BIAŁKA AKTYWNE BIOLOGICZNIE
BIAŁKA AKTYWNE BIOLOGICZNIE
OBECNE W SOKU
OBECNE W SOKU
POKROCHMALNI
POKROCHMALNIANYM
NYM
mgr inż. Marta Markiewicz1, dr inż. Agnieszka Barnyk2
1 Politechnika Gdańska, Katedra Technologii Chemicznej, ul. Narutowicza 11/12 80-233 Gdańsk, e-mail: martam@chem.pg.gda.pl
2 IHAR, Zakład Nasiennictwa i Ochrony Ziemniaka w Boninie e-mail: barnyk@ziemniak-bonin.pl
Białka jako produkt uboczny kroch-malnictwa
1.
Podczas przetwarzania jednej tony ziemnia-ków na skrobię powstaje od 5 do 12 m3 soku ziemniaczanego, który zawiera 300-410 g/kg białek w całkowitej suchej masie. Przybliżo-na zawartość białka w soku poprodukcyjnym typowego zakładu przetwórstwa ziemniacza-nego zawiera się w granicach 1-4 g/l, czysta frakcja białkowa stanowi ok. 50% osadu (Vi-kelouda, Kiosseoglou 2004).
Białka znajdują się w soku poprodukcyj-nym w formie natywnej (aktywnej funkcjonal-nie). Jednakże z uwagi na ich wysoką wrażli-wość na ogrzewanie i siły ścinające często ulegają denaturacji podczas filtrowania, a nawet przechowywania (Zwijnenbegr i in. 2002).
1.1. Rodzaje białek obecnych w odpadzie krochmalniczym
Trzy główne grupy białek zawartych w bul-wach ziemniaka to: białka typu patatyny, gru-pa białek złożonych o wielkości 22 kDa oraz inhibitory proteaz o charakterze zasadowym (Ralet, Gueguen 2000b).
Białka typu patatyny są jednorodną gru-pą kwaśnych białek, stanowiących do 40% wszystkich białek rozpuszczalnych obecnych w bulwach ziemniaka. Pierwszy raz zostały wyizolowane przez Racusena i Foote’a w 1980 roku. Białka te występują w formie di-merów o łącznej wielkości ok. 88 kDa, złożo-nych z podjednostek o wielkości ok. 40 kDa (Ralet, Gueguen 2000a). Istnieje wiele form patatyny, można je podzielić na cztery grupy: A, B, C i D, stanowiące odpowiednio 62, 26, 5 i 7% patatyn występujących w tkance bulw
ziemniaka czy w soku poprodukcyjnym (Pots i in. 1999). Wszystkie formy mają niemal identyczną sekwencję aminokwasową i są immunologicznie nierozróżnialne. Patatyna służy głównie jako białko zapasowe, ale ma również aktywność enzymatyczną pozwala-jącą na trawienie tłuszczów (Ralet, Gueguen 2000a) należących do fosfolipidów, glikolipi-dów, sulfolipidów oraz mono- i diacyloglice-roli. Zdaniem Tonon i innych (2001) aktyw-ność lipolityczna patatyny może być częścią mechanizmu obronnego, pozwalającego na hamowanie procesu patogenezy.
Druga grupa białek, obejmujących związki o wielkości 22 kDa, jest zdecydo-wanie gorzej poznana niż patatyna. Wiado-mo, że białka do niej należące mają charak-ter zasadowy. Grupa ta obejmuje dwie od-rębne rodziny białek, z których każda wyka-zuje zdolność do hamowania enzymów pro-teolitycznych trawiących białka. Frakcja ta stanowi ok. 30-40% białek obecnych w bul-wach ziemniaka (Ralet, Gueguen 2000b).
Inhibitory proteaz, stanowiące 20-30% ekstraktu (Ralet, Guegeun 2000b), są w przeciwieństwie do białek z grupy patatyny znacznie bardziej zróżnicowane. Białka w tej grupie różnią się masą cząsteczkową, se-kwencją aminokwasów oraz aktywnością en-zymatyczną. Można je podzielić na siedem kategorii (Pouvreau i in. 2001):
●
inhibitory I (PI-1) – białka o wielkości 7-8 kDa, hamujące chymotrypsynę oraz w mniej-szym stopniu trypsynę;●
inhibitory II (PI-2) – dimery zbudowane z dwóch podjednostek, wśród których wyróż-niamy cztery typy: A, B, C i D. Zależnie od tego, które z podjednostek tworzą białko,zmienia się powinowactwo inhibitora do tryp-syny i chymotryptryp-syny;
●
inhibitory proteazy cysteinowej (PCPI) – to rodzina białek o wielkości 20-22 kDa. Nie-które z nich wykazują częściową zdolność do hamowania proliferacji komórek nowo-tworowych (Ledoigt i in. 2006). Inhibitory te wykazują maksimum aktywności w pH 5-7, czyli takim, jakie panuje w przewodzie pokar-mowym insektów wytwarzających proteazy serynowe;●
inhibitory proteazy asparaginowej (PAPI), o wielkości ok. 20 kDa i optimum aktywności w zakresie pH 3-5. Bulwy ziemniaka zawie-rają inhibitor proteinazy asparaginowej – ka-tepsyny D, który hamuje oprócz kaka-tepsyny D także trypsynę i chymotrypsynę, ale nie wy-kazuje aktywności w stosunku do proteaz asparaginowych takich jak pepsyna, renina lub katepsyna E (Lawrence, Kouldal 2002);●
inhibitory proteazy typu Kunitza (PKPI) – mają wielkość ok. 20 kDa i wykazują aktyw-ność w stosunku do chymotrypsyny i nieco mniejszą aktywność w stosunku do trypsyny. Jorgensen i inni (2006) wyizolowali z soku poprodukcyjnego aż czternaście wariantów inhibitorów proteaz typu Kunitza, które wyka-zywały aktywność w stosunku do trypsyny oraz proteaz pochodzących z grzybówFusa-rium;
●
inhibitor karboksypeptydaz (PCI) – jest najmniejszym z inhibitorów obecnych wbul-wach ziemniaka (4,3 kDa), złożonym tylko z jednego peptydu. Odznacza się bardzo dużą odpornością termiczną i wykazuje aktywność w stosunku do karboksypeptydazy A (Po-u-vreau i in. 2001). Inhibitory karboksypepty-daz pochodzące z ziemniaka są silnymi inhi-bitorami o szerokim spektrum działania, ha-mującymi zarówno enzymy zwierzęce, jak i produkowane przez mikroorganizmy, ale nie działają na karboksypeptydazy serynowe drożdży i roślin (Lawrence, Koundal 2002);
●
inne inhibitory proteazy serynowej (OSPI) – mają wielkość ok. 21 kDa i są złożone z dwóch podjednostek. Wykazują aktywność w stosunku do chymotrypsyny, trypsyny i ela-stazy (Pouvreau i in. 2001). Inhibitory prote-az serynowych wykprote-azują największą aktyw-ność w pH 9-11, zakres ten odpowiada pH, jakie występuje w przewodzie pokarmowym insektów rzędu Lepidoptera, wśród których wyróżnia się wiele szkodników roślin (Law-rence, Koundal 2002).Biologiczna rola inhibitorów proteaz nie jest poznana, ale istnieją hipotezy wskazują-ce na trzy funkcje, które mogą spełniać: są białkami zapasowymi, ponadto służą jako re-gulatory aktywności endogennych proteaz oraz stanowią czynniki chroniące roślinę przed insektami i patogenną mikroflorą (Le-doigt i in. 2006).
Tabela 1
Charakterystyka białek występujących w wodach sokowych
Białko Patatyna PI-1 PI-2 PCPI PAPI PKPI PCI OSPI
Masa
cząsteczko-wa (kDa) 43 7-8 20 20-23 19-22 20 4,3 21
Procentowa
za-wartość w soku 37,5% 4,5% 22,3% 11,9% 5,9% 3,6% 0,9% 1,5%
Zakres pI 4.0 5,1-7,8 5,5-6,9 5,9-9,4 6,2-8,7 8,0-9,0 ozna-nie
-czono 7,5-8,8
Liczba izoform 8 7 8 6 2 - 2
Substrat lipidy trp, chym, LEL trp, chym, LEL trp, chym, pap LEL, kat Dtrp, chym, trp, chym - chym, trp, LEL Objaśnienia: trp – trypsyna, chym – chymotrypsyna, LEL – ludzka elastyna leukocytowa,
kat D – katepsyna D; Źródło: Pouvreau i in. (2001); Ralet, Gueguen (2000)
1.2. Sposoby izolacji białek z soku poprodukcyjnego
Jednym ze sposobów izolacji białek z pro-duktów ubocznych krochmalnictwa jest
kon-centracja z użyciem odwróconej osmozy po-łączona z koagulacją termiczną białek, a na-stępnie ich separacją i suszeniem. Tak pozy-skane białko ma słony i gorzki smak oraz
ograniczone zastosowanie. Nie może być używane jako np. dodatek do żywności, a je-dynie jako pasza dla zwierząt. Wykorzysta-nie ultrafiltracji pozwala na uzyskaWykorzysta-nie prepa-ratu o nieco lepszych właściwościach orga-noleptycznych, mogącego być np. dodatkiem do produktów mięsnych, jednak w ilości nie większej niż 10% masy produktu i przy za-stosowaniu substancji maskujących jego smak i zapach (Zwijnenberg i in. 2002).
Sharma i inni (2004), stosując rozdział na kolumnach wypełnionych jonowymienia-czem, uzyskali rozdział białek na dwie grupy: związane na kolumnie – białka kwasowe (22% ilości białek naniesionych na kolumnę) i niezwiązane – białka zasadowe (71%). Frakcja kwasowa wykazywała aktywność an-tygrzybową.
Możliwe jest również odzyskiwanie białek z soku poprodukcyjnego na drodze kombina-cji koagulakombina-cji termicznej i strącania kwasem. Jednak białka uzyskane w ten sposób są nieodwracalnie zdenaturowane i pozbawione aktywności biologicznej właściwej ich for-mom natywnym (Pots i in. 1998).
Inne metody umożliwiające wydzielenie białek z soku to kompleksowanie na bentoni-cie lub karboksymetylocelulozie (Ralet, Gu-eguen 2000b). Kompleksowanie przy uży-ciu polisacharydów wydaje się najwłaściwszą metodą izolacji białek w formie natywnej (Gonzalez i in. 1991).
1.3. Potencjalne zastosowanie wyizolowanych białek
Roślinne inhibitory proteaz (enzymów trawią-cych białka) odgrywają znaczącą rolę w obronie roślin przed patogenami i zwierzęta-mi roślinożernyzwierzęta-mi. Hamując aktywność pro-teaz, ograniczają ilość białek, które są tra-wione przez szkodniki, oraz powodują nad-produkcję enzymów hydrolitycznych, co zwiększa utratę aminokwasów siarkowych (Lawrence, Koundal 2002). W efekcie do-chodzi najpierw do zahamowania rozwoju in-sektów, a ostatecznie do ich śmierci. Niektó-re białkowe inhibitory proteaz pozyskiwane z ziemniaka są toksyczne na przykład w sto-sunku do: Sesamia inferens, Chrysodeixus
erisoma, Teleogryllus comodus, Diabrotica virgifera i Diabrotica undecimpuntata
(Law-rence, Kouldal 2002). Kim i inni (2005) stwierdzili, że jeden z inhibitorów proteaz
typu Kunitza – potamin-1 – hamuje wzrost i rozmnażanie się niektórych bakterii, np.
Sta-phylococcus aureus, Clavibacter michiga-nensis ssp. michigamichiga-nensis oraz grzybów, np. Candida albicans i Rhizoctonia solani.
Inhibi-tor ten odznacza się niezwykłą aktywnością antydrobnoustrojową, jednocześnie nie od-działując na komórki ssaków. W rok później grupa badaczy pod kierunkiem Kima wyizo-lowała z bulw ziemniaka inne białko o cha-rakterze inhibitora proteaz serynowych typu Kunitza o wielkości zbliżonej do potamin-1, ale innej sekwencji aminokwasowej. Białko to otrzymało nazwę potide-G i wykazywało aktywność antybakteryjną i przeciwgrzybową w stosunku do tych samych patogenów co potamin-1, a ponadto także względem
Liste-ria monocytogenes i Escherichia coli (Kim i
in. 2006). Potide-G ma zdolność hamowania infekcji wirusa PVYO nawet w stężeniu dzie-sięciokrotnie niższym niż jego średnie stęże-nie w bulwach ziemniaka (Tripathi i in. 2006). Białkowe inhibitory proteinaz wyizolowane z bulw ziemniaka są wykorzystywane w przemyśle spożywczym do hamowania nie-korzystnych zmian enzymatycznych w mię-sie ryb, mięczaków i skorupiaków. Podczas przetwarzania tych produktów w temperatu-rze 60°C aktywowane są enzymy rozkładają-ce miozynę i powodująrozkładają-ce zniszczenie tekstu-ry tych surowców. Inhibitotekstu-ry proteaz z ziem-niaka znalazły też zastosowanie w produkcji surimi (jap. „mielone mięso”, produkt na ba-zie zmielonego mięsa białych ryb, najczę-ściej mintaja lub morszczuka; popularny w kuchniach dalekowschodnich; najbardziej znana postać to paluszki krabowe – przyp. red.) z kilku gatunków ryb, co pozwoliło na poprawę jakości produktu i zwiększenie zy-sków (Garcia-Carreño 1996).
Opisywano antynowotworowe działanie inhibitorów proteaz pochodzących z bulw ziemniaka. Inhibitory proteaz I i II posiadają zdolność hamowania zmian w komórkach prowadzących do transformacji nowotworo-wej (Billings i in. 1991). Natomiast ziemnia-czane inhibitory karboksypeptydaz hamują proliferację komórek kilku linii gruczolaka trzustki (Blanco-Aparicio i in. 1998). Ma to ogromne potencjalne znaczenie terapeutycz-ne ze względu na brak skuteczterapeutycz-nej terapii w przypadku tego nowotworu.
Ponadto wykazano, że spożywanie izolo-wanych z bulw ziemniaka inhibitorów proteaz powoduje uwalnianie substancji powodują-cych zmniejszenie wchłaniania spożywane-go pokarmu, a w efekcie prowadzi do zmniejszenia masy ciała. Na bazie inhibito-rów proteaz wyprodukowano i wprowadzono na rynek dwa suplementy diety w postaci na-poju (Satietrol) i kapsułek (Satise), zawiera-jące mieszaninę białek z ziemniaka i kwasów tłuszczowych, efektywnie wspomagające od-chudzanie (Fear i in. 2007).
Ruseler-van Embden i inni (2004) udo-wodnili, że inhibitory proteaz pozyskiwane z ziemniaka mogą być z doskonałym skutkiem stosowane w leczeniu pooperacyjnych zapa-leń skóry będących efektem podrażnień wy-woływanych przez enzymy trzustkowe. Z ba-dań tych wynika też, że inhibitory trypsyny z soi również hamują działanie enzymów trzustkowych, jednak w znacznie mniejszym stopniu niż inhibitory proteaz izolowane z ziemniaka. Te ostatnie blokują niemal zupeł-nie aktywność wszystkich trzech enzymów trzustkowych.
Ze względu na zdolność do hamowania wzrostu Candida albicans inhibitory proteaz mogą być stosowane również w leczeniu drożdżyc jamy ustnej, przełyku i dróg moczo-wych (Kim i in. 2005).
Patatyna – stanowi część systemu obron-nego rośliny przed patogenami, wykazując zdolność degradacji ścian komórkowych bakterii i grzybów (Sharma i in. 2004). Po-nadto aktywność patatyny powoduje uwa-l-nianie substratów do wytwarzania toksycz-nych dla patogenów pochodtoksycz-nych kwasów tłuszczowych i wosków (Andreau i in. 1998).
Patatyna okazała się też bardzo obiecują-cym czynnikiem pianotwórczym. Jej zdol-ność do tworzenia i utrzymania piany jest po-równywalna ze sproszkowanym białkiem jaja kurzego, a nawet lepsza (Ralet, Guegen 2000). Może też być stosowana jako enzy-matyczny katalizator niektórych procesów, jak deacylacja czy synteza estrów, wykazu-jący aktywność nawet przy małej dostępno-ści wody w środowisku (Hirschberg i in. 2001).
Białko to wykazuje także właściwości an-tyutleniające w stosunku do β-karotenu i kwasu linolenowego, więc może znaleźć za-stosowanie jako ekologiczny konserwant. Ma
też zdolność neutralizacji wolnych rodników, mających istotne znaczenie w indukcji choro-by Alzheimera, nowotworów, chorochoro-by wień-cowej oraz procesu starzenia się organizmu, mogłoby więc być brane pod uwagę jako czynnik hamujący lub opóźniający tego typu zmiany chorobowe (Yen-Wenn i in. 2003). 1.4. Podsumowanie
W ciągu ostatniego dziesięciolecia znacznie wzrosło zainteresowanie białkami obecnymi w produktach ubocznych przemysłu kroch-malniczego ze względu na ich wielokierunko-we potencjalne zastosowanie. Obecnie udo-wodniono, w skali laboratoryjnej, przydat-ność tych związków jako biodetergentów, emulsyfikatorów, insektycydów, bakteriocy-dów, leków, katalizatorów reakcji chemicz-nych, konserwantów itp., a nawet z powo-dzeniem zastosowano je jako dietetyczne dodatki do żywności dla ludzi. Ponieważ biał-ka pozyskiwane z ziemniabiał-ka mają naturalne pochodzenie, są uważane za bardziej bez-pieczne i mogą stanowić alternatywę dla chemicznych dodatków do żywności, m. in. konserwantów lub środków pieniących. Od-pad pokrochmalniczy jest bogatym źródłem patatyny i inhibitorów proteaz, powstającym w ogromnych ilościach. Przetworzenie 100 t ziemniaków daje 75 m3 płynnych odpadów zawierających biologicznie aktywne białko, które może być źródłem dodatkowych do-chodów.
Literatura
1. Billings P., Jin T., Ohnishi N., Liao D., Habres J. 1991. The interaction of the potato-derived
chymotrip-sin inhibitor with C3H/10T1/2 cells. – Carcinogenesis 12: 653-657; 2. Blanco-Aparicio C., Molina M. A.,
Fernández-Salas E., Frazier M. L., Mas J. M., Querol E., Avilés F. X., de Llorens R. 1998. Potato
carboxypeptidase inhibitor, a T-knot protein, is an epi-dermal growth factor antagonist that inhibits tumor cell growth. – J. Biol. Chem. 273: 12370-12377; 3. Fear
G., Komarnytsky S., Raskin I. 2007. Protease
inhibit-ors and their peptidomimetic derivatives as potential grugs. – Pharmacology and Therapeutics 113: 354-368; 4. Garcia-Carreño F. L. 1996. Protease inhibitors. – Trends Food Sci. Tech. 7(6): 197-204; 5.
Gonzalez J. M., Lindemood J. B., Desai N. 1991.
Re-covery of proteins from potato plant waste effulents by complexation with carboxymethylcelulose. – Food Hy-drocolloids 4: 355-363; 6. Hirschberg H., Simons J.,
Dekker N., Egmond M. 2001. Cloning, expression,
purification and characterization of patatin, a novel phospholipase A. – Eur. J. Bioch. 268: 5037-5044;
7. Jorgensen M., Bauw G., Welinder K.G. 2006.
Mo-lecular Properties and Activities of Tuber Proteins from Starch Potato Cv. Kuras. – J. Agric. Food Chem. 54 (25): 9389-9397; 8. Kim J. Y., Seong-Cheol Parka,
Mi-Hyun Kima, Hak-Tae Limb, Yoonkyung Parka, Kyung-Soo Hahm 2005. Antymicrobial activity studies
on a trypsin-chymotripsin protease inhibitor obtained from potato. – Bioch. Biophys. Res. Communic. 330: 921-927; 9. Kim M., Park S., Kim J., Lee S., Lim H.,
Cheong H., Hahm K., Park Y. 2006. Purification and
characterization of heat-stable serine protease inhibitor from the tubers of new potato variety „Golden Valley”. – Bioch. Biophys. Res. Communic. 346: 681-686;
10. Lawrence P., Koundal K. 2002. Plant protease
in-hibitors in control of phytophagous insects. – Electr. J. Biotech. 5: 93-109; 11. Ledoigt G., Griffaut B.,
Deb-iton E., Vian C., Mustel A., Evray G., Maurizis J. C., Madelmoth J.C. 2006. Analysis of secreted protease
inhibitors after water stress in potato tubers. – Intern. J. Biol. Macromol. 38: 268-271; 12. Pots A., Gruppen
H., Hessing M., van Boekel M. A. J. S., Voragen A. G. J. 1999. Isolation and Characterization of Patatin
Isoforms. – J. Agric. Food Chem. 47: 4587- -4592; 13. Pouvreau L., Gruppen H., Piersma S.,
van den Broek L., van Koningsveld G., Voragen A. 2001. Relative abdundance and inhibitory distribution
of protease inhibitors in potato fruit juice cv. Elkana. – J. Agric. Food Chem. 49: 2864-2874. 14. Ralet M.,
Gueguen J. 2000 A. Fractionation of potato proteins:
Solubility, Thermal coagulation and Emulsifying prop-erties. – Food Sci. Tech. 33: 380-387; 15. Ralet M.,
Gueguen J. 2000 B. Foaming properties of potato raw
proteins and isolated fractions. – Food Sci. Tech. 34: 266-269; 16. Ruseler-van Embden J., van Lieshout
L., Smith S., van Kessel I., Laman D. 2004. Potato
tuber proteins efficiently inhibit human faecal proteolyt-ic activity: implproteolyt-ication for treatment of per-anal dermatitis. – Eur. J. Clinical Invest. 34: 303-311;
17. Sharma N., Gruszewski H., Park S.W., Holm D., Vivanco J. 2004. Purification of an isoform of patatin
with antimicrobial activity against Phytophtora
infest-ans. – Plant Phys. Bioch. 42: 647-655; 18. Tonon C.,
Daleo G., Oliva C. 2001. An acidic β-1,3 gucanase
from potato tubers appears to be patatin. – Plant Phys. Bioch. 39: 847-854; 19. Tripathi G. R., Park J., Park
Y., Hwang I., Park Y., Hahm K.S., Cheong H. 2006.
Potide-G derived from potato (Solanum tuberosum L.) is activeagainst potato virus YO (PVYO) infection. – J.
Agric. Food Chem. 54(22): 8437-8443; 20. Vikelouda
M., Kiosseoglou V. 2004. The use of
carboxymethyl-cellulose to recover potato proteins and control their functional properties. – Food Hydrocolloids. 2004. 18: 21-27; 21. Yen-Wenn L, Chuan-Hsiao H., Mei-Hsien
L., Feng-Lin H., Wen-Hi H. 2003. Patatin, the tuber
storage protein of potato (Solanum tuberosum L.), ex-hibits antioxidant activity in vitro. – J. Agric. Food Chem. 51: 4389–4393; 22. Zwijnenberg H.,
Kemper-man A., Borringter M., Lotz M., Dijkstehuis J., Poulsen P., Koops G. 2002. Native protein recovery
from potato fruit juice by ultrafiltration. – Desalination 144: 331-334
