: 245-256.
Keller W. A., Armstrong K. C. 1978. High frequency production of microspore-derived plants from
Keller W. A., Armstrong K. C. 1983. Production of Brassica napus haploids through anther and microspore culture. Proc. of 6th International Rapeseed Congress, Paris, 17-19 V: 239-245. Keller W. A., Arnison P. G., Cardy B. K. 1987. Haploids from gametophytic cells – recent
development and future prospects. In: Plant Tissue and Cell Culture. Green C. E., Somers D. A., Nackett W.P. and Biesboer D.D. (eds.), Allan R. Liss, New York, 233-241.
Kruczkowska H., Pawłowska H., Skucińska B. 1994. Kultury mikrospor w polskim materiale rzepaku ozimego. Rośliny Oleiste XV: 51-54.
Kruczkowska H., Pawłowska H., Skucińska B. 1997. Wpływ stanu fizjologicznego roślin donorów na wydajność embriogenezy w kulturach mikrospor rzepaku ozimego. Mat. II Ogólnop. Konf. „Zastosowanie kultur in vitro w fizjologii roślin”, Kraków, 21-23 XI 1996: 113-118.
Kruczkowska H., Pawłowska H. 1997. Czy można zwiększyć wydajność kultur mikrospor? Z. Nauk. AR w Krakowie, s. Sesja Naukowa 50: 325-328.
Lichter R. 1982. Induction of haploid plants from isolated pollen of Brassica napus. Z. Pflanzen-physiol. 105: 427-434.
Nitta T., Takahata Y., Kaizuma N. 1997. Scanning electron microscopy of microspore embryogenesis in Brassica spp. Plant Cell Rep. 16: 406-410.
Palmer C. E., Keller W. A., Arnison P. G. 1996. Utilization of Brassica haploids. In: In Vitro Haploid Production in Higher Plants. Jain S.H., Sopory S. K. and Veilleux R. E. (eds.), vol. 3, Kluwer Academic Publishers, the Netherlands, 173-192.
Starzycki M., Starzycka E., Pszczoła J., Pakos T. 1996. Porównanie skuteczności różnych metod hodowli odpornościowej rzepaku ozimego na porażenie powodowane przez Phoma lingam. Rośliny Oleiste XVII: 179-184.
Zaki M., Dickinson H. 1995. Modification of cell development in vitro: The effect of colchicine on anther and isolated microspore culture in Brassica napus. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 40: 255-270.
Zhao J., Simmonds D. H., Newcomb W. 1996. High frequency production of doubled haploid plants of Brassica napus cv. Topas derived from colchicine – induced microspore embryogenesis without heat shock. Plant Cell Rep. 15: 668-671.
