Med. Weter. 2012, 68 (12) 751
Praca oryginalna Original paper
Czynnikiem etiologicznym powoduj¹cym zakan¹ martwicê uk³adu krwiotwórczego (IHN) jest wirus za-klasyfikowany do rodzaju Novirhabdovirus z rodziny Rhabdoviridae. Jego wirion ma charakterystyczny kszta³t pocisku, a genom zawieraj¹cy pojedyncz¹ niæ RNA koduje 6 bia³ek. Wielkoæ genomu w przybli-¿eniu wynosi 11 000 nukleotydów, które koduj¹ nastê-puj¹ce bia³ka: nukleoproteinê (N), fosfoproteinê (P), bia³ko macierzy (M), glikoproteinê (G), bia³ko NV (NV), polimerazê RNA (L) (12).
Zgodnie z dyrektyw¹ Rady 2066/88/WE z dnia 24 pa-dziernika 2006 r. w sprawie wymogów w zakresie zdro-wia zwierz¹t akwakultury i produktów akwakultury oraz zapobiegania niektórym chorobom zwierz¹t wodnych i zwalczania tych chorób, na zaka¿enie wirusem IHN wra¿liwe s¹ ryby nastêpuj¹cych gatunków: ³oso keta (Oncorhynchus keta), ki¿ucz (O. kisutch), ³oso japoñ-ski (O. masou), pstr¹g têczowy (O. mykiss), ³oso nerka (O. nerka), ³oso chinook (O. tshawytscha) oraz ³oso atlantycki (Salmo salar).
Najbardziej wra¿liwe na zaka¿enie wirusem IHN s¹ m³ode osobniki, u których IHN przebiega najczêciej
w postaci ostrej, powoduj¹c do 90% niêæ. U starszych pstr¹gów i smoltów ³ososi choroba wystêpuje spora-dycznie (2). Czynnikami warunkuj¹cymi wystêpowa-nie choroby jest wiek ryb i temperatura wody. Strefa wystêpowania IHN jest ograniczona do terenów, gdzie temperatura wody spada okresowo przynajmniej do 10°C.
Zakan¹ martwicê uk³adu krwiotwórczego stwierdza siê w Ameryce Pó³nocnej, Azji i Europie. W Polsce po raz pierwszy IHN stwierdzono w 2001 r. u wylêgu pstr¹ga têczowego. W latach 2008-2011 odnotowano 17 przypadków IHN w województwach: pomorskim, zachodniopomorskim, l¹skim, ma³opolskim i wielko-polskim. Z danych opublikowanych przez G³ówny Inspektorat Weterynarii w biuletynie Stan zakanych chorób zwierzêcych wynika, i¿ w 2008 r. odnoto-wano kolejny przypadek IHN w województwie wiel-kopolskim, a w 2009 r. stwierdzono 3 przypadki w województwach: zachodniopomorskim, l¹skim i ma³opolskim. W 2010 r. wykryto obecnoæ wirusa w 4 gospodarstwach rybackich w województwie za-chodniopomorskim oraz 1 w województwie
pomor-Przydatnoæ badañ serologicznych
w diagnostyce zakanej martwicy uk³adu
krwiotwórczego ryb ³ososiowatych (IHN)
MAREK MATRAS, JOANNA MAJ, MAGDALENA STACHNIK, EWA BORZYM, AGNIESZKA LEWANDOWSKA*, WITOLD MAZUR*
Zak³ad Chorób Ryb Pañstwowego Instytutu Weterynaryjnego Pañstwowego Instytutu Badawczego, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy
*Zak³ad Higieny Weterynaryjnej w Szczecinie Oddzia³ w Koszalinie, ul. Po³czyñska 72, 75-816 Koszalin
Matras M., Maj J., Stachnik M., Borzym E., Lewandowska A., Mazur W.
Study on the usefulness of seroneutralization tests in the diagnostics of infectious haematopoietic necrosis (IHN)
Summary
The purpose of the project was to study the correlation between the presence of the IHN virus and the presence of antibodies against this virus in fish sera. Experimental infection of rainbow trout was performed at temperatures of 12°C±1 and 15°C±1. The trouts sera were collected at 7-day intervals. Samples from farms naturally infected with IHNV were also tested. The presence of antibodies against IHNV was determined by seroneutralization and the virus was detected by isolation in cell culture. It was found that in the experimentally infected rainbow trout, antibodies against IHN were found earlier in the higher temperature, after 21 days post infection, whereas the presence of IHNV was observed to last longer in the lower temperature. In the study performed on 30 samples of sera from IHN-infected farms, antibodies were detected in 12 samples. Detection of antibodies against IHNV in fish serum can be a helpful tool supporting recommended techniques.
Med. Weter. 2012, 68 (12) 752
skim. W 2011 r. odnoto-wano IHN w 6 gospodar-stwach w województwie zachodniopomorskim oraz w 2 w województwie pomorskim (ryc. 1).
Wykryty w 2008 r. wi-rus IHN w województwie wielkopolskim spowo-dowa³ masowe niêcia u pstr¹ga o masie cia³a 30-50 g. Przypadek ten mia³ najprawdopodobniej zwi¹zek z importem ikry z krajów Europy Zachod-niej, gdzie IHNV wystê-puje od wielu lat. Kolejne ogniska choroby, które wyst¹pi³y w latach 2009--2011, s¹ prawdopodob-nie wynikiem rozprze-strzeniania siê wirusa w obrêbie polskich gos-podarstw rybackich za po-rednictwem transportu zaka¿onej ikry, jak i za-ka¿onego materia³u obsa-dowego. Niepokoj¹cy jest fakt, i¿ pomimo wdra¿a-nia procedur natychmia-stowego zwalczania cho-roby w gospodarstwie, w którym wykryto wirus
IHN, choroba rozprzestrzenia siê na terenie kraju. Wyjanieniem zaistnia³ej sytuacji mo¿e byæ fakt, i¿ w gospodarstwie rybackim tylko niewielki procent zia-ren ikry oraz niewielki odsetek wylêgu zara¿ony wiru-sem IHN wystarczy, by choroba stale wystêpowa³a w obiekcie. Ponadto bezobjawowe nosicielstwo u ryb poddanych stresowi transportowemu mo¿e staæ siê ród-³em zaka¿enia dla obiektów rybackich.
Wspólnotowe Laboratorium Referencyjne w zakre-sie chorób ryb (EURL) oraz wiatowa Organizacja Zdrowia Zwierz¹t, O.I.E., rekomenduj¹ do rutynowej diagnostyki izolacjê wirusa w hodowlach komórko-wych, a nastêpnie jego identyfikacjê przy u¿yciu metod: seroneutralizacji, immunofluorescencji, testu ELISA, metod biologii molekularnej (3, 12, 15). Pro-wadzone dotychczas badania w zakresie odpowiedzi humoralnej ryb ³ososiowatych na zaka¿enie wirusami z rodziny Rhabdoviridae potwierdzi³y skutecznoæ ró¿nych metod diagnostycznych, tj.: seroneutralizacji, testu ELISA, immunofluorescencji, western blotting, które opieraj¹ siê na wykrywaniu obecnoci swoistych przeciwcia³ (5, 6, 8, 9, 11, 13, 14). Pomimo zalet tech-nik wykrywania obecnoci przeciwcia³ u ryb, tj. w przy-padku, gdy izolacja wirusa u ryb w temperaturze wody powy¿ej 15°C jest trudna oraz w przypadku
endemicz-nego wystêpowania zaka¿enia IHN, nie s¹ one reko-mendowane do rutynowej diagnostyki z powodu braku dostatecznej iloci badañ pozwalaj¹cych na optyma-lizacjê oraz walidacjê tych metod. W zwi¹zku z tym celem pracy by³o okrelenie przydatnoci badania po-ziomu przeciwcia³ swoistych w surowicy ryb do diag-nostyki IHN oraz zale¿noci pomiêdzy wystêpowaniem wirusa a obecnoci¹ przeciwcia³ w populacji ryb.
Materia³ i metody
Do badañ wykorzystano 160 sztuk narybku pstr¹ga tê-czowego (Oncorhynchus mykkis) o masie cia³a 40-60 g, po-chodz¹cego z gospodarstwa, w którym nie wystêpowa³a cho-roba. Ryby zaka¿ono wirusem IHN po uprzednio przepro-wadzonym okresie kwarantanny trwaj¹cym 4 tygodnie. Ryby przetrzymywano w temperaturze wody 12°C ± 1 i 15°C ± 1. Zaka¿enie ryb przez k¹piel przeprowadzano w 10 l base-nach, do których dodano oko³o 5 ml zawiesiny wirusa IHN, o mianie TCID50/ml wynosz¹cym 8,6 × 106. Izolat wirusa
pochodzi³ z przypadku klinicznego zaka¿enia IHN stwier-dzonego w 2008 r. w jednym z gospodarstw pstr¹gowych. Czas ekspozycji ryb na zawiesinê wirusa wynosi³ 30 minut, po czym ryby przeniesiono do basenów o pojemnoci 1000 l. W trakcie prowadzenia dowiadczenia ryby przyjmowa³y pokarm w postaci granulatu. Grupy kontrolne stanowi³y ryby pochodz¹ce z tej samej populacji, co ryby zaka¿ane.
Prze-Ryc. 1. Rozprzestrzenienie przypadków IHN w Polsce w latach 2008-2011. Dane oraz mapa Polski z podzia³em na powiaty na podstawie biuletynu Stan zakanych chorób zwierzêcych (1)
Med. Weter. 2012, 68 (12) 753 bywa³y one w takich samych warunkach
i poddawane by³y w równym stopniu dzia-³aniu stresu manipulacyjnego.
Krew do badañ serologicznych oraz narz¹dy wewnêtrzne ryb do badañ wiru-sologicznych pobierane by³y w odstêpach tygodniowych od dnia zaka¿enia wirusem IHN przez 5 tygodni. Krew, pobran¹ z na-czyñ ogonowych ryb umieszczano w pro-bówkach, które przetrzymywano 2 godzi-ny w temperaturze pokojowej, a nastêp-nie przez 12 godzin w temperaturze 4°C ± 1. Po tym czasie oddzielono powsta³y skrzep i wirowano w temperaturze 4°C ± 1, przy obrotach 2000 × g przez 30 mi-nut. Otrzyman¹ w ten sposób surowicê inaktywowano w temperaturze 45°C ± 1 przez 30 minut.
Poziom przeciwcia³ w testach oznaczo-no przy u¿yciu metody seroneutralizacji (SN). Do testu u¿yto sta³ej dawki wirusa IHN oraz wzrastaj¹cych rozcieñczeñ su-rowicy. Materia³em pochodz¹cym z na-rz¹dów wewnêtrznych ryb zaka¿ano wra¿-liwe linie komórkowe, a wyst¹pienie zmian cytopatycznych spowodowanych namno¿eniem siê wirusa IHN potwier-dzano testem ELISA oraz technik¹ RT--PCR.
W kolejnym etapie dowiadczenia przeprowadzono badanie surowic krwi ryb (9-11 osobników) pochodz¹cych z 3 gos-podarstw rybackich, w których wczeniej-sze badania wykaza³y obecnoæ wirusa IHN. W gospodarstwie nr 1 wyst¹pi³y nie-znaczne niêcia przy braku objawów
cho-robowych, natomiast w gospodarstwie nr 2 i 3 zaobserwo-wano objawy chorobowe charakterystyczne dla IHN oraz niêcia wynosz¹ce, odpowiednio, 40% i 60% obsady. Krew oraz narz¹dy wewnêtrzne do badañ wirusologicznych zosta-³y pobrane po 4-6 tygodniach od wyst¹pienia objawów cho-robowych u ryb. Z pobran¹ krwi¹ postêpowano analogicz-nie, jak w wy¿ej opisanym dowiadczeniu laboratoryjnym. Materia³em pochodz¹cym z narz¹dów wewnêtrznych ryb zaka¿ano wra¿liwe linie komórkowe, a wyst¹pienie zmian cytopatycznych spowodowanych namno¿eniem siê wirusa IHN potwierdzano testem ELISA oraz technik¹ RT-PCR. Temperatura wody w trakcie pobierania próbek bo badañ z gospodarstw rybackich wynosi³a 15-17°C.
Wyniki i omówienie
Na podstawie eksperymentalnego zaka¿enia pstr¹ga têczowego wirusem IHN w temperaturze 12°C ± 1 stwierdzono obecnoæ przeciwcia³ przeciwko wiruso-wi IHN u 4 z 20 badanych. W próbkach pobranych z na-rz¹dów wewnêtrznych ryb wykazano obecnoæ tego wirusa w 7., 14., 21., 28. i 35. dniu od zaka¿enia, na-tomiast pierwsze przeciwcia³a anty IHNV pojawi³y siê w 28. dniu po zaka¿eniu.
Z kolei u zaka¿onych w temperaturze 15°C ± 1 pstr¹-gów têczowych stwierdzono u 5 ryb obecnoæ
przeciw-cia³, które pojawi³y siê ju¿ w 21. dniu po zaka¿eniu. W badanych narz¹dach stwierdzono obecnoæ wirusa IHN w 7., 14., 21. dniu od zaka¿enia (tab. 1).
U ryb z grup kontrolnych nie stwierdzono obecnoci przeciwcia³ przeciwko wirusowi IHN, jak równie¿ nie wyizolowano wirusa w liniach komórkowych.
Wród 30 badanych metod¹ seroneutralizacji suro-wic pochodz¹cych z 3 obiektów rybackich, w których stwierdzono obecnoæ wirusa IHN, przeciwcia³a prze-ciwko IHN wykryto w 12 próbkach (tab. 2). W 30% próbek surowicy pobranych od pstr¹gów z gospodar-stwa nr 2 po 4 tygodniach od wyst¹pienia objawów chorobowych stwierdzono obecnoæ przeciwcia³ anty IHN. W próbkach pobranych w 5. (gospodarstwo nr 3) i 6. (gospodarstwo nr 1) tygodniu od momentu ob-serwacji objawów chorobowych wykryto obecnoæ przeciwcia³ anty IHN w 45% przebadanych surowic. W próbkach pobranych z narz¹dów ryb w celu izolacji wirusa nie stwierdzono obecnoci patogenu.
Wyniki badañ próbek terenowych potwierdzaj¹ za-tem rezultaty uzyskane w dowiadczeniach laborato-ryjnych dotycz¹cych obecnoci przeciwcia³ przeciw wirusowi IHN u pstr¹gów.
Dane przedstawione w tab. 1 wskazuj¹ na zale¿noæ pomiêdzy temperatur¹ a odpowiedzi¹ humoraln¹ u ryb.
Tab. 1. Wyniki badañ w kierunku obecnoci swoistych przeciwcia³ (SN) oraz izo-lacji wirusa u pstr¹gów po eksperymentalnym zaka¿eniu wirusem IHN w tempe-raturze 12°C ± 1 i 15°C ± 1 2 1 °C±1 1 °5C±1 d o i n D a i n e ¿ a k a z Nruymbyer ij c a l o zi k i n y W a s u ri w h c a l w o d o h w h c y w o k r ó m o k N S k i n y W zaDkna¿ieondia Nruymbyer ij c a l o zi k i n y W a s u ri w h c a l w o d o h w h c y w o k r ó m o k N S k i n y W 7 1 + 7 1 + 2 2 3 3 4 4 4 1 5 + 4 1 5 + 6 6 7 7 8 8 1 2 9 + 1 2 9 + 0 1 10 1 1 11 + 2 1 12 + 8 2 3 1 + + 8 2 3 1 + 4 1 14 5 1 15 6 1 + 16 5 3 7 1 + 5 3 7 1 + 8 1 + 18 9 1 19 + 0 2 + 20
Med. Weter. 2012, 68 (12) 754
Z badañ eksperymentalnych wynika, i¿ w wy¿szej tem-peraturze przeciwcia³a anty IHN pojawiaj¹ siê wcze-niej, jak równie¿ obecnoæ wirusa jest mo¿liwa do zi-dentyfikowania w krótszym czasie ani¿eli w ni¿szej temperaturze. W porównaniu do zwierz¹t sta³ocieplnych u ryb obecnoæ przeciwcia³ stwierdza siê póniej oko³o 4.-6. tygodnia od momentu zaka¿enia i w du¿ej mierze jest to uzale¿nione od temperatury (10). Rezultaty na-szych badañ przeprowadzonych na rybach zaka¿onych w warunkach eksperymentalnych, jak i terenowych potwierdzaj¹ wyniki wy¿ej opisane, dotycz¹ce czasu, w jakim u ryb pojawiaj¹ siê pierwsze przeciwcia³a. Wy-krywanie przeciwcia³ anty IHN u ryb ma przewagê
Tab. 2. Wyniki badania surowic w kierunku obecnoci prze-ciwcia³ anty IHN u pstr¹gów pochodz¹cych z gospodarstw rybackich, w których stwierdzono IHN
r e m u N -r a d o p s o g a w t s ³ a i c w i c e z r p o n a i M e n o z d r e i w t s h c y n l ó g e z c z s o p u b y r d o s a z C a i n e i p ¹ t s y w w ó w a j b o h c y w o b o r o h c k e n u t a G 1 6tygodniod a i n e z d r e i w t s w ó w a j b o h c y n z c i n il k y w o z c ê t g ¹ rt s P 0 6 1 Psrt¹gródlany Psrt¹gródlany Psrt¹gtêczowy 0 6 5 2 Psrt¹gtêczowy Psrt¹gródlany Psrt¹gródlany 0 8 2 1 Psrt¹gtêczowy 0 8 Psrt¹gródlany Psrt¹gtêczowy 0 8 Psrt¹gtêczowy 2 4tygodnieod a i n e z d r e i w t s w ó w a j b o h c y n z c i n il k y w o z c ê t g ¹ rt s P 0 6 1 0 2 3 0 6 1 3 0 6 1 5tygodniod a i n e z d r e i w t s w ó w a j b o h c y n z c i n il k y w o z c ê t g ¹ rt s P 0 2 3 0 8 0 8
w porównaniu do metody izolacji wirusa w hodowli komórkowej, poniewa¿ patogen mo¿na stwierdziæ je-dynie w pocz¹tkowej fazie zaka¿enia. Natomiast lad infekcji w postaci przeciwcia³ u ryb mo¿na obserwo-waæ nawet rok od kontaktu z wirusem (6). Dodatko-wym atutem stosowania metod wykrywaj¹cych obec-noæ przeciwcia³ jest mo¿liwoæ przy¿yciowego pozy-skania materia³u do badañ oraz jego wiêksza stabilnoæ podczas transportu i przechowywania w stosunku do próbek pobieranych w celu izolacji wirusa (7).
W ostatnich latach liczba gospodarstw rybackich w Polsce, w których stwierdzono obecnoæ wirusa IHN, wykazuje tendencjê wzrostow¹. Szczególnie niepoko-j¹ce jest nios¹ce zagro¿enie bezobjawowe nosicielstwo u ryb, u których wra¿liwoæ na zaka¿enie wraz z wie-kiem zwiêksza siê. Wydaje siê, i¿ w zaistnia³ej sytuacji badanie obecnoci przeciwcia³ anty IHN u ryb jest przy-datnym uzupe³nieniem rekomendowanych metod diag-nostycznych.
Pimiennictwo
1.Biuletyn G³ównego Inspektoratu Weterynarii. Stan chorób zakanych zwie-rz¹t 2008-2011, Warszawa.
2.Burke J., Grischkowsky R.: An epizootic caused by infectious hematopoietic necrosis virus in an enhanced population of sockeye salmon, Oncorhynchus nerka (Walbaum), smolts at Hidden Creek, Alaska. J. Fish Dis. 1984, 7, 421--429.
3.Decyzja Komisji 2001/183/WE z dnia 22 lutego 2001 r. ustanawiaj¹ca plany pobierania próbek i metody diagnostyczne do celów wykrywania i potwier-dzania wystêpowania niektórych chorób ryb oraz uchylaj¹ca decyzjê 92/532/ EWG.
4.Dyrektywa Rady 2066/88/WE z dnia 24 padziernika 2006 r. w sprawie wymogów w zakresie zdrowia zwierz¹t akwakultury i produktów akwakul-tury oraz zapobiegania niektórym chorobom zwierz¹t wodnych i zwalczania tych chorób.
5.Enzmann P. J., Konrad M.: Antibodies against VHS in whitefish of the Lake of Constance, West Germany. Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol. 1990, 10, 24-25. 6.Enzmann P. J., Konrad M.: Longevity of antibodies in brown trout and rainbow trout following experimental infection with VHS-virus. Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol. 1993, 13, 193-194.
7.Fregeneda-Grandes J. M., Olesen N. J.: Detection of rainbow trout anti-bodies against viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) by neutralisation test is highly dependent on the virus isolate used. Dis. of Aquat. Org. 2007, 74, 151-158.
8.Hattenberger-Baudouy A. M., Dalton M., Merle G., Kinkelin P. de: Serum neutralization test for epidemiological studies of salmonid rhabdoviroses in France. Vet. Res. 1995, 26, 512-520.
9.Jørgensen P. E. V., Olesen N. J., Lorenzen N., Winton J. R., Ristow S.: Infec-tious hematopoietic necrosis (IHN) and Viral hemorrhagic septicemia (VHS): detection of trout antibodies to the causative viruses by means of plaque neutralization, immunofluorescence, and enzyme-linked immunosorbent assay. J. Aquat. Anim. Health 1991, 3, 100-108.
10.Lorenzen N., Lapatra S. E.: Immunity to rhabdoviruses in rainbow trout: the antibody response. Fish Shellfish Immunol. 1999, t. 9, nr 4, 345-360. 11.Lorenzen N., Olesen N. J., Jørgensen P. E. V.: Antibody response to VHS
virus proteins in rainbow trout. Fish Shellfish Immunol. 1993, 3, 461-473. 12.O.I.E., wiatowa Organizacja Zdrowia Zwierz¹t: International Aquatic
Animal Health Code, 2011, 14 ed.
13.Olesen N. J., Lorenzen N., Jørgensen P. E. V.: Detection of rainbow trout antibody to Egtved virus by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), immunofluorescence (IF), and plaque neutralization tests (50% PNT). Dis. Aquat. Org. 1991, 10, 31-38.
14.St-Hilaire S., Ribble C., Traxler G., Davies T., Kent M. L.: Evidence for a carrier state of infectious hematopoietic necrosis virus in chinook salmon Oncorhynchus tshawytacha. Dis. of Aquat. Org. 2001, 46, 173-179. Adres autora: Marek Matras, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy; e-mail: marek.matras@piwet.pulawy.pl
