W pływ ß-cyclodekstryny na kinetykę zmian konformacyjnych
receptora G ABA
aw hodowanych neuronach hipokampalnych
szczura
Katarzyna Mercik, Maria Pytel, Jerzy Ж M ozrzym as
Sam odzielna Pracownia Biofizyki Układu N erw ow ego Katedra Biofizyki
Akadem ia M edyczna we W rocławiu
Streszczenie
Cyklodekstryny (CD) są szeroko stosowanymi nanostrukturam i,
zaw ierającym i w swojej budowie elem enty hydrofobowe i hydrofilow e, dzięki czem u m ogą silnie oddziaływ ać ze składnikam i błon biologicznych.
W prezentow anej pracy zbadany został wpływ ßC D na receptory G ABAa
w hodowanych neuronach hipokampalnych szczura. W tym celu zm ierzono odpowiedzi prądowe na ultraszybkie aplikacje GABA. A naliza danych
pom iarow ych w ykazała, że ßCD silnie wpływa na kinetykę zm ian
konformacyjnych receptora G AB Aa głównie poprzez m odulację procesu
desensytyzacji i w iązania agonisty. Niniejsze wyniki w skazują na to, że ßCD może silnie m odulować białka błonowe, przez co nie powinna być uważana jako obojętny nośnik substancji hydrofobowych.
Sło w a k luc z ow e : R e cepto ry G A B A a , ß - cyklodek stryna, ultraszy bka pcrfuz ja, pa tch-cla m p
Cyklodekstryny (CD) (węglowodany z grupy dekstryn) są
nanocząsteczkam i, których pierścień ma kształt lekko stożkowatego cylindra określany często m ianem torusa. Wnętrze takiego stożka ma charakter hydrofobow y, natom iast zewnętrze hydrofilowy. Taka budowa cząsteczek CD nadaje im zdolności do rozpoznaw ania innych cząsteczek w wyniku tworzenia
z nimi kom pleksów inkluzyjnych (typu „gospodarz-gość”) [4, 7, 16].
Powinowactw o cząsteczek substratów do wnęki uw arunkow ane je st przede wszystkim w zajem nym dopasowaniem się ich rozmiarów. W wyniku utw orzenia takich kom pleksów zm ieniają się w bardzo istotny sposób właściwości chemiczne i fizyczne (rozpuszczalność, toksyczność, zdolność utleniania i inne)
cząsteczek „zam kniętych” w CD. Zdolność tw orzenia przez CD kom pleksów inkluzyjnych pozwala na ich szerokie zastosow anie m. in. w przemyśle chemicznym , spożywczym , produkcji nawozów sztucznych, a co najw ażniejsze w przem yśle farm aceutycznym - jako nośników różnych leków.
Istnieje wiele doniesień literaturow ych, w których opisany został fakt oddziaływ ania CD z różnymi składnikam i błon kom órkowych. N ajczęściej badanym aspektem , przez co i najlepiej poznanym, je st wpływ oddziaływ ania CD na lipidy blon komórkowych. O pisano rów nież oddziaływanie CD z białkam i [9, 15]. Stw ierdzono, że CD blokują koneksyny przez bezpośrednie oddziaływ anie z porem kanału [11]. Stwierdzono również, że CD m odulują błony kom órkowe w wyniku absorpcji cholesterolu z błony [10, 19]. W iadom o, że cholesterol zw iększa stabilność błony, poprzez kontrolow anie je j sztywności i płynności [2, 5]. Zm iana jeg o poziomu w błonie wpływa na funkcjonow anie białek m em branowych m.in. kanałów jonow ych, co w skazuje na to, że m ikrośrodow isko lipidowe odgrywa znaczącą rolę w regulow aniu funkcji białek błonowych [1, 6, 17, 20].
W ośrodkowym układzie nerwowym dorosłych osobników podstawowym neurotransm iterem ham ującym je st kwas Y-aminomasłowy (G ABA ), który to aktywuje jonotrop ow e receptory GA BAa . W obrębie kom pleksu receptora GA BAa wyróżnia się wiele miejsc wiążących różne związki [12, 18]. Związki, których działanie pow oduje bądź bezpośrednio aktywację receptora bądź wzm ocnienie lub osłabienie jego aktywności w obecności GABA (m. in. benzodiazepiny, pochodne kwasu barbiturowego, etanol). Związki te m ają działanie przeciwlękowe, przeciwdrgaw kow e, uspokajające i zw iotczające m ięśnie szkieletow e. N atom iast zablokow anie receptora G A B Aa (np.
pochodnymi ß-karbolinow ym i, bikukuliną lub pikrotoksyną) pow oduje
wystąpienie lęku, drgaw ek, pobudzenia oraz zw iększenie napięcia mięśni szkieletow ych, a przy wyższych dawkach konwulsje i kryzysy epileptyczne.
Tak ja k w cześniej zostało w spom niane CD są szeroko stosowane w przem yśle farm aceutycznym . Dlatego ważne je st zbadanie wpływ u tego czynnika na kinetykę receptora G AB Aa, którego dysfunkcja może prowadzić do w ielu groźnych patologii.
Do tej pory zagadnienie to nie było dogłębnie badane, jed y nie zespół Shu [18] przy użyciu powolnych system ów perfuzji pokazał, że CD nie w pływ a na odpowiedzi prądowe wywołane egzogenną aplikacją GA BA , ale m oduluje pow olną aktywację prądów aktywowanych przez neurosteroidy.
Chcąc jedn ak dokładnie opisać m echanizm działania CD na kinetykę receptora G A BAa w w arunkach zbliżonych do transm isji synaptycznej, należałoby przeprow adzić pomiary z rozdzielczością czasow ą adekw atną do zdarzeń synaptycznych [3, 12, 14]. Umożliw ia to system ultraszybkiej perfuzji,
dzięki któremu czas wym iany roztworu wokół łatki błonowej wynosi od 40 do 200ns. Poniżej prezentow ane badania przeprowadzone były przy użyciu takiego system u, dzięki czem u m ożliwe było precyzyjne opisanie m echanizm u m odulacji bram kowania receptora GA BAa przez p-cyklodekstrynę ßCD. D ośw iadczenia przeprow adzono w konfiguracji łatki błonowej outside-ouł.
R A D N ri "i \| A R ? 'V f Pi “i A R " 2k.off А Д ) 1 л (I, \J a 2r P: °z a ,r *
R y c .l. M o del kinety czn y J o ne s a i W es tbrooka: A - agon ista, k„n - s tała szy bko ści w iąza nia, koff - s tała sz yb kośc i d yso cjacji, a - stała szybkości otw arcia, ß - s tała szybko ści zam kn ięcia, d - sta ła szyb kośc i de sens ytyzacji, r - sta ła szybko ści res ensy tyzac ji, A 2R - sta n zw iązany zam knięty, A 2R* - stan zw iązan y otw arty, A 2D stan zw iązan y zde sensy tyz ow an y
В 2 ! CC T5 i
u
N £1500цМ
SOOj l lM *150j.iM J
-*ÉI
L + ß C D k o n tro laI
R y c. 2. A - Prz yk ład ow e odp ow ied zi prądow e (zare jestrow ane na tej sam ej tatc e błono w ej) w yw ołan e ap lika cja n asyc ająceg o stęże nia GA B A w w arunkach k on tro lnyc h i w o bec noś ci ßC D. В — P orów n an ie w z ględn ych w artości od pow iedzi prąd ow ych re je stro w a nyc h przy różnym stę żen iu ßC D .
Do opisu kinetyki zm ian konform acyjnyeh receptora posłużono się modelem Jonesa i W estbrooka (Ryc. 1) [8, 13]. Model ten zakłada dwa identyczne i niezależne m iejsca wiążące oraz istnienie stanu w pełni związanego otw artego (A 2R*) i stanu zdesensytyzowanego (A2D).
Aby precyzyjnie określić wpływ ßCD na am plitudę odpowiedzi prądow ych wywołanych egzogennym i aplikacjami nasycającego stężenia
GABA, zarejestrow ano szereg odpowiedzi prądow ych w w arunkach
kontrolnych i w obecności ßCD z tej samej łatki błonowej. Jako stężenie nasycające zastosow ano lOmM GABA. Tak ja k pokazano na rycinie 2, am plituda m onotonicznie wzrastała po dodaniu odpowiednio większych dawek ßCD. Efekt ten był w pełni odwracalny w całym zakresie stosowanych stężeń ßCD.
Jako m iarę szybkości aktywacji odpowiedzi prądowej zastosow ano czas jej narastania od 10% do 90% amplitudy. Czas narastania odpowiedzi prądow ych wywołanych przez aplikację nasycającego stężenia GABA był spowalniany przez ßCD , ale różnica w szybkości była znacząca dopiero przy wysokich stężeniach ßC D (1.5m M) (Ryc.3).
k o n tr o la
R y c. 3. A - Przyk ład ow e z norm alizow an e przebiegi od pow ied zi prądo w y ch reje strow any ch w w aru nkac h ko ntro lny ch i w obec noś ci 1500цМ ß C D В - Po ró w na nie szyb koś ci n ara sta nia od pow ie dzi prą do w yc h w y w ołan ych nasycającym stężenie m G A B A przy róż nym stę żen iu ßCD .
Zanik G ABA ergicznej odpowiedzi prądowej (deaktyw acja) wywołanej krótką (3m s) aplikacją nasycającego stężenia GABA (Ryc. 4A ) m a charakter dw ufazowy, który m oże być opisany za pom ocą sumy dwóch funkcji eksponencjalnych o różnych stałych czasowych:
y { t )
= A, exp H
I *'f i a) + Ą e x P (-'
,
Analiza fazy zaniku odpowiedzi prądowych wykazała, że odpow iedzi prądowe rejestrowane w obecności ßCD, charakteryzowały się w o lniejszą kinetyką zaniku w porów naniu z odpowiedziam i prądowymi otrzym anym i w warunkach kontrolnych (Ryc. 4). Zależność wielkości powolnej składowej deaktywacji (tS|ow) od stężenia ßCD miał charakter niem onotoniczny (Ryc. 4D).
A H 500(.lN1
ç
* 1500MM 4 150). iMI
% <52 1500tiM 500). iM * 150iiM / / à D 50ÜJ.ÜM 150 50 1 5 0jliN£i
0.4 O 0.2 -0.0 150). iM i 1500jiM + 500} iM H' pvlJL
F i 3 -* T3 + ßCD konh oln a ’ -и 500цМ * 1500цМ И ? 150). iMR yc . 4. А - Przy kład ow e przebiegi odpow iedzi prą dow ych w y w o łany ch 3m s a plik acją n asyc ająceg o stęż e nia G A B A i w obecno ści 50 0|iM ßC D . P orów nanie w artości średnich: В - średn ich stały ch czas ow yc h t „ „ С - szybkich stałych czasow y ch xfm , D - po w o ln yc h stałych cza sow ych t 5i„w, E — u dz iałó w p rocen tow y ch pow olnej skła dow ej A S|OW, F — średn ich w ielkości p rze w od zon eg o ładun ku; m ierzony ch pry różnych stężeniach ßC D .
Silny w zrost w artości xsiow obserwow any był dla stężeń ßCD do 500цМ, natom iast w wyższych stężeniach, wartość Tsi0w zmalała. Zaskakujące je st to, że rów nocześnie udział procentow y tej składowej wykazywał m onotoniczną zależność od stężenia ßCD (Ryc. 4E). Zależność średniego czasu zaniku
odpowiedzi prądowej (Tmean) od stężenia ßCD w ykazywała podobny
niem onotoniczny charakter jâk w przypadku zależności dla xS|0W. Znaczący wzrost am plitudy oraz przedłużona deaktywacja odpow iedzi prądow ych
rejestrowanych w obecności ßCD wpłynęły na zw iększenie ilość ładunku przenoszonego przez prądy wywołane nasycającym stężeniem GABA w obecności ßC D do 500 цМ. Przy wyższych stężeniach ßC D trend wzrostu ładunku przenoszonego przez odpowiedzi prądowe na nasycające stężenie GABA uległ odw róceniu (Ryc. 4F), co jakościow o odzw ierciedla zależność powolnej składowej deaktyw acji od ßCD (Ryc. 4E).
Kinetyka deaktywacji je st silnie kształtowana przez proces
desensytyzacji. W celu zbadania procesu desensytyzacji zastosowano długie (100m s) aplikacje nasycającego stężenia GABA, proces ten był wyraźnie dwufazowy. Poniew aż usunięcie neurotransm itera ze szczeliny synaptycznej następuje w ciągu kilkuset mikrosekund [14], pozwala to przypuszczać, że powolna składow a nie ma istotnego wpływu na kształtowanie prądów synaptycznych. W obec powyższego, badanie desensytyzacji ograniczone było jedyn ie do analizy szybkiej składowej desensytyzacji, która w odpowiedzi prądowej na 50ms impulsy GABA, była dom inująca. Proces desensytyzacji można więc opisać jak o sumę funkcji jednoeksponencjalnej oraz stałej wartości reprezentującej am plitudę prądow ą w stanie stacjonarnym:
3'(0
= Ą fcle x p ( - f/T ,4M) + ss
D odanie ßCD do roztw oru kontrolnego wpłynęło na spow olnienie stałej czasowej desensytyzacji (Tdes) i zw iększenie wartości param etru ss/peak -
reprezentującego część receptorów, które to nie weszły do stanu
zdesensytyzowanego. C harakter obu zależności był m onotoniczny w funkcji stężenia ßC D (Ryc. 5).
B o
1Г -* % ■a
1500(.iW ISOO fiM
50 0|iM 0.4 У 11.2 0.0 SOOfAf
S
+ ß C D k on tro laR yc. 5 A - P rzy kła dow e zn o rm a liz ow an e odpo w iedzi prądo w e w yw o łan e 100m s a plikac ją na sycając ego s tęż en ia G A B A i w o bec noś ci 50 0ц М ßC D . В - p orów n an ie średn ich w artości stałych cza sow y ch des ensy tyza cji d la różnych stężeń ßC D . С - p oró w n anie pa ram etru ss/peak dla różnych stę żeń ßC D .
W celu określenia zdolności kanału do ponownej aktyw acji zastosow ano krótkie (3m s) sparowane impulsy nasycającego GABA aplikow anego w różnych odstępach czasu. Na podstawie uzyskanych przebiegów prądowych wyznaczana jest wartość param etru R (ang. recovery) - będąca stosunkiem wzrostu natężenia prądu w odpow iedzi na drugi impuls agonisty do am plitudy pierwszej odpowiedzi
K = ^ - - 1 0 0 %
/ , - / 3
gdzie: Ii i I2 są am plitudam i odpowiedzi na pierwszy i drugi im puls agonisty, a I3 jest natężeniem prądu zarejestrow anego bezpośrednio przed drugą aplikacją.
Stopień powrotu receptorów do stanu niezwiązanego, mierzony
param etrem R, był znacznie zwiększony dla prądów mierzonych w obecności ßC D (Ryc. 6). A lOinM G A B A ! +500)iM PCD lOOnis В O.S li «.0 r
z
i • kontrola o 50QnMpCT) У А ---1--- 1--- 7У 0 200 400 1000Czas pomiędzy impulsami [ins]
R y c. 6. A - Prz yk ład ow e zn orm aliz ow ane odpow ie dzi prąd ow e re jestrow a ne w w aru nkac h ko ntroln ych i w ob ec noś ci 5 00 |iM ßC D . В - W ykres zależn ości w ielko ści p aram etru reco very od długośc i interw a lu cza sow eg o pom ięd zy pulsam i dla o dpo w ie dzi prąd ow y ch reje strow a nych w w aru nkac h ko ntro lnyc h i w obe cnoś ci ßCD .
W celu w yznaczenia wpływu ßCD na szybkość w iązania zarejestrow ano odpowiedzi prądow e wywołane niskim stężeniem GABA - Ю цМ. W całym zakresie badanych stężeń ßCD , jej wpływ był w iększy niż w przypadku nasycającego stężenia GABA (Ryc. 7). Ponadto w przypadku nienasycającego [GABA] efekt wydaje się być bliski nasycenia ju ż dla 500 цМ ßCD . Silniejszy wzrost am plitudy przy ЮцМ GABA w porów naniu z odpowiedziam i na nasycające stężenia wskazuje, że ßCD może wpływać na kinetykę wiązania agonisty.
Analiza odpowiedzi prądowych na długie aplikacje nasycającego [GABA] (Ryc. 5), wykazała, że ßCD wyraźnie spowolniła w ejście do stanu zdesensytyzowanego sugerując zm niejszenie wartości d2. M odel Jonesa i W estbrooka wskazuje, że desensytyzacja w zasadniczym stopniu może wpływać na am plitudę i kinetykę odpowiedzi prądowych. Zatem spadek wartości stałej d 2 może objaw iać się jako wzrost wartości ss/peak (Ryc. 5C) oraz jako wzrost am plitudy odpowiedzi prądowych dla nasycającego stężenia agonisty (Ryc. 2).
А
В
+ p C D i -. .-i k o n tr o la
R y c. 7. A - Prz ykłado w e przebie gi prądo w e zareje strow an e w odp ow ie dzi na ap likację 10|iM G A BA i k oap lika cję 50 0 |iM ßC D . В - P orów na nie w zględn ych w artości a m plitu d o dpo w ied zi prąd ow y ch reje strow a ny ch dla ró żneg o stę żen ia ßC D .
Am plitudy odpow iedzi prądowych wywołane niskim stężeniem GABA (Ю цМ) były wzm acniane w obecności ßCD w znacznie większym stopniu, niż am plitudy odpowiedzi prądowych wywołanych nasycającym [GABA] (Ryc. 2 i Ryc. 7), co m oże wskazyw ać na wzrost pow inow actwa GABA do receptora przez ßCD . W zrost am plitudy odpowiedzi prądowych na ЮцМ GA BA osiąga maksimum nasycenia ju ż przy 500|J.M ßCD, podczas gdy wpływ ßCD , na kinetykę desenytyzacji był m onotoniczny w całym przedziale stężeń. Taka,
zależność może być wytłum aczona wiązaniem ßCD do różnych
allosterycznych m iejsc wiążących charakteryzuj ąch się różnym
powinowactwem . Nasze wyniki w skazują na to, że pow inowactw o ßCD do miejsca wiążącego m odulującego wiązanie agonisty do receptora GA B Aa jest większe niż w przypadku m iejsca m odulującego jego desensytyzację. Taki
m echanizm wpływu ßC D na proces wiązania agonisty i desensytyzacji może
tłumaczyć niem onotoniczny charakter m odulacji powolnej składowej
deaktywacji (ts)ow) przez ßCD (Ryc. 4D). Jednoczesne wzm ocnienie etapu wiązania i spow olnienie kinetyki desensytyzacji przy stężeniach ßCD do 5(ЮцМ, jest przyczyną zaobserwow anego wyraźnego spow olnienia wartości Tsiow N atom iast obserw ow alne przyśpieszenie powolnej składowej procesu deaktyw acji (Ryc. 3D) przy zwiększonych stężeniach ßCD , jest skutkiem dalszego spowalniania procesu desensytyzacji, podczas gdy etap wiązania agonisty nie ulega dalszym zm ianom (efekt ßCD na ten proces uległ wysyceniu przy niższym stężeniu). Pomimo, że prezentowane wyniki w skazują na silny wpływ ßC D na bram kowanie receptora G AB Aa to jednak molekularny m echanizm w pływu ßC D na strukturę tego receptora pozostaje niewyjaśniony i wym agać będzie dodatkowych badań nad relacją struktura-funkcja tej m akrom olekuły(np. technikam i ukierunkowanej mutacji).
Piśmiennictwo
1. B arbuti A., G rav ante B„ R iolfo M ., M ilanesi R., T erragni B., D iFranc esc o D „ (2004) L oca lizatio n o f p ace m a ke r ch an ne ls in lipid rafts reg ulates c hann el kinetics. Circ. Res. 94:
1325-1331.
2. B row n D .A., L o nd on E., (2 000) Structu re and function o f sp hing o lipid- and c ho leste rol-ric h m em bra ne rafts. J. B io.I Chem. 275: 17221-177224.
3. C lem en ts J.D ., (1 9 96 ) T ran sm itte r tim e course in the synap tic cleft: its role in central synaptic function. T ren ds N e u ro sc i 19: 163-171.
4. D ouhal A., (2 004 ) U ltrafas t gu est dyna m ics in c yclodex trin n anoc avities. C hem. Rev. 104: 1955-1976.
5. Fie lding C .J., Fie ldin g P.E., (2 004) M em bra ne cho lestero l and th e re gu latio n o f signal tran sd u ction . B ioch em . Soc. Trans. 32: 65-69.
6. H ajdu P., V arga Z ., Pieri C., Panyi G., G as par R. Jr., (200 3) C ho les te ro l m odifies the gating o f K v l.3 in hu m a n T lym phocy tes. P fliigers A rch. 445: 674-6 82.
7. H arada A. (2 001 ) C y clo de xtrin-ba sed m o lecula r m achines. A cc. Chem. Res. 34: 45 6-4 64. 8. Jon es M .V ., W es tbro ok G .L ., (1 995) D esensitized states p ro lo ng G A B A A c hann el re sponses
to b rie f ag on is t pulses. N e uro n 15: 181-191.
9. K a m io nka A., Dahl M .K ., (2 001) B acillus subtilis co ntains a c yc lo de xtrin-bin d ing protein w hich is pa rt o f a pu ta tiv e A B C -tra nsporter. F E M S M icrobiol. Lett. 204: 55-60.
10. K ilsdonk E .P., Y ancey P.G ., S toud t G .W ., B angerter F.W ., J ohn so n W .J., Phillips M .C., R o thbla t G .H ., (1 99 5 ) C e llula r cho lestero l efflux m ediated by c yclode xtrins. J. Biol. Chem. 270: 17250-17256 .
11. L ocke D., K oreen I.V ., L iu J.Y ., H arris A.L., (2 004) R e vers ible po re block o f con nexin ch ann els by c yclod extrins. J. Biol. Chem. 279: 228 83-2 289 2.
12. M ozrzym as J.W ., (2 004 ) D ynam ism o f G A B A (A ) re cep to r ac tiv ation sha pe s the “p erson ality” o f inhib itory synapses. N eu ro ph ar m aco lo gy 47: 94 5-960 .
13. M ozrzym as J.W ., B arberis A., M ercik K., Z arnow sk a E .D., (2 003 a) B ind ing sites, singly b ou nd states, and co nform ation c ou plin g shape G A B A -ev oked cu rren ts . J. N europ hysiol. 89: 871-8 83.
14. M ozrzym as J.W ., Ż arn o w s ka E .D., Pytel M ., M ercik K., (20 03b ). M odu la tio n o f G A B A a re cepto rs by hyd roge n ion s rev eals synaptic G A B A trans ien t and a crucial ro le o f the de sen siliza tio n process. J. N eu rosc i. 23: 79 81-79 92.
15. Pajatsch M ., G e rha rt M ., Peist R., H orla chcr R., B oos W ., Bock A., (1 998) T he pe riplasm ic cy clod extrin bind ing p rotein C ym E from K lebsiella ox yto ca and its ro le in m altod extrin and cy clo dex trin tra nsp ort. J. B acteriol. 180: 26 30-2 635.
16. R edenti E ., Sz en te L., Sze jtli J., (2 001) C yclod extrin c om p lex es o f salts o f a cid ic drugs. T herm od ynam ic p rope rties , structural features, and p harm aceu tical a pp lica tion s. J. P harm.
Sei. 90: 979 -986 .
17. R om anen ko V .G ., R othbla t G.H ., L evitan I., (2002) M odu la tion o f end othe lial inw ard- re ctifie r K+ c urren t by op tica l isom ers o f cholesterol. B iophys. J. 83: 3 21 1-3 222 .
18. Shu H.J., E isenm a n L .N ., Jin ada sa D., C ovey D.F., Z orum s ki C .F ., M e nne rick S., (200 4) Slo w a ction s o f n eu ro active ste roids at G A B A a re c e p to rs ../. N eurosci. 24: 666 7-6 67 5. 19. Yancey P.G., R od rig ueza W .V., K ilsdo nk E.P., Stoud t G.W ., Jo h ns on W .J., Ph illip s M .C .,
R o thbla t G .H ., (19 96) C ellular cholestero l efflux m ediated by cyclod ex trins. D em o nstratio n O f kinetic poo ls and m echa nism o f efflux. J. Biol. Chem. 271: 16026-16034.
20. X ia F., G ao X., Kw an E., L am P.P., C han L., Sy K., Sheu L., W he ele r M .B ., G a isan o H.Y., T sush im a R .G., (2 004 ) D isru ptio n o f pa ncreatic beta-cell lipid rafts m o difies Kv2.1 channel g atin g and in su lin exocytosis. J. Biol. Chem. 279: 2 468 5-24 691 .
A dres do k o re sp o n de nc ji: K a ta rz y n a M e rc ik Sa m o dzieln a Pra co w nia Biofizyki U k ład u N e rw ow ego Ul. C h ału bińsk ie go 3
50 -36 8 W rocław Tel.: (48 7 1 )7 8 4 15 51 e-m ail: ka sia@ biofiz .am .w roc.pl
