ROCZN. PZH, 1999, 50, NR 3, 313-319
M AŁGORZATA M. D O BRZYŃ SK A , A N T O N I K GAJEWSKI*
ZM IA N Y M O R F O L O G IC Z N E M Y SIC H P L E M N IK Ó W P O S K O JA R Z O N Y M D Z IA Ł A N IU P R O M IE N IO W A N IA X I C Y K L O F O S F A M ID U
SPERM H E A D A BN ORM A LITIES O F M ICE A FT E R CO M B IN ED X -RA YS-CY CLO PH O SPH AM ID E EX PO SU R E
Zakład Ochrony Radiologicznej i Radiobiologii Państwowy Zakład Higieny
00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24 Kierownik: dr K.A. Pachocki
* Zakład Biologii, A kadem ia Wychowania Fizycznego ul. Marymoncka 34, 01-813 Warszawa Kierownik: prof. dr hab. A .K Gajewski
Przedstawiono wyniki dotyczące zmian morfologicznych plemników myszy po ekspozycji spermatogonii na promieniowanie X lub cyklofosfamid oraz na skoja rzone działanie obu czynników.
WSTĘP
Ludzie narażeni są na jednoczesne działanie wielu czynników fizycznych, chem i cznych i biologicznych, k tó re obecne są w środowisku naturalnym oraz na stanow iskach pracy. W iele z tych czynników działając na kom órki rozrodcze uszkadza m ateriał genetyczny, co prow adzi do w ystąpienia m utacji, które są przenoszone z p o kolenia na pokolenie.
Prom ieniow anie jonizujące jest czynnikiem powszechnie występującym w środow isku człowieka oraz stosowanym w leczeniu chorób nowotworowych. Indukuje dom inujące mutacje letalne po ekspozycji różnych stadiów rozwojowych m ęskich kom órek ro zro d czych [7]. Pow oduje też występow anie zm ian morfologicznych plem ników [5, 19]. Indukuje rów nież pow staw anie m ikrojąder w sperm atydach [6].
Cyklofosfamid (C P) je st lekiem przeciwnowotworowym oraz stosowanym u p a cjentów przygotowywanych do przeszczepu szpiku kostnego [12]. Jest związkiem alki lującym, podaw any jest w nieczynnej farm akologicznie postaci, k tóra uczynnia się w w ątrobie pod wpływem enzymów m ikrosom alnych. Cyklofosfam id pow oduje uszko dzenie biologicznej czynności D N A , co prowadzi często do śm ierci kom órki. B adania wykazały, że cyklofosfamid je st m utagenem , kancerogenem i teratogenem dla zwierząt [2, 10, 12]. Po działaniu cyklofosfamidu stw ierdzono również występow anie d o m i nujących m utacji letalnych o raz wad wrodzonych u potom stw a eksponow anych gryzoni [1, 3, 4, 13-15, 18, 29-31]. Indukuje zm iany m orfologiczne plem ników u myszy [20, 32], a u pacjentów leczonych cyklofosfam idem stw ierdzono zm niejszenie liczby p lem
M A TER IA Ł I M ETODY
Badania przeprowadzono na samcach myszy niewsobnego szczepu Sfis z hodowli Państwo wego Zakładu Higieny, w wieku 11-14 tygodni. Zwierzęta naprom ieniano lub/i podawano im dootrzewnowo roztwór cyklofosfamidu. Myszom kontrolnym podawano 0,9% wodny roztwór NaCI. W każdym przypadku zwierzętom podawano około 0,4 ml roztworu, w zależności od ciężaru ciała.
Źródłem promieniowania X był terapeutyczny aparat rentgenowski THX-250 firmy Medicor (170 kV, 20 mV, filtracja dodatkowa 0,5 mm Cu, warstwa połówkowa 0,8 mm Cu). Moc dawki mierzona w M IX-D fantom ie myszy, umieszczonym w plastikowej tubie wynosiła 0,4 Gy/min. Zwierzęta były naprom ienione jednorazowo na całe ciało.
Myszy eksponowane były na następujące dawki: 0,25 Gy; 1,00 Gy; 25 mg/kg mc CP; 100 mg/kg mc CP; 0,25 G y+25 mg/kg mc CP; 1,00 G y+100 mg/kg mc CP. W przypadku skojarzonego działania cyklofosfamid podawano bezpośrednio po napromienieniu. Dawki wybrano na podsta wie testu dominujących mutacji letalnych, przeprowadzonego wcześniej w naszym Zakładzie. Małe dawki (0,25 Gy oraz 25 mg/kg mc CP) nie indukowały efektu m utagennego po działaniu jednego czynnika. Duże dawki (1,00 Gy oraz 100 mg/kg mc CP) indukowały dominujące mutacje letalne.
Test morfologii plemników przeprowadzono według metody opisanej przez Wyrobka i Bruce'a [33, 34]. Zwierzęta były zabijane w 35 dniu po naprom ienieniu i/lub podaniu cyklofosfamidu. Plemniki wyciskano z najądrzy do nasieniowodów, a następnie zawieszano w 0,9% roztworze chlorku sodowego i wykonywano preparaty mikroskopowe. Po wysuszeniu preparaty utrwalano w mieszaninie alkoholu etylowego i kwasu octowego, a następnie barwiono 1% wodnym roz tworem eozyny X. Preparaty analizowano pod mikroskopem świetlnym w kontraście fazowym. Zliczano po 1000 plemników od każdej myszy i określano odsetek plemników o nienaturalnych kształtach: nie posiadające haczyka, z bananokształtną główką, z podwiniętą główką, amorficzne oraz posiadające dwie wici.
WYNIKI
Wyniki dotyczące zmian morfologicznych plemników po naprom ienieniu, ekspozycji na cyklofosfamid oraz po skojarzonym działaniu obu czynników znajdują się w Tabeli I.
Nr 3
Zmiany morfologiczne mysich plemników315
T a b e l a I . Zmiany morfologiczne plemników po ekspozycji samców myszy na prom ieniowanie X lub cyklofosfamid oraz na skojarzone działanie obu czynników. Sperm head abnormalities after exposure of male mice to X-rays or cyclopho sphamide o r to combination of both agents.
* różnice istotne statystycznie w porównaniu do kontroli w teście t-Studenta (p < 0,05) W grupie kontrolnej stw ierdzono około 9% zm ienionych m orfologicznie plem ników . Nieco wyższe rezultaty zanotow ano po ekspozycji na prom ieniow anie X o raz po podaniu cyklofosfam idu, zarów no w dużych, jak i małych dawkach. Wyniki nie różniły się statystycznie. Po skojarzonym działaniu obu czynników w dużych i małych daw kach stwierdzono wyraźny efekt biologiczny, jed n ak w żadnym przypadku liczba plem ników po skojarzonym działaniu nie przekraczała sumy zm ienionych m orfologicznie p le m ników po działaniu każdego z czynników osobno. Jedynie po ekspozycji na 1,00 Gy + 100 mg/kg mc C P otrzym any wynik był istotny statystycznie.
Najczęstszą zm ianą m orfologiczną w grupie kontrolnej oraz we wszystkich grupach doświadczalnych oprócz myszy naprom ienionych dawką 1,00 Gy było występow anie plemników z podw iniętą główką. W grupach naprom ienionych pow szechnie w ystępo wały plem niki z główką am orficzną, a szczególnie główki o n ienaturalnie dużych ro z miarach. W przypadku grupy 1,00 Gy główek am orficznych było około 40% , a w grupie 0,25 Gy około 27% . W pozostałych grupach ten rodzaj anom alii był drugi pod względem częstości w ystępowania. P onadto w grupach naprom ienionych po p u larn ą zmianą m orfologiczną było występowanie plem ników bez haczyka (T abela II).
T a b e l a I I . Odsetek różnych rodzajów zmienionych morfologicznie plemników. Percent of different types of abnormal spermatozoa.
Dawka bez główka amorficzne podwinięta dwuwiciowe
haczyka banano- główka
316 M.M. Dobrzyńska, A.K. Gajewski N r 3 DYSKUSJA
Bruce i wsp. [5] wykazali, że liczba zm ienionych m orfologicznie plem ników poja
wiających się spontanicznie jest różna w zależności od szczepu myszy. Po przebadaniu różnych szczepów stw ierdzono od 1 do 15% plem ników o nienaturalnych kształtach. U myszy szczepu Swiss zaobserw ow ano ich 5,7% [5, 21, 23, 27], a więc nieco mniej w porów naniu do opisanych rezultatów .
W przedstaw ionym dośw iadczeniu m ęskie kom órki rozrodcze były narażone na działanie prom ieniow ania X jako sperm atogonia. Z arów no m ałe, jak i duże dawki nie powodowały istotnego zwiększenia częstości występow ania zm ienionych morfologicznie plem ników . Inni autorzy obserwowali zwiększenie częstości plem ników o n ienatural nych kształtach, je d n a k taki rezultat stw ierdzono po ekspozycji wczesnych sperm ato- cytów [5, 17, 19]. Wyniki otrzym ane po ekspozycji sperm atogonii n a duże dawki prom ieniow ania X m ogą być rezultatem nieprzeżyw ania części kom órek na skutek znacznych uszkodzeń. Zm niejszenie liczby plem ników na skutek n aprom ienienia ob serwowali także inni autorzy [11, 32]. Sailer i wsp. [22] obserw ow ali zm iany m orfolo giczne plem ników po ekspozycji sperm atogonii na dawki powyżej 60 radów.
Cyklofosfam id w daw kach od 10 do 25 mg/kg mc nie indukow ał istotnych różnic w częstości w ystępow ania zmienionych m orfologicznie plem ników u chom ików syryj skich w 1, 4 i 12 tygodniu po ekspozycji [27]. Wyrobek i Bruce [32] stwierdzili około 2% zm ienionych m orfologicznie plem ników u myszy w pierwszym tygodniu po podaniu 20 lub 50 mg/kg mc CP. N atom iast w 4 i 10 tygodniu po p o daniu związku tj. po ekspozycji wczesnych sperm atocytów lub sperm atogonii liczba zniekształconych plem ników zwiększała się wraz ze w zrostem dawki. Z ależność liczby anorm alnych plemników od dawki po ekspozycji na cyklofosfamid stwierdził również Topham [28]. Podobnie w opisanym dośw iadczeniu stw ierdzono zależność liczby zm ienionych morfologicznie plem ników od dawki, jakkolw iek otrzym ane rezultaty nie różniły się statystycznie od wyników uzyskanych dla myszy kontrolnych.
O trzym ane rezultaty potwierdziły, że zdolność różnych czynników do uszkodzeń plem ników je st związana z ich zdolnością do indukcji m utacji w kom órkach rozrod czych. Wyniki badań wykazały, że cyklofosfamid nie indukow ał istotnego podwyższenia częstości występow ania zm ian m orfologicznych plem ników po ekspozycji sperm atogo nii, podczas gdy w innych pracach nie stw ierdzono w ystępow ania dom inujących mutacji letalnych po ekspozycji sperm atogonii, wykazano natom iast ich występow anie po eks pozycji sperm atyd i plem ników [8, 16]. W przypadku skojarzonego działania obu czynników w dużych dawkach stw ierdzono w przedstaw ionej pracy istotne statystycznie podwyższenie częstości występow ania zm ienionych m orfologicznie plem ników , co od pow iada wynikom wskazującym na indukcję dom inujących m utacji letalnych p rezen to wanych w innej publikacji [16].
Istnieje niewielkie praw dopodobieństw o narażenia ludzi na skojarzone działanie prom ieniow ania X i cyklofosfamidu w w arunkach naturalnych, jest je d n a k ono możli we podczas terapii przeciwnowotworowej. Wyniki m ogą być również interesujące dla osób narażonych zaw odow o na w ym ienione czynniki.
Zmiany morfologiczne mysich plemników 317 WNIOSKI
1. Ekspozycja sperm atogonii na m ałe lub duże dawki prom ieniow ania X lub cyklo- fosfamidu nie zwiększa istotnie częstości występowania anorm alnych plem ników .
2. Skojarzona ekspozycja zarów no na m ałe, jak i na duże dawki prom ieniow ania X i cyklofosfamidu indukuje zwiększenie odsetka zm ienionych m orfologiczne p lem ników.
3. W przypadku skojarzonej ekspozycji na duże dawki obu czynników stw ierdzono wyraźną korelację w ystępow ania zmienionych m orfologicznie plem ników z indukcją dominujących m utacji letalnych.
M . M . D o b r z y ń s k a , A . K . G a j e w s k i
SPERM H EA D A BN O RM A LITIES O F M ICE A FT E R COM BINED X -RA YS-CY CLO PH O SPH AM ID E EX PO SU R E
Summary
Male mice Sfis:Pzh were exposed to X-rays, cyclophosphamide o r com bination of both agents. Each of agent was given in low (0.25 Gy, 25 mg/kg bw CP) or high (1.00 Gy, 100 mg/kg bw CP) doses. G erm cells were exposed to agents as spermatogonia. A fter 35 days sperm abnor malities test was perform ed. Exposure to one of agents only, did not enhance statistically significant frequency of morfologically abnormal spermatozoa. Combined treatm ent of sperm a togonia to both agents in low as well in high doses induce clear biological effects, but only combination o f high doses (1.00 Gy + 100 mg/kg bw CP) induce statistically significant effect.
Results obtained in this study confirmed, that ablity of different agents to induce sperm -shape abnormalities is related to its ablity to induce m utations in germ cells.
PIŚM IENNICTW O
1. Adam s P.M., Fabricant J.D. and Legator M.S.: Cyclophosphamide-induced sperm atogenic effects detected in the F I generation by behavioral testing. Science, 1981, 211, 80-83. 2. Anderson D., Bishop J.B., G am er R.C., Ostrosky-Wegman P., Shelby P.B.: Cyclophosphamide:
Review of its mutagenicity for an assesment of potential germ cell risks. M utat. Res., 1995, 330, 115-181.
3. Auroux M. and Delioust C.\ Cyclophosphamide in the male rat behavioral effects in the adult offsprings. Behav. Brain Res., 1985, 16, 25-36.
4. Auroux М., Delioust E., Selva J. and Rince P.: Cyclophosphamide in the Fn male rat: physical and behavioral change in three succesive adult generations. M utat. Res., 1990, 229,189-200. 5. Bruce W.C., Furrer R., Wyrobek A.J.: A bnorm alities in the shape of murine sperm after
acute testicular X-irradiation. Mutat. Res., 1974, 23, 381-386.
6. Collins B.W., Howard D.R. and Allen J.W.: Kinetochore-staining of sperm atid micronuclei. Studies of mice treated with X-radiation or acrylamide. Mutat. Res., 1992, 281, 287-294. 7. Ehling U.H.: Com parison of radiation-and chemically-induced dom inant lethal m utations
in male mice. M utat. Res., 1971, 11, 35-44.
8. Ehling U.H. and Neuhauser-Klaus A.: Induction of specyfic-locus and dom inant-lethal m utations by cyclophosphamide and combined cyclophosphamide-radiation treatm ent in male mice. M utat. Res., 1988, 199, 21-30.
9. Fairley K.F., Barrie J.U. and Johnson W.: Sterility and testicular atrophy related to cyc lophosphamide therapy. Lancet, 1972, 1, 568-569.
318 М.M. Dobrzyńska, А.К. Gajewski Nr 3 10. Hales В.: Modification of the teratogenicity of cyclophosphamide and its active metabolities, 4-hyroxycyclophosphamide, phospham ide mustard, and acrolein. Cancer Res., 1982, 42 3016-3021.
11. Harrison A. and Moore P C.: Reduction in sperm count and increase in abnormal sperm in the mouse following X-irradiation or injection of Na. H ealth Phys., 1979, 39, 219-224. 12. IA R C International Agency for Research on Cancer. M onograph on the Evaluation of the
Carcinogenic Risk for Humans. 1981, 26, 165-202.
13. Jenkinson P.C., Anderson D. and Gangoli S.D.: Increased incidence of abnormal foetuses in the offspring of cyclophosphamide-treated male mice. M utat. Res., 1987, 188, 57-63. 14. Jenkinson P.C. and Anderson D.\ Malformed foetuses and karyotype abnormalities in the
offspring o f cyclophosphamide and amyl alcohol treated male rats. M utat. Res., 1990, 229, 173-184.
15. Kelly S.М ., Robaire B. and Hales B.F.: Paternal cyclophosphamide treatm ent causes post im plantation loss via inner cell mass-specyfic cell death. Teratology, 1992, 45, 313-318. 16. Lenarczyk М., Dobrzyńska M.M., Słowikowska M .G., Gajewski A .K : Evaluation of sperma-
togonic response of mice to the induction of mutations by com bined treatm ent with X-rays and antineoplastic drugs. Radiat. Environ. Biophys., 1994, 33, 219-231.
17. Meistńch M .L., Hunter N.R., Suzuki N., Trostle P.К and Withess R.H.: G radual regeneration of mouse testicular stem cells after exposure to ionizing radiation. R adiat. Res., 1978, 74, 349-362.
18. Moreland F.M., Sheu C.W., Springer J.A., Green S.: Effects of prolonged chemical treatment with cyclophosphamide and 6-m ercaptopurine in the dom inant lethal test system. Mutat. Res., 1981, 90, 193-199.
19. Pogany G.C.: Effects of X-irradiation on the kinetics of abnorm al sperm production and sperm loss in the mouse. J. R eprod. Fert., 1987, 80, 1-12.
20. Pomerantseva M.D., Ramaya L .K : Efficacy of abnormal sperm head test in defecting mutagenicity of different factors in mice. Mutat. Res., 1980, 74, 233-241.
21. Pylkkanen L ., Lahdetie J.: Sperm abnormality assay of m etronidazole and timidazole. Mutat. Res., 1984, 140, 137-140.
22. Sailer B .L .,Jost L .K , Erickson K R ., Tajiran H.A. and Evenson D.P.: Effects of X-irradiaton on mouse testicular cells and sperm chrom atin structure. Environ. M olecular Mutagen., 1995, 25, 23-30.
23. Sakamoto J., Hashimoto K : Reproductive toxicity of acrylamide and related com pounds in mice-effects on fertility and sperm morphology. Arch. Toxicol., 1986, 59, 201-205. 24. Schm ahl D. and Habs M .: Carcinogenic action of low dose cyclophosphamide given orally
to Sprague-Dawley rats in a lifetime experiment. Int. J. Cancer, 1979, 23, 706-712. 25. Selevan S.G., Lindbolm M.L., Hemung R.W.: A study of occupational exposure to antineop
lastic drugs and fetal loss in nurses. N. Engl. J. Med., 1985, 313, 1173-1221.
26. Sessink P.J.M., Boer K.A., Scheefhols A.P.H., Anzian R.B.M. and Boss R.P.: Occupational exposure to antineoplastic agents at several departm ents in hospital. Environmental con tam ination and excretion of cyclophosphamide and ifosamide in urine o f exposed workers. Int. Arch. Occupat. Environ. Health., 1992, 64, 105-112.
27. Singh //., Hightower L., Jackson S.: Antisperm atogenic effects of cyclophosphamide in the Syrian ham ster. J. Toxicol. Environ. Health., 1987, 22, 29-33.
28. Topham J.C .: Do induced sperm-head abnormalities in mice specifically identify mammalian mutagens rather than carcinogens. M utat. Res., 1980, 74, 379-387.
29. Trasler J.M., Hales B.F., Robaire B.\ Paternal cyclophosphamide treatm ent of rats causes fetal loss and malformations without affecting male fertility. Nature, 1985, 316, 144-146.
Nr 3 Zmiany morfologiczne mysich plemników 319 30. TraslerJ.M., Hales B.F.,Robaire B.\ Chronic low dose cyclophosphamide treatm ent of adult
male rats: effect on fertility, pregnancy outcome and progeny. Biol. Reprod., 1986, 34, 275-283.
31. TraslerJ.M., Hales B.F. and Robaire В.: A time-course study of chronic paternal cyclopho sphamide treatm ent in rats: Effects of pregnancy outcome and male reproductive and hematologic systems. Biol. Reprod., 1987, 37, 317-326.
32. Wyrobek A.J. and Bruce W.R.: Chemical induction of sperm abnormalities in mice. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1975, 72, 4425-4429.
33. Wyrobek A .J., Gordon L A ., Burkhart J.G ., Francis M. W., Kapp R. W., Letz G ., Mailing H. V., Topham J.C. and Whorton M.D.: An evaluation of the mouse sperm morphology test and other sperm tests in nonhum an mammals. A report of U.S. Enviromnental Protection Agency Gene-Tox Program. M utation Res., 1983, 115, 1-72.
34. Wyrobek A .J., Gordon L .A., Burkhart J.G., Francis M.W., Kapp R.W., Letz G., Mailing H.V., Topham J.C. and Whorton M.D.: An evaluation of human sperm as indicators of chemically induced alterations of spermatogenic function. M utation Res., 1983, 115, 73-148.
