Zastosowanie autofluorescencji tkankowej w ocenie podejrzanych zmian u pacjentów z nowotworami głowy i szyi

(1)

Zastosowanie autofl uorescencji tkankowej w ocenie

podejrzanych zmian u pacjentów z nowotworami

głowy i szyi

The use of tissue autofl uorescence for diagnosing suspected lesions

in patients with head and neck carcinomas

IZABELA NIEDŹWIECKA

2/

_{, JOANNA ZIMMER-NOWICKA}

1,2/

_{, DARIUSZ KACZMARCZYK}

1,2/

_,

ALINA MORAWIEC-SZTANDERA

1,2/

1/ _{Klinika Chirurgii Nowotworów Głowy i Szyi Uniwersytetu Medycznego w Łodzi}

2/ _{Oddział Laryngologii Onkologicznej Wojewódzki Szpital Specjalistyczny im M. Kopernika w Łodzi}

Wprowadzenie. Pomimo ciągłego doskonalenia metod

diagnostycznych w codziennej praktyce klinicznej nadal napo-tyka się trudności w ocenie rozległości zmiany nowotworowej i określeniu właściwego miejsca pobrania wycinków do badania histopatologicznego. Szczególnie trudną pod tym względem grupę stanowią pacjenci po leczeniu przeciwnowotworowym. Ostatnio zwrócono uwagę na autoﬂ uorescencję tkankową, która wykorzystuje działanie promieniowania UV na tkanki nowotworowe i dysplastyczne. Emitują one inne ilościowo i jakościowo promieniowanie niż tkanka zdrowa.

Cel pracy. W pracy dokonano oceny wpływu umiejscowienia,

rodzaju zastosowanego leczenia przeciwnowotworowego i zmian patologicznych na obecność ﬂ uorescencji tkanki no-wotworowej.

Materiał i metody. Do badania zakwaliﬁ kowano 47 chorych,

u których wykonano badanie fi beroskopowe z wykorzystaniem światła białego oraz światła wzbudzającego autofl uorescencję tkankową. W celu weryfi kacji zmian wykazujących obecność au-tofl uorescencji pobrano z miejsc świecenia materiał do badania histopatologicznego.

Wyniki. Wykazano, że metoda autoﬂ uorescencji tkankowej

zapewnia pełną czułość (100%) i swoistość (100%) wykrywania złośliwych zmian nowotworowych. Nie wykazano zależności pomiędzy występowaniem autoﬂ uorescencji a lokalizacją zmian patologicznych oraz zastosowanym leczeniem przeciwnowo-tworowym.

Wnioski. Uzyskane wyniki kwaliﬁ kują autoﬂ uorescencję jako

czułą i swoistą metodę diagnostyczną dla detekcji zmian nowo-tworowych w jamie ustnej, gardle i krtani. Pozwala ona również na monitorowanie pacjentów po przeprowadzonym leczeniu przeciwnowotworowym.

Słowa kluczowe: autoﬂ uorescencja tkankowa, nowotwory

głowy i szyi

Introduction. Despite a constant improvement of diagnostic

methods, one still faces problems in a daily clinical practice with the assessment of the extent of neoplastic lesion and ﬁ nding of a proper site to take a specimen for histopathology. It applies particularly to the patients who underwent anticancer therapy. Recently the attention has been focused on tissue autofluorescence involving the effect of UV radiation on neoplastic and dysplastic tissues. Those tissues emit the radiation with diﬀ erent characteristics than the healthy tissue.

Aim. In this study we assessed eﬀ ects of location of pathological

lesions on the presence of neoplastic tissue ﬂ uorescence.

Material and methods. The study group included 47 patients

examined with a fi beroscope with the use of both white light and light which induces the emission of tissue autofl uorescence. To verify the lesions which showed autofl uorescence, specimens for histopathological examination were taken from the emitting sites.

Results. It was proven that tissue autoﬂ uorescence provided

100% sensitivity and 100% speciﬁ city in diagnosing of tumor malignancy. No relation was, however, found between location of pathological lesions and anticancer treatment.

Conclusions. We conclude that autoﬂ uorescence is a useful,

high-sensitive and high-speciﬁ c method for the detection of neoplastic lesions in the oral cavity, the pharynx and the larynx. This method also enables follow-up of patients after anticancer treatment.

Key words: tissue autoﬂ uorescence, head and neck carcinoma

Adres do korespondencji / Address for correspondence Izabela Niedźwiecka

ul. Lipowa 14, 95-030 Gospodarz

tel. 600 371 473, e-mail: ceratomorpha@poczta.onet.pl © Otorynolaryngologia 2009, 8(1): 18-22

(2)

wotworowego i zmian patologicznych na obecność ﬂ uorescencji tkanki nowotworowej.

MATERIAŁ I METODY

Badaniem objęto pacjentów Kliniki Chirurgii Nowotworów Głowy i Szyi U.M. w Łodzi i Regional-nego Ośrodka OnkologiczRegional-nego WSS im M. Koperni-ka w Łodzi konsultowanych w latach 2006-2008. Do grupy badanej zakwaliﬁ kowano 47 osób w wieku 30-86 lat, w tym 21 kobiet w wieku 30-81 lat i 26 mężczyzn w wieku 40-86 lat. Średnia wieku w grupie badanej wynosiła 58,5 lat, w tym dla kobiet 59 lat oraz 58,1 lat dla mężczyzn.

Zmiany patologiczne w krtani i gardle dolnym stwierdzono u 32 osób, w jamie ustnej i gardle środ-kowym u 9 osób, w nosogardle u 2 osób. Przerzuty do węzłów chłonnych szyi z nieznanego ogniska (FPI) znaleziono u 4 pacjentów.

W grupie badanej 22 pacjentów z nowotworem złośliwym głowy i szyi poddanych było leczeniu przyczynowemu przed badaniem. U 8 pacjentów zastosowano leczenie operacyjne, u 10 radioterapię i u 4 leczenie skojarzone. U 25 osób nie było wcze-śniej wdrożonego leczenia przyczynowego. W grupie tej znalazło się 6 pacjentów ze zmianami łagodny-mi.

U wszystkich pacjentów zostało przeprowadzone badanie podmiotowe i przedmiotowe, ze szczegól-nym uwzględnieniem badania laryngologicznego z oceną miejsc zmienionych chorobowo.

W celu uzyskania autofl uorescencji tkankowej zastosowano światło lampy ksenonowej. Pacjentom nie podawano substancji fotouczulających. Endo-skopię wykonano zarówno w świetle białym, jak i wzbudzającym fl uorescencję. Badanie przeprowa-dzono zestawem do DAFE (Diagnostic Autofl uore-scence Endoscopy) fi rmy RICHARD WOLF GmbH. Wykorzystano videobronchofi beroskop z senso-rem umieszczonym na zakończeniu fi beroskopu, podłączony bezpośrednio do kontrolera kamery jednoczipowej. Jasność obrazu, ostrość i kontrast były dostrajane przez kamerę elektronicznie, co zapewniło najlepszą jakość wizualizacji. Źródłem promieniowania była lampa ksenonowa o mocy 300 W emitująca światło białe i niebieskie w zakresie długości fali 375-440 nm. Wyniki archiwizowano przy pomocy programu IRIS fi rmy MEDI.COM.

Wycinki do badania histopatologicznego z miejsc o dodatniej i ujemnej ﬂ uorescencji pobierano w spo-sób klasyczny, zależny od umiejscowienia zmiany. Preparaty oceniano w Zakładzie Patomorfologii WSS im. M. Kopernika w Łodzi.

Jako metodę statystyczną wykorzystano test G oparty na rachunku prawdopodobieństwa.

WSTĘP

Zachorowalność na nowotwory głowy i szyi stanowi około 12,2% wszystkich zachorowań na nowotwory złośliwe w Polsce. Rocznie liczba no-wych przypadków dochodzi do 6500 pacjentów [1]. Ponad 60% chorych na raka krtani i gardła dolnego zgłasza się ze znacznym stopniem zaawansowania choroby [2].

W codziennej praktyce klinicznej spotykamy się z trudnościami w określaniu rozległości zmiany no-wotworowej zarówno u pacjentów kwaliﬁ kowanych do leczenia przeciwnowotworowego, jak i u chorych z podejrzeniem wznowy po przebytym leczeniu, w szczególności po radioterapii. Długo utrzymujący się odczyn popromienny i obrzęk tkanek uniemoż-liwia prawidłową ocenę i rozpoznanie ewentualnej wznowy miejscowej procesu nowotworowego. Poszukiwane są więc nowe metody diagnostyczne, które umożliwiają obrazowanie guza. Jedną z nich jest metoda fotodynamiczna.

Diagnozowanie metodą fotodynamiczną wy-korzystuje oddziaływanie promieniowania UV na tkanki nowotworowe i dysplastyczne, które emitują inne ilościowo i jakościowo promieniowanie niż tkanka zdrowa. Widmo fl uorescencyjne tkanki moż-na uzyskać wykorzystując moż-naturalnie występujące w komórkach substancje fl uoroforowe (autofl uore-scencja) lub podając przed naświetlaniem związki fotouczulające (fl uorescencja indukowana – PDD) [3,4]

Pod wpływem światła UV szereg biomolekuł wy-kazuje zdolność do fl uorescencji. Spektra widmowe tych fl uoroforów są modyfi kowane przez zjawisko rozpraszania światła i parametry fi zyko-chemiczne środowiska [5,6]. Źródłem endogennej fl uorescencji są aminokwasy aromatyczne i koenzymy. Wśród aminokwasów jedynie tryptofan, tyrozyna i feny-loalanina wykazują fl uorescencję w obszarze UV. Silne właściwości fl uoryzujące wykazuje NADH (dinukleotyd nikotynamidoadeninowy) i NADPH (forma zredukowana dinukleotydu nikotynami-doadeninowego) oraz fl awiny (FAD – dinukleotyd fl awinoadeninowy, FMN – mononukleotyd fl awi-nowy, witamina B2), a także kwas foliowy. Widmo fl uorescencyjne dają także endogenne porfi ryny, me-lanina, pirydoksyna, lipofuscyna oraz kolagen i ela-styna [3,7-11]. Na obraz spektralny ma także wpływ unaczynienie i grubość błony śluzowej, a także ilość pokrywającego śluzu. Jest to wynikiem zmniejszania podśluzówkowej fl uorescencji przez hemoglobinę oraz zmianie struktury kolagenu w wyniku działania enzymów proteolitycznych [5,7,8,12].

Celem pracy była ocena wpływu umiejscowie-nia, rodzaju zastosowanego leczenia

(3)

przeciwno-WYNIKI

Analizie poddano grupę 47 pacjentów. Auto-ﬂ uorescencję obserwowano u 23 badanych. Brak ﬂ uorescencji występował u 24 badanych, przy czym należy zaznaczyć, że w grupie tej znalazło się 6 pa-cjentów ze zmianami łagodnymi.

Autoﬂ uorescencję częściej obserwowano w gru-pie pacjentów ze zmianami w krtani i gardle dolnym niż u chorych ze zmianami w jamie ustnej i gardle środkowym czy nosogardle. Jednakże różnice w wy-stępowaniu autoﬂ uorescencji w zależności od loka-lizacji zmian patologicznych nie były statystycznie istotne.

Dokładne dane przedstawiające częstość wy-stępowania autofluorescencji w zależności od umiejscowienia zmian patologicznych przestawiono w tabeli I.

radioterapii i leczeniu skojarzonym. W przypadku osób po leczeniu operacyjnym nie zanotowano różnic w występowaniu lub braku autoﬂ uorescen-cji. Różnice w występowaniu autofluorescencji w zależności od rodzaju zastosowanego leczenia nie były jednak istotne statystycznie. Dokładne dane zestawiono w tabeli III.

Autoﬂ uorescencja występowała częściej u pa-cjentów, u których przed włączeniem do badania nie zastosowano leczenia przyczynowego (operacyjne, radioterapia lub skojarzone) w porównaniu z cho-rymi po leczeniu. Wykazano brak istotnej różnicy w występowaniu autoﬂ uorescencji w zależności od zastosowanego leczenia.

Wyniki obrazujące zależność występowania autoﬂ uorescencji od zastosowanego leczenia przed-stawiono w tabeli II.

W grupie pacjentów poddanych leczeniu przy-czynowemu przed zakwaliﬁ kowaniem do badania dominowali chorzy po radioterapii (9 osób). Auto-ﬂ uorescencji częściej nie obserwowano u chorych po

W analizowanej grupie występowała pełna zgod-ność między wynikiem badania histopatologicznego a występowaniem lub brakiem autofl uorescencji. W odniesieniu do wszystkich badań histopato-logicznych, w których potwierdzono obecność komórek atypowych lub dysplastycznych (wyniki histopatologiczne dodatnie) stwierdzono również obecność autofl uorescncji. Natomiast w odniesie-niu do badań, w których nie znaleziono komórek atypowych (wyniki histopatologiczne ujemne) nie stwierdzono również autofl uorescencji.

Do grupy tej włączono 6 pacjentów, u których badaniem histopatologicznym potwierdzono istnie-nie zmian łagodnych i istnie-nie uwidoczniono obecności autoﬂ uorescencji w obrębie obserwowanej zmiany. Stwierdzono 100% czułość oraz 100% swoistość metody.

Dane liczbowe i procentowe obrazujące zależ-ność występowania autoﬂ uorescencji w zależności od wyniku badania histopatologicznego przedsta-wiono w tabeli IV.

Tabela I. Częstość występowania autoﬂ uorescencji w zależności od lokalizacji zmian patologicznych

Fluorescencja Krtań i gardło dolne Jama ustna i gardło środkowe Nosogar-dło test G:_{G = 3,806} N = 43 Brak istotnych różnic N % N % N % Obecna 19 68% 4 44% 0 0% Nieobecna 13 32% 5 56% 2 100% Razem 32 100% 9 100% 2 100%

Tabela II. Częstość występowania autoﬂ uorescencji u chorych bez i z włączonym leczeniem

Fluorescencja

Leczenie

po-przedzające Bez leczenia test G: G = 3,754 N = 47 Brak istot-nej różnicy N % N % Obecna 7 33% 16 62% Nieobecna 14 67% 10 38% Razem 21 100% 26 100%

Tabela III. Częstość występowania autoﬂ uorescencji w zależności od rodzaju zastosowanego leczenia

Fluorescencja Leczenie operacyj-ne Radiote-rapia Leczenie skojarzo-ne test G: G = 4,184 N = 21 Brak istotnych różnic N % N % N % Obecna 4 50% 3 33% 0 0% Nieobecna 4 50% 6 67% 4 100% Razem 8 100% 9 100% 4 100%

Tabela IV. Ocena występowania autoﬂ uorescencji w zależności od wyniku badania histopatologicznego

Fluorescencja Badanie histo-patologiczne dodatnie Badanie histo-patologiczne ujemne 1/ _{test G:} G = 19,859 N = 23 p<0,001 2/ _{test G:} G = 20,713 N = 24 p<0,001 N % N % Obecna 23 100% 1/ ₀ _0% Nieobecna 0 0% 24 100% 2/ Razem 23 100% 24 100%

(4)

DYSKUSJA

W wielu ośrodkach prowadzone są badania nad przydatnością metody fotodynamicznej w diagno-styce stanów przedrakowych i zmian nowotworo-wych jamy ustnej, gardła i krtani [5,9,13]. Zainte-resowanie badaczy tym sposobem diagnozowania wynika z potrzeby znalezienia prostej i niedrogiej metody ujawniającej zmiany patologiczne. Aktu-alnie największym problemem jest wczesne ujaw-nienie ognisk wznowy procesu nowotworowego po leczeniu operacyjnym, chemioterapii czy radiotera-pii. Występowanie odczynów popromiennych i na-stępowe bliznowacenie tkanek utrudnia i opóźnia postawienie właściwej diagnozy.

W prowadzonym badaniu oceniono zależność pomiędzy umiejscowieniem zmiany patologicznej a obecnością autofl uorescencji. W przypadku zmian w krtani i gardle dolnym autofl uorescencję zareje-strowano u 68% badanych, zaś w przypadku zmian w jamie ustnej i gardle środkowym u 44% chorych. Przy podejrzeniu zmian patologicznych w noso-gardle nie zarejestrowano autofl uorescencji. Nie stwierdzono istotnej różnicy pomiędzy obecnością autofl uorescencji a lokalizacją zmian chorobowych. W piśmiennictwie [14-18] nie wykazano tego typu zależności. Kulapaditharom i Boonkitticharoen [19] wykazali, że czułość i swoistość autofl uorescencji była większa w nowotworach gardła środkowego, niż w przypadku zmian w nosogardle. Czułość metody diagnostycznej wynosiła 100% dla zmian patologicznych gardła środkowego i 66,7% dla zmian nosogardła, natomiast swoistość uzyskana dla zmian w części ustnej gardła 96,2% oraz 75% dla zmian w części nosowej gardła. W przeprowa-dzonych badaniach opisywanych w niniejszej pracy

czułość i swoistość metody wyniosła 100% we wszystkich lokalizacjach.

Oceniono zależność pomiędzy leczeniem przy-czynowym a występowaniem autofl uorescencji. Wśród pacjentów uprzednio nie leczonych autofl u-orescencję obserwowano w 62% przypadków w po-równaniu z 33% pacjentów wcześniej poddanych terapii. Odnotowano autofl uorescencję u 50% pa-cjentów po leczeniu operacyjnym, a u 33% chorych po radioterapii. W przypadku leczenia skojarzonego u żadnego z chorych nie zarejestrowano autofl uore-scencji. Stwierdzono brak istotnej różnicy pomiędzy obecnością autofl uorescencji w grupach pacjentów leczonych i nie leczonych. Mniejszy procent auto-fl uorescencji obserwowany u chorych po leczeniu może wskazywać na skuteczność przeprowadzonej terapii. Nie odnotowano istotnej różnicy pomiędzy grupami pacjentów poddanych różnej terapii, jed-nak z tendencją do istotności.

WNIOSKI

1. Autoﬂ uorescencja jest nieinwazyjną metodą dia-gnostyczną dla detekcji zmian nowotworowych w jamie ustnej, gardle i krtani, a także do mo-nitorowania pacjentów po przeprowadzonym leczeniu przeciwnowotworowym.

2. Autoﬂ uorescencja jest metodą, która dzięki swo-jej 100% czułości i swoistości może być zastoso-wana w badaniach przesiewowych u pacjentów z grup wysokiego ryzyka zachorowalności na nowotwory głowy i szyi.

Praca ﬁ nansowana przez UM w Łodzi z pracy własnej Nr 502-17-519

1. Modrzejewski M. Obecne kierunki badań w onkologii głowy i szyi. Terapia 2000; 9: 15-17.

2. Bień S, Kamiński B, Żyłka S, Mężyk R, Piasta Z, Markowski J i wsp. Ewolucja obrazu epidemiologicznego raka krtani i krtaniowej części gardła w Polsce w latach 1991-2001. Otolaryngol Pol 2005; 59(2): 169-181. 3. Podbielska H, Sieroń A, Stręk W. Diagnostyka i terapia

fotodynamiczna. Wydawnictwo Medyczne Urban & Partner 2004; 1-211.

4. Niedźwiecka I, Zimmer-Nowicka J, Kaczmarczyk D, Morawiec-Bajda A. Diagnozowanie i leczenie metodą fotodynamiczną (PDD) – nowe perspektywy. Biuletyn Onkologiczny 2007; 7(7); 90-92.

5. Zalesska-Kręcicka M, Kręcicki T, Frączek M, Bereś-Pawlik E, Zatoński T. Laryngoskopia autoﬂ uorescencyjna w diagnostyce zmian nowotworowych krtani – doniesienie wstępne. Otolaryngol Pol 2005; 59(2): 195-199.

Piśmiennictwo

6. Kwaśny M. Zastosowanie fluorescencji wzbudzanej laserowo w badaniach materiałów biologicznych. Sympozjum Techniki Laserowej 2006; 261-274.

7. Schomacker KT, Frisoli JK, Compton CC, Flotte TJ, Richter JM, Nishioka NS i wsp. Ultraviolet laser-induced ﬂ uorescence of colonic tissue: Basic biology and diagnostic potential. Lasers in Surgery and Medicine 1992; 12(1): 63-78.

8. Vaupel P, Kalinowski F, Okmueﬀ P. Blood ﬂ ow, oxygen; and nutrient supply and metabolic microenvironment of human tumors: A review. Cancer Res 1989; 49: 6449-65.

9. Arens C, Glanz H, Dreyer T, Malzahn K. Compact endoscopy of the larynx. Ann Otol Rhinol Laryngol 2003; 112: 113-119.

10. Sieroń A, Pietrusa A, Szyguła M, Duda W, Wojciechowski B, Adamek M i wsp. Zastosowanie metod fotodynamicznych w urologii. Urologia Polska 2004; 57: 4.

(5)

11. Baletic N, Petrovic Z, Pendjer I, Malicevic H. Autoﬂ uorescent diagnostics in laryngeal pathology. Eur Arch Oto-Rhino-Laryngol 2004; 261(5): 233-237.

12. Morawiec-Sztandera A, Zimmer-Nowicka J, Kaczmarczyk D, Niedźwiecka I. Autoﬂ uorescencja tkankowa w diagnostyce i ocenie skuteczności leczenia nowotworów głowy i szyi. Otolaryngol Pol 2008; 62(5): 540-544.

13. Bruce S. Photodynamic therapy: another option in cancer treatment. Clin J Oncol Nurs 2001; 5: 95-99.

14. Kolli VR, Savage HE, Schantz SP. Native cellular ﬂ uorescence of neoplastic aerodigestive tract mucosa. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1995; 121: 1287-1292.

15. Ingrams DR, Dhingra JK, Roy K, Perrault DF, Bottrill ID, Kabani S i wsp. Autoﬂ uorescence characteristics of oral mucosa. Head and Neck 1997; 19: 27-32.

16. Majunder SK, Gupta PK, Uppal A. Autofluorescence spectroscopy of tissues from human oral cavity for discriminating malignant from normal. Lasers Life Sci 1999; 8: 211-227.

17. Harries ML, Lama S, MacAulaya C, Qua J, Palcica B. Diagnostic imaging of the larynx: autofluorescence of laryngeal tumors using the helium cadmium laser. J Laryngol Otol 1995; 109: 108-110.

18. Žargi M, Šmid L, Fajdiga I, Bubnič B, Lenarčič J, Oblak P. Detection and localization of early laryngeal cancer with laser induced ﬂ uorescence: a preliminary report. Eur Arch Oto-Rhino-Laryngol 1997; 2: 113-116.

19. Kulapaditharom B, Boonkitticharoen V. Performance characteristics of ﬂ uorescence endoscope in detection of head and neck cancers. Ann Otol Rhinol Laryngol 2001; 110: 45-52.