Określenie wpływu nitrofurazonu i furazolidonu na indukcję cytochromu P-450 w teście CYPIA

(1)

H AN N A C Z E C Z O T , M A Ł G O R Z A T A K O B IE R SK A -SZ E L IG A

OKREŚLENIE WPŁYWU NITROFU RA ZON U I FURAZOLIDO NU

NA IN D U K C JĘ CYTOCHROMU P-450 W TEŚCIE- CYPIA*

T H E E F F E C T O F N IT R O F U R A Z O N E A N D F U R A Z O L ID O N E O N T H E IN D U C T IO N O F C Y T O C H R O M E P-450 ST U D IE D BY CYPIA-TEST

Z K ated ry i Zakładu Biochemii A kademii Medycznej w Warszawie Kierow nik: prof. d r hab. T. Szym czyk-W asiluk

Praca przedstawia wyniki badań wpływu wybranych nitrofuranów: nitrofurazonu i furazolidonu na indukcję fo rm molekularnych cytochromu P-450 w teście - Cypia.

W STĘP

Nitrofurazon (semikarbazon-5-nitro-2-furaldehyd) i furazolidon (N-5-nitro-2-

-furfurylidienio-3-amino-2-o\azolidon) są przeciwbakteryjnymi lekami stosowanymi

w terapiach mieszanych infekcji bakteryjnych (głównie dróg moczowych i skóry).

Rye. 1 S truktura chemiczna nitrofurazonu i furazolidonu Fig. 1. Chemical structures o f nitrofurazone and furazolidone

Powszechnie są stosowane w lecznictwie weterynaryjnym w postaci mieszanych

preparatów. Obok cennego działania farmakologicznego związki te wywierają jednak

* Praca w ykonana w ram ach realizacji tem atu CPBR 05.08 „Badanie genotoksyczności w ybra nych leków w eterynaryjnych” .

(2)

szereg efektów niepożądanych (działanie nefrotoksyczne, hepatotoksyczne). Odnoto

wano również dla obu związków efekty mutagenne i kancerogenne [6]. Mimo, że

działanie genotoksyczne nitrofurazonu i furazolidonu jak również innych 5-nitrofura-

nów jest dobrze udokumentowane [6] mechanizmy nadal pozostają niewyjaśnione.

Przypuszcza się, że za efekt genotoksycznego działania tych związków odpowiedzial

ne są głównie ich metabolity powstające w trakcie przemian redukcyjnych grupy

5-nitro: rodnik nitrofuranoanionowy, nitrozo- i hydroksyloaminopochodne furanowe

[6]. Dodatkowo w wyniku autooksydacji rodnika nitrofuranoanionowego dochodzi

do powstawania produktów niepełnej redukcji tlenu: nadtlenku wodoru, rodników

nadtlenkowych i hydroksylowych, które również mogą powodować szereg uszkodzeń

DNA. Badania przeprowadzone w Katedrze i Zakładzie Biochemii Akademii Me

dycznej w Warszawie wykazały, że udział wolnych rodników tlenowych w genotok

syczności nitrofuranów jest niewielki [2]. Wydaje się, że zdecydowanie większe zna

czenie w genotoksyczności tych związków (nitrofurazonu i furazolidonu) mają ich

metabolity powstające niezależnie od warunków tlenowych: odpowiednie rodniki

nitrozofuranowe i pochodne hydrosyloaminowe [2].

Wiadomo, że większość substancji chemicznych (leki, trucizny, używki, środki

ochrony roślin, dodatki do żywności, zanieczyszczenia przemysłowe) jest chemicznie

nieczynna, dopiero swoją aktywność biologiczną ujawnia w wyniku metabolicznej

aktywacji w organizmie. Metaboliczna aktywacja prowadzi bowiem do przekształ

cenia związków w reaktywne metabolity silnie oddziaływujące z komórkowymi m a

krocząsteczkami (DNA, RNA, białka) [8]. Metaboliczna aktywacja związków che

micznych jest możliwa dzięki istnieniu w organizmie ssaków wielu grup enzymów,

zwłaszcza systemu monooksygenaz o mieszanej funkcji, zależnych od cytochromu

P-450. System monooksygenaz łatwo reaguje na zmianę aktywności w momencie

pojawienia się odpowiedniego substratu [8].

Leki i inne ksenobiotyki mogą indukować w procesach biotransformacji syntezę

białka enzymatycznego oraz różnych form molekularnych cytochromu P-450. Ze

względu na rodzaj indukowanej formy cytochromu P-450 przez związki chemiczne

zastosowano ich podział między innymi na:

- induktory typu 3-methylocholantrenu (indukcja form molekularnych rodziny

cytochromu P-4501A);

- induktory typu fenobarbitalu (indukcja form molekularnych rodziny cytochro

mu P-4502B);

- induktory typu 16 -y-karbnitryl pregnenolonu (indukcja form molekularnych

rodziny cytochromu P-4503A) [8].

Przedstawione badania prowadzone testem CYPIA [8] mają na celu określenie

przynależności nitrofurazonu i furazolidonu do jednego z dwóch głównych typów

induktorów systemu monooksygenaz zależnych od cytochromu P-450 (typu fenobar

bitalu lub 3-metylocholantrenu).

Test Cypia obejmuje:

I - Preparatykę posmitochondrialnego supernatantu 9000 x g (frakcji S9) z wąt

roby zwierząt otrzymujących nitrofurazon, furazolidon, fenobarbital, 3-metylocho-

lantren i olej;

II

- Test na mutagenność bromku etydyny (EtBr) w szczepie S. typhimurium TA98

i cyklofosfamidu (CPA) w szczepie TA 100 zgodnie z metodyką (Lesca i wsp. 1984).

(3)

O c e n a i l o ś c i r e w e r t a n t ó w h is + w u k ł a d a c h d o ś w i a d c z a l n y c h

Zasada tej metody jest oparta na szeroko rozpowszechnionej, klasycznej już dziś

technice testu Am es’a [1,7].

Opiera się ona na obserwacji, że frakcja S-9 uzyskana z wątroby szczurów indu

kowanych związkami zwiększającymi aktywność cytochromu P-4501A (typu 3-mety-

locholantrenu), specyficznie katalizuje przemianę bromku etydyny do mutagennych

metabolitów. Natomiast induktory typu fenobarbitalu zwiększające aktywność cyto

chromu P-4502B stymulują aktywność cyklofosfamidu do związków mutagennych

przez frakcję S9 z wątroby szczurów indukowanych tymi związkami.

Pośrednie (mutagenne) metabolity obu promutagenów, powstające w wyniku

działania monooksygenaz zależnych od cytochromu P-450 obecnych w frakcji S9

z wątroby zaindukowanej nitrofuranami (nitrofurazonem lub furazolidonem) wg.

typu fenobarbitalu lub typu 3-metylocholantrenu wywołują rewersję his w testo*

wych szczepach S. typhimurium TA98 i TA100.

M A T ER IA Ł I M ETO D Y

Z w i ą z k i c h e m i c z n e . N ilrofurazon i furazolidon - firmy Polfa; brom ek etydyny (BrEt) i cyklo fosfamid (CFA ) - firmy Sigma; 2-nitrofluoren i tlenek 4-nitrochinoliny - firmy Serva; Wszystkie pozostałe odczynniki produkcji polskiej - P.O.CH-Gliwice.

S z c z e p y b a k t e r y j n e . Szczepy S. typhimurium TA98 (hisD3052 chi (hio, uvrB, gal) 100B-rfal004 p k MI Ol ) i TA100 (hisG46 chl(bio, uvrB, gal)I005 rfa-1001 p kMI Ol ) wykorzystane w teście Cypia otrzym ano od Prof. B.N . A m e s’a (Biochemistry D epartm ent, University o f California, Berkley, CA, U.S.A). Fenotypy użytych szczepów w każdym doświadczeniu były sprawdzane zgodnie z procedurą opisaną przez Amesa i wsp. [1].

Z w i e r z ę t a : Samce szczurów rasy Wistar o masie ciała od 90-100 g pochodziły ze zwierzętami Akadem ii Medycznej w W arszawie. W czasie doświadczenia zwierzęta były przetrzymywane w pla stikowych klatkach w jednakow ych warunkach z zachowaniem cyklu dobow ego (dzień/noc). W szyst kie otrzymywały paszę standardow ą firmy Bacutil i wodę ad libitum. Szczury dzielono na grupy dośw iadczalne, w każdej po 5 sztuk. Badania były prow adzone równolegle we wszystkich grupach doświadczalnych szczurów. W ykonano 3 oddzielne/równoległe doświadczenia.

(4)

400

H. Czeczot, М . Kobierska-Szeliga

Nr 4

S p o s ó b p o d a w a n i a z w i e r z ę t o m b a d a n y c h z w i ą z k ó w . Samce rasy И'istar otrzymywały badane związki: nitrofurazon i furazolidon rozpuszczone w oleju jadalnym :

I - jednorazow o drogą dootrzewnow ej iniekcji w dawce wynoszącej 80 m g/kg masy ciała; zwierzęta dekapitow ano p o 48 godzinach;

II - dootrzew now o przez 3 kolejne dni w odstępach dobowych daw kę wynoszącą 80 m g/kg masy ciała (łączna daw ka - 240 m g/kg masy ciała). Zwierzęta zabijano po 24 godzinach od ostatniego podania związków przez dyslokację rdzenia nerwowego.

Fenobarbital rozpuszczony w wodzie podaw ano szczurom w dawce 80 m g/kg masy ciała przez 3 kolejne dni. Zwierzęta dekapitow ano po 24 godzinach od ostatniego podania.

3-m etylocholantren rozpuszczony w oleju podaw ano szczurom jednorazow o w dawce 80 m g/kg masy ciała drogą dootrzewnow ej iniekcji na 48 godzin przed dekapitacją.

G ru p y kontrolne zwierząt otrzymywały olej lub wodę.

P r z y g o t o w a n i e f r a k c j i S 9 z w ą t r o b y s z c z u r ó w p o p o d a n i u n i t r o f u r a z o n u , f u r a z o l i d o n u , 3 - m e t y l o c h o l a n t r e n u i f e n o b a r b i t a l u .

Frakcję S9 i mieszaninę S9 mix używ aną d o aktywacji metabolicznej 2 standardow ych prom uta- genów: brom ku etydyny w szczepie TA98 i cyklofosfamidu w szczepie TA100 S. typhimurium przygo tow ano zgodnie z m etodą opisaną przez Amesa i wsp. [1, 7]. W każdej frakcji S9 oznaczano stężenie białka według m etody Low ry i wsp. [5] i stężenie cytochromu P-450 określano m etodą Omura i Saito [9]. Frakcję S9 przechow ywano w tem peraturze -80°C.

B a d a n i e m u t a g e n n o ś c i b r o m k u e t y d y n y ( B r E t ) i c y k l o f o s f a m i d u ( C F A ) D la wykazania indukcji cytochrom u P-4501A (typu 3-m etylocholantrenu) i cytochrom u P-4502B (typu fenobarbitalu) w ykonano badanie m utagenności brom ku etydyny (BrEt) i cyklo fosfam idu (C FA ) zgodnie z m etodą testu Amesa [1] dodając 100 pi S9 n a płytkę. D odatkow o dla każdego układu doświadczalnego w ykonano kontrole pozytywne w celu określenia zdolności szczepów testowych S. typhimurium do rewersji prototrofów histydynowych his stosując dla szczepu TA98 2-nitrolluoren w stężeniu 2 //g/płytkę oraz dla szczepu TA100 tlenek-4-nitro-chinoliny w stężeniu 4 /ig/płytkę. O bserw ow ana ilość rew ertantów his* w szczepach testowych S. typhimurium w obecności w/w standardow ych m utagenów była zgodna z danymi literaturow ym i [1, 7]. K ażdą frakcję S9 mix b adano również bez substratu (BrEt lub CFA) w celu wykluczenia rewersji his spowodowanej przez sam ą frakcję S9. Rewersje spontaniczne (bez S9 mix) były n a poziomie 2 9 + 9 kolonii dla szczepu TA98 S. typhimurium oraz 164 + 33 kolonii dla szczepu TA100 S. typhimurium.

W Y N IK I I ICH O M Ó W IEN IE

Wyniki badań przedstawiono w tabelach I, II i na rycinach 2, 3.

Stwierdzono, że nitrofurazon podawany szczurom jednorazowo oraz trzykrotnie

w odstępach dobowych w dawce 80 mg/kg masy ciała nie indukuje form molekular

nych cytochromu P-4501A (typu 3-metylocholantrenu) (Tab. I, Ryc. 2). Natomiast

furazolidon podany w łącznej dawce (3 x 80 mg/kg masy ciała) indukuje ten typ

cytochromu P-450 (Tab. I, Ryc. 2).

Według Lesca i wsp. [4] badanego związku nie zalicza się do induktorów cyto

chromu P-4501A (typu 3-metylocholantrenu) jeśli liczba rewertantów his jest po*

niżej 40-60 kolonii//ig bromku etydyny (BrEt). Do silnych induktorów tych form

cytochromu P-450 są klasyfikowane związki indukujące od 600 do ponad 2000 rewer

tantów his+/fig bromku etydyny (np. 3-metylocholantren, Aroclor).

(5)

Liczba rew ertantów h is + (w tvsiacach)

Ryc. 2 M utagenność brom ku etydyny (BrEt) w szczepie TA98 S. typhimurium w obecności frakcji S9 (100/d) z w ątroby szczurów po podaniu: 3-m etylocholantrenu (3-MC-) - 80 m g/kg masy ciała; nitrofurazonu (N F ) - 1 x 80 m g/kg masy ciała; nitrofurazonu (N F) - 3 x 80 m g/kg masy ciała;

furazolidonu (FZ) - 1 x 80 m g/kg masy ciała; furazolidonu (FZ) - 3 x 80 m g/kg masy ciała. Wyniki są wartością średnią z 3 oddzielnie przeprowadzonych doświadczeń.

Fig. 2 M utagenicity o f ethidium brom ide (EtBr) to S. typhimurium TA98 in the presence of S9 (100 д1): S9 was isolated from livers o f rats treated with: 3-m ethylocholantrene (3-MC) - 1 x 80 m g/kg body weight; nitrofurazone (N F) - 1 x 80 mg/kg body weight; nitrofurazone (N F) - 3 x 80 mg/kg body weight;

furazolidone (FZ) - 1 x 80 m g/kg body weight; furazolidone (FZ) - 3 x 80 mg/kg body weight. The results are expressed as mean values from 3 separate experiments.

Nitrofurazon i furazolidon w opisanych warunkach doświadczalnych zarówno

w jednorazowej jak i wielokrotnej dawce nie indukują również systemu mono-

oksygenaz zależnych od form molekularnych cytochromu P-4502B (Tab. II, Ryc. 3).

(6)

402 N r 4

Rye. 3 M utagenność cyklofosfam idu (CFA) w szczepie TA100 S. typhimurium w obecności frakcji S9 (100/d) z w ątroby szczurów po podaniu: fenobarbitalu (FB) -

3 x

80 m g/kg masy ciała; nitrofurazonu (N F) - 1

x

80 m g/kg m asy d a la ; nitrofurazonu (N F) -

3 x

80 mg/kg masy ciała; furazolidonu (FZ)

-

1

x

80 m g/kg masy ciała; furazolidonu (FZ) -

3 x

80 m g/kg masy ciała. Wyniki są wartością średnią z 3 oddzielnie przeprowadzonych doświadczeń.

Fig.

3

M utagenicity o f cyclophosphamide (CPA) to S. typhimurium TA100 in the presence o f S9 (100 ^1) S9 was isolated from livers o f rats treated with: phenobarbital (PB) -

3 x

80 m g/kg body weight; nitrofurazone (N F ) - 1

x

80 m g/kg body weight; nitrofurazone (N F) -

3 x

80 m g/kg body weight;

furazolidone (FZ) - 1

x

80 m g/kg body weight; furazolidone (FZ) -

3 x

80 m g/kg body weight. The results are expressed as mean values from 3 separate experiments.

Badany związek może być zaliczany do klasy induktorów cytochromu P-4502B

(typu fenobarbitalu) jeśli obserwuje się indukcję rewersji his+ w szczepie TA100

S. typhimurium w wyniku metabolicznej aktywacji (obecności frakcji S9 z wątroby

szczura) (Tab. II).

(7)

T a b e l a I. M utagenność brom ku etydyny (BrEt) w szczepie TA98 S. typhimurium oraz stężenie cytochromu P-450 we frakcji S9 (100^1) z w ątroby szczurów po podaniu 3-metylocholantrenu, nitrofurazonu i furazolidonu

M utagenicity o f ethidium brom ide (EtBr) in S. typhimurium TA98 and cytochrome P-450 concentration in fraction S9 (100/d) from rat liver after adm inistration o f 3-m ethylcholantrene, nitrofurazone and furazolidone

T a b e l a I I . M utagenność cyklofosfam idu (CFA) w szczepie TA100 S. typhimurium oraz stężenie cytochromu P-450 we frakcji S9 (100 ц\) z w ątroby szczurów po podaniu fenobarbitalu, nitrofurazonu i furazolidonu

M utagenicity o f cyclophosphamide (CFA) in S. typhimurium TA100 and cytochrom e P-450 concentration in fraction S9 (100/d) from rat liver after adm inistration of phenobarbital, nitrofurazone or furazolidone

Uzyskane wyniki wskazują, że w opisanych warunkach doświadczenia zarówno

nitrofurazon jak i furazolidon w obu dawkach (1 x 80 mg/kg masy ciała i 3 x 80 mg/kg

masy ciała) nie indukują form molekularnych cytochromu P-4502B (typu fenobar

bitalu). Wyrażone jest to liczbą rewertantów his+/800 fig cyklofosfamidu, powsta

łych w obecności frakcji S9 z wątroby szczurów indukowanych badanymi związkami

w szczepie TAI 00 S. typhimurium w stosunku do liczby rewertantów his+ powstałych

w obecności frakcji S9 z wątroby szczurów otrzymujących fenobarbital (Tab. II).

Nie stwierdzono istotnych zmian w poziomie cytochromu P-450 we frakcjach S9

otrzymanych z wątroby szczurów indukowanych nitrofurazonem i furazolidonem

zarówno po jednorazowym jak i wielokrotnym podawaniu badanych związków.

(8)

Stężenie cytochromu P-450 nmol/mg białka we frakcji S9 otrzymanych z wątroby

szczurów indukowanych standardowymi induktorami: 3-metyIocholantrenem i feno-

barbitalem są zgodne z danymi piśmiennictwa [3, 4, 10].

404 N r 4

W N IO SK I

1. Nitrofurazon i furazolidon nie indukują cytochromu P-4502B (typu feno-

barbitalu).

2. Nitrofurazon nie indukuje również cytochromu P-4501A (typu 3-metylo-

cholantrenu).

3. Jedynie furazolidon w łącznej dawce ( 3x80 mg/kg masy ciała) jest indukto-

rem systemu monooksygenaz zależnych od cytochromu P-4501A (typu 3-metylo-

cholantrenu).

4. Test Cypia wydaje się być prostą i czułą metodą do wykrywania induktorów

monooksygenaz zależnych od cytochromu P-450 typu 3-metylocholantrenu i/lub typu

fenobarbitalu.

H. C z e c z o t , M. K o b i e r s k a - S z e l i g a

T H E E F F E C T O F N IT R O F U R A Z O N E A N D F U R A Z O L ID O N E O N T H E IN D U C T IO N O F C Y T O C H R O M E P-450 ST U D IE D BY CYPIA-TEST

S u m m a r y

T he double CY PIA -TEST (cytochrom e P-450 induction assay) was used to descriminate between the form s o f cytochrom e P-450 (the 3-methylcholantrene type (3-MC) or phenobarbital type (PB)) induced by nitrofurans; nitrofurazone and furazolidone.

T he test consisted o f the studies by the technique o f Ames of the ability o f the S9 preparation obtained from livers o f rats induced by nitrofurans to cause the metabolic activation o f ethidium brom ide (EtBr) - for induction o f 3-M C type or cyclphosphamide (CPA) for PB type o f cytochrome P-450.

T he m utagenicity o f activated EtBr and CPA was chicked with TA98 and TA100 of S. typhi- murium respectively.

It was found th at only furazolidone at cumulative dose 3 x 80 m g/kg o f body weight induce -the 3-M C-type of cytochrom e P-450.

PIŚM IE N N IC TW O

1. Am es B.N., M c Cann J., Yamasaki E.: M ethods for detecting carcinogens and mutagens with the Salmonella/m am m alian microsome mutagenicity test. M utation Res., 1975, 31, 347. - 2. Gajewska J., Szczypka М ., Tudek В., Szym czyk- IVasiluk Т.: Studies on the effect o f ascorbic acid and selenium on the genotoxicity o f nitrofurans: nitrofurazone and furazolidone. M utation Res., 1990, 232, 191. - 3. Harada М ., Omura Т.: Selective induction o f two different molecule species o f cytochrom e P-450 by phenobarbital and 3-methylcholantrene. J. Biol. Chem., 1981, 89, 239. - 4. Lesca P., Fournier A ., Lecointe P., Cresleil Т.: A dual assay for the specific screening o f 3-m ethylcholantrene- and phenobarbital- like chemical inducers o f cytochrom e P-450 m onooxy genases. M utation Res., 1984, 129, 299. - 5. Lowry O .H., Rosebrough N.J., Farr A .L., Randall R.J.:

(9)

Protein m easurem ent with Folin phenol reagent.: J. Biol. Chem., 1951, 193, 265. - 6. M ac Calla D.R.: M utagenicity o f n itrofuran derivatives: review. Environ. M utagen., 1983, 5, 745. - 7. M aron D .M ., Ames B.N.: Revised m ethods for the Salmonella mutagenicity test. M utation Res., 1983, 113, 173. - 8. M iller E.C., Miller J.A .\ The m etabolism o f chemical carcinogens to reactive electrophiles and their possible mechanism em o f action in carcinogenesis. In C.E. Searle (Ed) Chemical C arcino gens (ACS M onograph Series N o. 173), American Chemical Society, W ashington, 1976, 737. - 9. Omura Т., Sailo R T he C arbon m onoxide binding pigm ent o f liver microsomes, I. Evidence for its hem oprotein nature. J. Biol. Chem., 1964, 239, 2370. - 10. Le Prevost E.T., Gresteil Т., Columelli S., Leroux J.P.: Im m unological and enzymatic com parison o f hepatic cytochrom e P-450 fractions from phenobarbital- 3-m ethyIcholantrene, /?-naphthoflavone and 2, 3, 7, 8- tetrachlorodi- benzo-p-dioxin-treated rats.: Biochem. Pharm acol., 1983, 32, 1673.

D n. 1994.12.17

Określenie wpływu nitrofurazonu i furazolidonu na indukcję cytochromu P-450 w teście CYPIA