Med. Weter. 2012, 68 (6) 359
Praca oryginalna Original paper
Rozwój molekularnych metod diagnostycznych po-zwoli³ na szybk¹ identyfikacjê patogenów powoduj¹cych wiele jednostek chorobowych zwierz¹t, w tym tak¿e ryb. Reakcja ³añcuchowa polimerazy, zwana PCR, pozwala na szybkie powielenie wybranego odcinka kwasu nukle-inowego bakterii, wirusów lub innych patogenów. Zop-tymalizowana reakcja PCR jest wysoce czu³a i specy-ficzna, a wyniki uzyskuje siê po kilku godzinach od otrzy-mania próbki do badañ. Metoda ta identyfikuje czynnik wywo³uj¹cy chorobê, ale nie daje ¿adnej informacji na temat stanu rozwoju choroby, st¹d te¿ nie wiadomo, czy jest ona skutkiem nosicielstwa, czy typowego zaka¿enia. Klasycznym postêpowaniem w diagnostyce wiruso-wych chorób ryb jest izolacja wirusów w sta³ych hodow-lach komórkowych oraz ich identyfikacja na przyk³ad metodami serologicznymi, takimi jak: test Elisa, immu-nofluorescencja czy seroneutralizacja. Niestety, w przy-padku zaka¿enia KHV dostêpne hodowle komórkowe nie s¹ wystarczaj¹co wra¿liwe, aby mog³y byæ wykorzy-stywane w rutynowej diagnostyce tej choroby, dlatego te¿ do identyfikacji wirusa KHV zalecane s¹ metody molekularne. Wiarygodnoæ tych technik nie zale¿y tylko od wykorzystywanych zestawów odczynników,
ale równie¿ od w³aciwego przygotowania materia³u do badañ oraz cis³ego przestrzegania procedur badawczych, w tym szczególnie aseptyki, aby unikn¹æ krzy¿owego zanieczyszczenia próbek.
Jak wynika z danych zamieszczonych w przewodniku diagnostycznym OIE, w celu izolacji materia³u genetycz-nego wirusa KHV pobiera siê tkanki i narz¹dy, takie jak: skórê, mózg, nerkê i skrzela (3, 4). Zalecane jest podda-nie ryb dzia³aniu stresu, na przyk³ad przez ich od³owie-nie i transport w staod³owie-nie ¿ywym do laboratorium. Skraw-ki pobranych tkanek i narz¹dów nale¿y umieciæ w utrwa-laczu organicznym, który dziêki w³aciwociom bakte-riobójczym odpowiednio je zakonserwuje i uchroni przed degradacj¹ materia³u genetycznego. Nale¿y przy tym zastosowaæ odpowiednie stê¿enie utrwalacza oraz zacho-waæ odpowiedni¹ proporcjê materia³u biologicznego do rozpuszczalnika organicznego; najbardziej wskazana jest proporcja 1 : 3 (5). W³aciwe zabezpieczenie materia³u biologicznego jest istotne ze wzglêdu na jakoæ prowa-dzonych analiz i ostateczny wynik badania wirusologicz-nego w kierunku KHV.
Celem badañ by³o okrelenie w³aciwoci utrwalaj¹-cych dwóch najczêciej stosowanych zwi¹zków
orga-Wp³yw utrwalaczy organicznych na stabilnoæ
materia³u genetycznego DNA herpeswirusa koi (KHV)
EWA BORZYM, JOANNA MAJ, MAREK MATRAS
Zak³ad Chorób Ryb Pañstwowego Instytutu Weterynaryjnego Pañstwowego Instytutu Badawczego, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy
Borzym E., Maj J., Matras M.
Impact of organic fixatives on the stability of the DNA genetic material of the koi herpes virus (KHV) Summary
Studies to identify the koi herpes virus using the PCR are continuously developed and introduced into routine diagnostics. Well-selected ways of storing tissues that are later used for DNA extraction and for the amplification reaction are critical points in methods using molecular biology techniques. The objective of the studies was to determine the impact of the fixating properties of the two most frequently used organic compounds, ethanol 96% and 80%, and isopropanol, on the stability of the nucleic acid isolated and on the preservation of the koi herpes virus in selected tissues and organs of carps. The experimental fish were infected via a bath in a small 20 l aquarium, where 5 ml of a KHV reference strain suspension had been added to the water. The presence and stability of the total DNA isolated from tissues and organs (skin, brain, kidney, gills) was checked using PCR with TK primers designed by Bercovier, and a product of 409 bp was obtained. Primers amplifying a gene fragment of beta-actin, which is found in smooth muscles and non-muscle cells of fish, were used as isolation control in multiplex PCR. On the basis of the studies it was observed that just on the day the samples were taken from the internal organs of fish and a month later, when they were collected from the archived organs, a product of 409 bp and 259 bp was obtained in all the samples analysed. The best organic fixative of organs and tissues sampled for molecular tests to identify KHV is ethanol 96%, even after half a year of archiving. Ethanol 80% and isopropanol also ensure sufficient fixation for up to a month. The most stable virus DNA is isolated from fish skin and gills.
Med. Weter. 2012, 68 (6) 360
nicznych etanolu i izopropanolu na stabilnoæ wy-izolowanego kwasu nukleinowego oraz utrzymywanie siê DNA herpeswirusa koi w wybranych tkankach i na-rz¹dach karpi.
Materia³ i metody
Badania przeprowadzono na 50 sztukach narybku karpia (K1). Zgodê na badania wyda³a II Lokalna Komisja Etyczna
do spraw dowiadczeñ na zwierzêtach w Lublinie. Ryby po-chodzi³y z gospodarstwa rybackiego, w którym wynik badañ w kierunku KHV w ci¹gu kilku ostatnich lat by³ ujemny. Ryby te umieszczono w akwarium o pojemnoci 350 l z filtrowan¹ wod¹. W akwarium utrzymywano temperaturê wody na po-ziomie 22°C ± 1. Po okresie adaptacji ryby zaka¿ono przez k¹piel w ma³ym akwarium o pojemnoci 20 l. W tym celu dodano do wody 5 ml zawiesiny wirusa KHV o mianie TCID50/ml wynosz¹cym 3 × 104. Szczep wirusa C250
po-chodzi³ z CEFAS (Centre for Envi-ronment, Fisheries and Aquaculture Science) w Weymouth UK. Mianowanie wiru-sa przeprowadzono w sta³ej hodowli komórkowej CCB (Common Carp Brain). Czas ekspozycji zawiesiny wirusa na ryby wynosi³ 30 minut. Po 9 dniach wyst¹pi³y pierwsze kliniczne objawy choroby. W 12. dniu obserwacji wszystkie ryby umiercono i sporz¹dzono próbki do badañ wirusolo-gicznych. Poszczególne próbki tkanek i narz¹dów umiesz-czano w zakrêcanych probówkach o pojemnoci 50 ml, do których dodano kolejno: 30 ml izopropanolu, etanolu 80% i etanolu 96%. Do jednej laboratoryjnej próbki pobrano ma-teria³ od dwóch ryb. W sumie sporz¹dzono 48 próbek. Prób-ki przechowywano w temperaturze 4-8°C. Obecnoæ wirusa KHV w archiwizowanych tkankach sprawdzano po 1, 2, 3 i 6 miesi¹cach, i oceniano stabilnoæ wyizolowanego DNA, który archiwizowano w temperaturze 20°C ± 2 przez szeæ miesiêcy.
Materia³ genetyczny wirusa zosta³ wyizolowany za pomoc¹ zestawu QIAamp DNA Mini Kit firmy Qiagen, wed³ug in-strukcji producenta. Nastêpnie wszystkie badane próbki pod-dano identyfikacji w kierunku wirusa KHV metod¹ PCR ze starterami TK zaprojektowanymi przez Bercoviera i otrzy-mano produkt reakcji o masie molekularnej 409 pz (2). Jako kontrolê izolacji, w reakcji multiplex PCR, zastosowano star-tery amplifikuj¹ce fragment genu beta-aktyny, która wystê-puje w miêniach g³adkich oraz komórkach niemiêniowych ryb. W obrazie pr¹¿kowym na ¿elu agarozowym widoczny jest produkt o masie molekularnej 259 pz. Reakcja PCR prze-biega³a w 35 cyklach, w nastêpuj¹cych warunkach tempera-turowych: denaturacja 95°C, przy³¹czanie starterów 52°C, synteza DNA 72°C. Metoda ta jest polecana przez OIE do rutynowej diagnostyki infekcji KHV (1).
Po amplifikacji mieszaninê reakcyjn¹ nanoszono na 2% ¿el agarozowy i poddano elektroforezie w buforze TBE przy napiêciu pr¹du 120 V przez 1 godzinê. Wielkoæ produktów PCR okrelano na podstawie porównania ich lokalizacji wzglêdem markera masowego (100 pz). Wynik uznawano za dodatni, je¿eli w ¿elu widoczny by³ pr¹¿ek DNA o wiel-koci 409 pz, a przy reakcji multipleks dodatkowo 259 pz.
Wyniki i omówienie
Na podstawie przeprowadzonych badañ stwierdzono, i¿ wszystkie testowane utrwalacze organiczne wystar-czaj¹co dobrze zabezpieczy³y pobrany materia³ do ba-dañ w kierunku KHV. Ma to szczególne znaczenie przy zastosowaniu kontroli wewnêtrznej reakcji z
wykorzy-staniem genu beta-aktyny. Z przeprowadzonych badañ wynika, i¿ tylko w dniu pobrania próbek z narz¹dów wewnêtrznych ryb oraz miesi¹c póniej z zarchiwizo-wanych narz¹dów, we wszystkich analizozarchiwizo-wanych prób-kach otrzymano produkt o wielkoci 409 pz i 259 pz. Po sprawdzeniu badanych próbek konwencjonaln¹ metod¹ PCR, bez obecnoci kontroli wewnêtrznej reakcji, czyli beta-aktyny, stwierdzono, i¿ najbardziej optymalne jest przetrzymywanie narz¹dów do 2 miesiêcy, poniewa¿ we wszystkich badanych próbkach otrzymano wynik dodatni w kierunku KHV. W przypadku reakcji z zastosowaniem dwóch par primerów próbka ze skrzeli przetrzymywa-nych w 80% etanolu by³a ujemna. W kolejprzetrzymywa-nych miesi¹-cach dowiadczenia obserwuje siê, ¿e herpeswirus koi jest najlepiej wykrywalny i najd³u¿ej utrzymuje siê w skórze oraz skrzelach zaka¿onych karpi, najmniejsze za stê¿enie wirusa jest w mózgu i nerce. Po pó³rocz-nym okresie archiwizacji narz¹dów i tkanek w ró¿nych
Ryc. 1. Produkty PCR ze starterami TK (409 pz) w 6. miesi¹-cu dowiadczenia (materia³ genetyczny pochodzi³ z archiwi-zowanych próbek DNA z pierwszego miesi¹ca badañ) Objanienia: M marker 100 pz (Fermentas); K() kontrola negatywna; K(+) kontrola pozytywna (DNA referencyjnego szczepu wirusa KHV); 1 skóra, 2 mózg, 3 nerka, 4 skrzela
Ryc. 2. Produkty PCR ze starterami TK (409 pz) oraz beta--aktynowymi (259 pz) w 6. miesi¹cu dowiadczenia (materia³ genetyczny pochodzi³ z archiwizowanych próbek DNA z pierwszego miesi¹ca badañ)
Med. Weter. 2012, 68 (6) 361
rozpuszczalnikach organicznych, tj. izopropanolu, 96% etanolu, 80% etanolu i przeprowadzeniu izolacji ca³ko-witego DNA, obecnoæ wirusa KHV stwierdzono w skó-rze i skskó-rzelach, które by³y umieszczone w 96% etanolu (tab. 1, ryc. 2). Materia³ genetyczny DNA wirusa KHV zarchiwizowany w temperaturze 20°C ± 2 utrzymywa³ siê do koñca dowiadczenia. Jednak¿e w reakcji multi-pleks PCR z wykorzystaniem primerów TK oraz beta--aktynowych pr¹¿ki na ¿elu agarozowym wiadcz¹ce o obecnoci DNA wirusa KHV nie by³y widoczne w próbkach z mózgu i nerki.
W przypadku, gdy materia³em wyjciowym do badañ jest krew i tkanki ssaków, etanol w wy¿szych stê¿eniach i izopropanol s¹ najlepszymi zwi¹zkami konserwuj¹cymi DNA. Nie s¹ to odczynniki toksyczne i z ³atwoci¹ mog¹ byæ wykorzystywane w pracy poza laboratorium (6).
Ponadto z danych umieszczonych w pimiennictwie (6) wynika, ¿e odpowiednie utrwalenie ca³kowitego materia³u genetycznego jest mo¿liwe wtedy, gdy s¹ archiwizowane ma³e iloci tkanek i narz¹dów, przez co jest wiêksza powierzchnia kontaktu z utrwalaczem. Dobre efekty ekstrakcji DNA uzyskuje siê wówczas, gdy wie¿o pobrany materia³ po 24 godzinach przenoszony jest do nowych probówek z etanolem, a nastêpnie prze-chowywany w temperaturze 1-8°C. W celu redukcji degradacji DNA podczas ekstrakcji zaleca siê przenie-sienie badanego materia³u na 24 godziny przed izolacj¹ DNA do buforu, do lizy.
W³aciwe utrwalenie, a nastêpnie ekstrakcja materia-³u genetycznego, w tym przypadku DNA, to wa¿ny etap w efektywnej pracy laboratoryjnej. Zagadnienie to jest dobrze opisane w literaturze w odniesieniu do tkanek ludzkich (7) czy tkanek miêkkich ssaków (6). Zaprezen-towane wyniki mog¹ pos³u¿yæ okreleniu czasu archi-wizacji badanych próbek, tkanek i narz¹dów karpi oraz wyizolowanego DNA w przypadku ewentualnych badañ powtórnych lub w przypadku przygotowywania metody do walidacji.
Tab. 1. Porównanie obecnoci materia³u genetycznego wirusa KHV w tkankach i narz¹dach karpia 409 pz i 259 pz w archi-wizowanych narz¹dach i tkankach karpi, umieszczonych w ró¿nych utrwalaczach organicznych, po ró¿nym czasie
z c a l a w rt U Narz¹dy Wdniubadania o P . s e i m 1 2mies. 3mies. 6mies. z p 9 0 4 259pz 409pz 259pz 409pz 259pz 409pz 259pz 409pz 259pz l o n a p o r p o zI a r ó k s + + + + + + + + + g z ó m + + + + + + + + a k r e n + + + + + + + + a l e z r k s + + + + + + + + + % 0 8 l o n a t E a r ó k s + + + + + + + + + g z ó m + + + + + + + + a k r e n + + + + + + + + a l e z r k s + + + + + + + % 6 9 l o n a t E a r ó k s + + + + + + + + + + g z ó m + + + + + + + + a k r e n + + + + + + + + + a l e z r k s + + + + + + + + + +
Tab. 2. Obecnoæ materia³u genetycznego wirusa KHV w ar-chiwizowanych próbkach wyizolowanego DNA po okresie 6 miesiêcy y d ¹ z r a N Bezpirmerówb-acitn Zpirmeramib-acitn a r ó k S + + g z ó M + a k r e N + a l e z r k S + +
Reasumuj¹c, najlepszym utrwalaczem organicznym narz¹dów i tkanek, pobranych w kierunku badañ mo-lekularnych identyfikuj¹cych KHV jest etanol 96%, nawet po pó³rocznym okresie archiwizowania. Etanol 80%, jak i izopropanol równie¿ wykazuj¹ wystarczaj¹ce utrwalenia do miesi¹ca czasu. Najbardziej stabilny DNA wirusa izolowany jest ze skóry oraz skrzel ryb.
Pimiennictwo
1.Anon.: OIE Manual of diagnostic tests for aquatic animals. World Organization for Animal Health, Paris 2009.
2.Bercovier H., Fishman Y., Nahary R., Sinai S., Zlotkin A., Eyngor M., Gilad O., Eldar A., Hedrick R. P.: Cloning of the koi herpesvirus (KHV) gene encoding thymidine kinase and its use for a highly sensitive PCR based diagnosis. BMC Microbiol. 2005, 5, 13.
3.Gilad O., Yun S., Zagmutt-Vergara F. J., Leutenegger C. M., Bercovier H., Hedrick R. P.: Concentrations of a Koi herpesvirus (KHV) in tissues of experi-mentally infected Cyprinus carpio koi as assessed by real-time TaqMan PCR. Dis. Aquat. Org. 2004, 60, 179-187.
4.Gray W. L., Mullis L., LaPatra S. E., Groff J. M., Goodwin A.: Detection of koi herpesvirus DNA in tissues of infected fish. J. Fish. Dis. 2002, 25, 171--178.
5.Kempter J., Kie³piñski M., Panicz R., Sadowski J.: Okrelenie nosicielstwa i podatnoci na infekcje koi-herpes-virusem wybranych gatunków ryb karpio-watych i ich krzy¿ówek pochodz¹cych z wód otwartych i obiektów hodowla-nych po³o¿ohodowla-nych w zlewni Odry. Wyd. AR, Szczecin 2008.
6.Kilpatrick C. W.: Noncryogenic reservation of mammalian tissues for DNA extraction: an assessment of storage methods. Bioch. Gen. 2002, 40, 53-62. 7.Smith L. J., Braylon R. C., Nutkis J. E., Edmundson K. B., Downing J. R.,
Wakeland E. K.: Extraction of cellular DNA from human cells and tissues fixed in ethanol. A. Bioch. 1987, 160, 135-138.
Adres autora: mgr in¿. Ewa Borzym, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy; e-mail: ewa.borzym@piwet.pulawy.pl
