Medycyna Wet. 2008, 64 (7) 858
Artyku³ przegl¹dowy Review
Glukoza jest g³ównym substratem energetycznym dla wiêkszoci ¿ywych komórek. Ponadto stanowi podstawo-we ród³o wêgla dla wielu substancji komórkowych, tj. cukrów z³o¿onych, aminokwasów czy lipidów.
Glukoza odgrywa istotn¹ rolê we wczesnym rozwoju zarodkowym, pocz¹wszy od momentu fuzji gamet i za-p³odnienia (32), jednak¿e jej transport i wykorzystanie jako g³ównego substratu energetycznego wzrasta szcze-gólnie na etapie formowania siê blastocysty. W warun-kach in vivo glukoza dostarczana jest zarodkom w wy-dzielinach komórek nab³onkowych jajowodu i macicy. Znaczny wzrost wykorzystania glukozy w stadium bla-stocysty odnotowano w zarodkach mysich (13), bydlê-cych (31), wiñskich (30), szczurzych (3), króliczych (29) i ludzkich (10). Wynika to najprawdopodobniej ze wzmo-¿onych potrzeb energetycznych zarodka na tym etapie, spowodowanych nasilon¹ proliferacj¹ komórek, która prowadzi do wyodrêbnienia siê pierwszej warstwy epite-lialnej oraz pojawienia siê wype³nionej p³ynem jamki bla-stocysty zwanej blastocelem (4, 25). Przeciwnie, spadek transportu glukozy, zarówno podstawowego, jak i stymu-lowanego dzia³aniem insuliny powodowa³ wzmo¿on¹ apoptozê w komórkach blastocysty myszy, co by³o przy-czyn¹ malformacji p³odów b¹d te¿ skutkowa³o niedono-szeniem ci¹¿y (6, 21, 22). Podczas bardzo wczesnych faz rozwojowych g³ównym ród³em energetycznym dla
za-rodków s¹ bardziej utlenione zwi¹zki, takie jak pirogro-nian i mleczan (9, 15, 26). Mysie zarodki na etapie pierw-szego podzia³u zarodkowego wykorzystuj¹ tylko pirogro-nian, podczas gdy na etapie kolejnego metabolizuj¹ piro-gronian i mleczan w równym stopniu (25). Glukoza jako g³ówny substrat energetyczny zaczyna byæ niezbêdna do-piero od momentu kompakcji i formowania siê blasto-cysty. Sugerowano, ¿e spowodowane jest to zablokowa-niem szlaku glikolizy przed kompakcj¹ (24), jednak¿e w kolejnych badaniach wykazano, ¿e to najprawdopodob-niej transport glukozy jest czynnikiem odpowiedzialnym za wykorzystywanie glukozy jako g³ównego ród³a ener-gii przez zarodki we wczesnych stadiach rozwojowych (25). Przejcie z metabolizmu pirogronianu na metabo-lizm glukozy zwi¹zane jest ze wzrostem ekspresji mRNA heksokinazy, enzymu odpowiedzialnego za fosforylacjê glukozy wewn¹trz komórki (17). Stwierdzono wyrany wzrost aktywnoci heksokinazy podczas formowania siê blastocysty w zarodkach bydlêcych (27), mysich (12) i ludzkich (19), co zwi¹zane by³o z wzmo¿onym wyko-rzystywaniem glukozy przez te zarodki. Pobór glukozy przez zarodki bydlêce produkowane in vitro wzrasta suk-cesywnie od stadium 2-komórkowego, a¿ do stadium wy-kluwaj¹cej siê blastocysty. Natomiast wzrost metaboli-zmu nastêpuje dwuetapowo, po raz pierwszy, gdy uru-chamiany jest genom zarodkowy (8/16 komórek) i po raz
Transport i wykorzystanie glukozy
we wczesnym rozwoju zarodkowym
MARTA WASIELAK, KATARZYNA KAMIÑSKA, MAREK BOGACKI
Pracownia Biologii Zarodka Instytutu Rozrodu Zwierz¹t i Badañ ¯ywnoci PAN, ul. Tuwima 10, 10-747 Olsztyn
Wasielak M., Kamiñska K., Bogacki M.
Transport and glucose utilization during early embryonic development
Summary
Glucose transport and utilization play a crucial role during preimplantation development of the embryo, especially during the transition into the blastocyst stage. In the earlier developmental stages embryos do not use glucose as the main fuel but prefer more oxidized sources of energy such as pyruvate and lactate. The increased glucose transport indicated in mouse, bovine, porcine, rat, rabbit and human blastocysts is probably caused by the elevated energetic demands resulting from the morphological changes occurring in this stage of development. Moreover, the decreased glucose transport causes apoptotis in blastocyst cells resulting in further malformations of the fetus and even miscarriages. Glucose is transported into the embryo mainly by the membrane glucose transporters glycoproteins (GLUTs) GLUT 1, 2, 3, 4, 8, 9 that are specifically expressed during preimplantation development. GLUT 1, 2, 3, 9 are expressed in the cell membranes while GLUT 4 and 8 insulin/IGF-I dependent transporters are localized intracellularly and translocated into the membrane in response to insulin action. Contrary to the above mentioned transporters amongst which GLUT 1 is expressed as early as in oocytes, the expression of GLUT 4 and 8 begins from the blastocyst stage. The increased expression of glucose transporters on the blastocyst stage and especially the specific localization in blastocyst cells indicate their important role in preimplantation development.
Medycyna Wet. 2008, 64 (7) 859 kolejny na etapie kompakcji (28). Mo¿liwe jest, ¿e blok
w rozwoju zarodków bydlêcych obserwowany in vitro na etapie 8/16 komórek powodowany jest w³anie zaburze-niami w wykorzystaniu glukozy przez zarodki.
Wykazano, ¿e wysokie koncentracje glukozy w medium hodowlanym mog¹ hamowaæ rozwój zarodków mysich na wczesnych etapach rozwojowych (5, 29). Natomiast próby hodowli zarodków wiñskich w mediach o niskiej zawartoci glukozy (KSOM, G1.1/2.1) dawa³y znacznie s³absze rezultaty ni¿ wówczas, gdy zarodki hodowano w medium NCSU-23, w którym koncentracja glukozy wy-nosi³a 5,5 mmol/l (8, 18), podczas gdy koncentracja kozy w jajowodzie wini wynosi tylko ok. 0,17 mmol glu-kozy/litr. Ta wyrana preferencja glukozy przez zarodki wiñskie jest nietypowa w wietle wy¿ej zaprezentowa-nych dazaprezentowa-nych dotycz¹cych zarodków mysich. Potencjal-nym wyt³umaczeniem tego zjawiska mo¿e byæ udzia³ glu-kozy w metabolizmie lipidów, których zarodki wiñskie zawieraj¹ znacznie wiêcej w porównaniu do zarodków innych gatunków zwierz¹t gospodarskich (20).
Transportery glukozy
Kluczowym momentem w wykorzystaniu glukozy jest jej transport przez b³onê komórkow¹, który powinien od-bywaæ siê z prêdkoci¹ dopasowan¹ do wymagañ ener-getycznych komórki. Glukoza mo¿e byæ transportowana przez b³ony komórkowe na drodze dwóch mechanizmów: przez zale¿ne od jonów Na+ kana³y b³onowe, tzw.
SGLT (sodium coupled glucose trnasporters); transport glukozy do wnêtrza komórki skorelowany jest z kotrans-portem jonów Na+, który odbywa siê wbrew gradientowi
stê¿eñ dziêki funkcjonowaniu pompy sodowo-potasowej (24),
przez niezale¿ne od jonów Na+ transportery glukozy
(GLUT glucose transporters glycoproteins) (34). Wykorzystanie selektywnych inhibitorów transportu glukozy wykaza³o, ¿e pobór glukozy przez przedimplan-tacyjne zarodki warunkowany jest przede wszystkim funk-cjonowaniem niezale¿nych od jonów sodu transporterów glukozy (14).
Transportery glukozy s¹ bia³kami o wielkoci 500 ami-nokwasów. Ka¿da z izoform zbudowana jest z 12 wysoce konserwatywnych transb³onowych domen (tworz¹cych tzw. domenê wewn¹trzb³onow¹, stanowi¹c¹ ok. 50% masy bia³ka), domeny cytoplazmatycznej (stanowi¹cej ok. 35% masy bia³ka) i domeny zewn¹trzkomórkowej. W
dome-nie cytoplazmatycznej wyró¿nia siê koñce: aminowy i kar-bonylowy oraz du¿¹ centraln¹ pêtlê miêdzy wewn¹trz-b³onowymi domenami 6 i 7. Czêæ zewn¹trzkomórkowa sk³ada siê z du¿ej glikozylowanej pêtli zlokalizowanej miêdzy wewn¹trzb³onowymi domenami 1 i 2. Domeny pozab³onowe wykazuj¹ znaczne zró¿nicowanie w sek-wencji aminokwasowej, co wskazuje na ich istotn¹ rolê w tkankowo specyficznej regulacji funkcji poszczegól-nych izoform GLUT (16).
Ekspresja poszczególnych izoform GLUT
w rozwoju przedimplantacyjnym
Najbardziej rozpowszechnion¹ sporód wszystkich izo-form transporterów glukozy, wystêpuj¹cych w rozwoju przedimplantacyjnym zarodków jest GLUT 1. GLUT 1 ulega ekspresji w mysich i ludzkich oocytach oraz w za-rodkach kolejnych stadiów rozwojowych (1, 11, 23). W blastocystach mysich zlokalizowano go w bocznych i podstawnych b³onach komórek trofoektodermy oraz w b³onach komórek wewnêtrznej masy komórkowej, co najprawdopodobniej umo¿liwia pobieranie/transport glu-kozy z blastocelu. Pocz¹wszy od stadium 4-6-komórko-wego i 8-komórko4-6-komórko-wego wykazano ekspresjê, odpowied-nio, GLUT 3 i GLUT 2 w zarodkach mysich (1, 11), pod-czas gdy w zarodkach ludzkich ekspresja tego transpor-tera wykryta zosta³a dopiero na etapie blastocysty (7). W stadium moruli i blastocysty stwierdzono ekspresjê pozosta³ych transporterów glukozy, odgrywaj¹cych istot-n¹ rolê w rozwoju przedimplantacyjnym, tj. zale¿nych od insuliny GLUT 4 (7) i GLUT 8 (4). GLUT 3 ulega eks-presji na zewnêtrznej powierzchni b³onowej komórek tro-foektodermy, natomiast zarówno GLUT 4, jak i 8 wystê-puj¹ wewn¹trzkomórkowo. Korelacja miêdzy niskim po-ziomem/aktywnoci¹ heksokinazy (2) i blokiem w wyko-rzystywaniu i/lub transporcie glukozy obserwowanym przed uformowaniem siê blastocysty wynika najprawdo-podobniej z niewystarczaj¹cej zdolnoci GLUT 1 do trans-portu glukozy i heksokinazy do produkcji glukozo-6-fos-foranu. Pojawienie siê GLUT 3 w momencie kompakcji odzwierciedla wzrastaj¹c¹ zale¿noæ rozwijaj¹cej siê bla-stocysty od glukozy (24). Ekspresja zale¿nych od insuli-ny transporterów glukozy GLUT 4 i 8 na etapie blsto-cysty potwierdza fakt, ¿e dopiero od pewnego momentu w rozwoju embrionalnym pobieranie glukozy przez za-rodki zale¿ne jest od dzia³ania insuliny i tak np. receptory insuliny w zarodkach mysich wykryte zosta³y dopiero na etapie zarodka 8-komórkowego. Pinto i in. (26) wyka-zali wysok¹ ekspresjê GLUT 8 w mysich blastocystach. W stanie podstawowym GLUT 8 zlokalizowany jest we-wn¹trzkomórkowo, jednak¿e na skutek dzia³ania insuli-ny b¹d IGF-I przemieszcza siê do b³oinsuli-ny komórkowej i ulega ekspresji w b³onie podstawnej komórek trofoek-todermy (24, 25). Wspomniana translokacja zwi¹zana jest ze wzrostem poboru glukozy pod wp³ywem insuliny, przy czym sygna³ przekazywany jest przez receptor dla IGF-I. Dodatkowo skorelowane jest to czasowo z przejciem zarodka z jajowodu do macicy, gdzie stwierdza siê 10--krotnie wy¿sz¹ koncentracjê IGF-I i insuliny (26). Wy-kazano, ¿e zaprzestanie stymulacji GLUT 8 przez IGF-I upoledza³o transport glukozy do komórek, co powodo-wa³o wzrost apoptozy w komórkach blastocysty myszy Tab. 1. Ekspresja poszczególnych izoform GLUT na
kolej-nych etapach rozwoju zarodkowego, na przyk³adzie zarod-ków mysich t y c o O Zygota Z2a-rkoodme.k Z4a-rkoodme.k Z8a-rkoodme.k Bclayssttoa -1 T U L G + + + + + + 2 T U L G + + 3 T U L G + + + 4 T U L G + + 8 T U L G + + 9 T U L G + + + + +
Medycyna Wet. 2008, 64 (7) 860
(7). Podobnie, zahamowanie szlaku sygnalizacyjnego in-sulina/IGFI mia³o skutki w postaci wzmo¿onej apoptozy w blastocystach i by³o przyczyn¹ resorpcji zarodków. Sugeruje to, ¿e, byæ mo¿e, GLUT 8 powsta³ jako dodat-kowy, antyapoptotyczny mechanizm w blastocycie, aby maksymalnie zwiêkszyæ pobór glukozy w tym krytycz-nym momencie, gdy zarodek zmienia g³ówne ród³o ener-getyczne z pirogronianu na glukozê w zwi¹zku ze zwiêk-szonym zapotrzebowaniem na energiê. W rozwoju przed-implantacyjnym ekspresji ulega równie¿ kolejny funkcjo-nalny transporter glukozy GLUT 9, który u myszy poja-wia siê ju¿ na etapie zygoty (4). U myszy zidentyfikowa-no dwie dodatkowe izoformy GLUT 9 (GLUT9a(Ä209-316) i GLUT9b(NH2b/Ä209-316)) nie wystêpuj¹ce u cz³owieka. Trans-porter ten na wczesnych etapach podzia³owych zarodka wystêpuje w b³onie komórkowej, jednak¿e w stadium bla-stocysty przemieszcza siê do wnêtrza komórki. Zmiana lokalizacji mo¿e sugerowaæ, ¿e GLUT 9 odgrywa rolê w dostarczaniu glukozy rozwijaj¹cym siê zarodkom przed kompakcj¹. Zwi¹zana z postêpuj¹cym rozwojem zmiana lokalizacji GLUT9 mo¿e byæ tak¿e spowodowana ró¿ni-cowaniem siê komórek zarodka na etapie blastocysty, gdy¿ z wczeniejszych badañ autorów wynika, ¿e GLUT 9 w blastocystach zlokalizowany by³ g³ównie w komórkach trofoektodermy (4). Komórki trofoektodermy i totipotent-ne komórki wêz³a zarodkowego ró¿ni¹ siê pod wzglêdem metabolicznym i najprawdopodobniej GLUT 9 odgrywa szczególn¹ rolê w komórkach trofoektodermy, inn¹ od obserwowanej w niezró¿nicowanych jeszcze zarodkach, dlatego te¿ dochodzi do jego translokacji. W oparciu o metody Western Blot i RT-PCR stwierdzono wystêpo-wanie w rozwoju przedimplantacyjnym u myszy tylko krótszej izoformy GLUT 9b(NH2b/Ä209-316). Wykazano rów-nie¿, ¿e insulina nie ma wp³ywu na lokalizacjê GLUT 9, co wskazuje, ¿e GLUT 4 i GLUT 8 s¹ jedynymi transpor-terami, które w stanie podstawowym znajduj¹ siê we-wn¹trz komórki i dopiero na skutek dzia³ania insuliny prze-mieszczaj¹ siê do b³ony komórkowej.
Podsumowuj¹c, zmiany w wykorzystywaniu glukozy w toku rozwoju embrionalnego wskazuj¹ na specyficzn¹ korelacjê miêdzy metabolizmem glukozy a ekspresj¹ jej transporterów na poszczególnych etapach rozwoju zarod-kowego. Wydaje siê, ¿e niska koncentracja glukozy w ma-cicy, a przede wszystkim wzrost zapotrzebowania na glu-kozê, nasilaj¹cy siê w stadium blastocysty sprawia, ¿e wzmaga siê ekspresja transporterów glukozy na tym eta-pie. Jednak¿e czynnikiem krytycznym nie jest ich liczba, ale specyficzna lokalizacja. Poszczególne izoformy trans-porterów ulegaj¹ ekspresji w okrelonych przedzia³ach komórkowych, spe³niaj¹c swoje indywidualne funkcje.
Pimiennictwo
1.Aghayan M., Rao L. V., James D. E.: Differential sorting of two glucose trans-porter molecules during mouse preimplantation development. Development 1992, 115, 305-312.
2.Ayabe T., Tsutsumi O., Taketami T.: Hexokinase activity in mouse embryo developed in vivo and in vitro. Hum. Reprod. 1994, 9, 347-351.
3.Brison D. R., Leese H. J.: Energy metabolism in late preimplantation rat embryos. J. Reprod. Fertil. 1991, 93, 245-251.
4.Carayannopoulos M. O., Schlein A., Wyman A., Chi M., Keembiyehetty C., Moley K. H.: GLUT 9 is differentially expressed and targeted in the preimplan-tation embryo. Endocrinology 2004, 145, 1435-1443.
5.Chatot C. L., Ziomek C. A., Bavister B. D., Lewis J. Z., Torres H. J.: An im-proved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J. Reprod. Fertil. 1989, 86, 679-688.
6.Chi M., Pingsterhaus J. M., Carayannopoulos M. O., Moley K. M.: Decreased glucose transporter expression triggers BAX-dependent apoptosis in the murine blastocyst. J. Biol. Chem. 2000, 275, 40252-40257.
7.Dan-Goor M., Sasson S., Davarashvili A., Almagor M.: Expression of glucose transporter and glucose uptake in human oocytes and preimplantaion embryos. Hum. Reprod. 1997, 12, 2508-2510.
8.Gandhi A. P., Lane M., Gardner D. K., Krisler R. L.: Substrate utilization in porcine embryos cultured in NCSU-23 and G 1.2/2.2 sequential culture media. Mol. Reprod. Dev. 2001, 58, 269-275.
9.Gardner D. K., Leese H. J.: Non-invasive measurement of nutrient uptake by single cultured pre-implantation embryos. Hum. Reprod. 1986, 1, 25-27. 10.Goot A. J., Hardy K., Winston R. M., Leese H. J.: Non-invasive measurement of
pyruvate and glucose uptake and lactate formation by single human preimplan-tation embryo. Hum. Reprod. 1990, 5, 104-108.
11.Hogan A., Heyner S., Charron M. J., Copeland N. G., Gilbert D. J., Jenn-kins N. A., Thorens B., Schultz G.: Glucose transporter gene expression in early mouse embryos. Development 1991, 113, 363-372.
12.Hooper M. K., Leese H. J.: Activity of hexokinase in mouse oocytes and pre-implantation embryos. Biochem. Soc. Trans. 1989, 17, 546-547.
13.Houghton F. D., Thompson J. G., Kennedy C., Leese H. J.: Oxygen consump-tion and energy metabolism in the early mouse embryo. Mol. Reprod. Dev. 1996, 44, 476-485.
14.Jung C. Y.: The facilitative glucose transport and insulin action. Exp. Mol. Med. 1996, 28, 153-160.
15.Leese H. J., Barton A. M.: Pyruvate and glucose uptake by mouse ova and preimplantation embryos. J. Reprod. Fertil. 1984, 72, 9-13.
16.Leppens-Luisier G., Urner F., Sakkas D.: Facilitated glucose transporters play a crucial role throughuot mouse preimplantation embryo development. Hum. Reprod. 2001, 16, 1229-1236.
17.Lequarre A. S., Grisart B., Moreau B., Schuurbiers N., Massip A., Dessy F.: Glucose metabolism during bovine preimplantation development: analysis of gene expression in single oocytes and embryos. Mol. Reprod. Dev. 1997, 48, 216-226.
18.Machaty Z., Day B. N., Prather R. S.: Development of early porcine embryos in vitro and in vivo. Biol. Reprod. 1998, 59, 451-455.
19.Martin K. L., Hardy K., Winston R. M. L., Leese H. J.: Activity of enzymes of energy metabolism in single human preimplantation embryos. J. Reprod. Fertil. 1993, 99, 259-266.
20.McEvoy T. G., Coull G. D., Broadbent P. J., Hutchinson J. S., Speake B. K.: Fatty acid composition of lipids in immature pig and sheep oocytes with intact zona pellucida. J. Reprod. Fertil. 2000, 118, 163-170.
21.Moley K. H., Chi M., Mueckler M.: Maternal hyperglycemia alters glucose transport and utilization in mouse preimplantation embryos. Am. J. Physiol. 1998, 275, E38-E47.
22.Moley K. H., Chi M. M.-Y., Knudson C. M., Korsmeyer S. J., Mueckler M. M.: Hyperglycemia induces apoptosis in preimplantation embryos via cell death effector pathways. Nat. Med. 1998, 12, 1412-1424.
23.Morita Y., Tsutsumi O., Hosova I., Taketani Y., Oka Y., Kato T.: Expression and possible function of glucose transporter protein GLUT 1 during preiplantation mouse development from oocytes to blastocyst. Biochem. Biophys. Res. Com-mun. 1992, 188, 8-15.
24.Pantaleon M., Kaye P.: Glucose transporters in preimplantation development. Rev. Reprod. 1998, 3, 77-81.
25.Pantaleon M., Ryan J. P., Gil M., Kaye P. L.: An unusual subcellular localiza-tion of GLUT1 and link with metabolism in oocytes and preimplantalocaliza-tion mouse embryos. Biol. Reprod. 2001, 64, 1247-1254.
26.Pinto A. B., Carayannopoulos M. O., Hoehn A., Dowd L., Moley K. H.: Glucose transporter 8 expression and translocation are critical for murine blastocyst survival. Biol. Reprod. 2002, 66, 1729-1733.
27.Rieger D., Loskutoff N. M., Betteridge K. J.: Developmentally related changes in the uptake and metabolism of glucose, glutamine and pyruvate by cattle embryos produced in vitro. Reprod. Fertil. Dev. 1992, 4, 547-557.
28.Sakkas D., Urner F., Menezo Y., Leppens G.: Effects of glucose and fructose on fertilization, clevage and viability of mouse embryos in vitro. Biol. Reprod. 1993, 49, 1288-1292.
29.Sturmey R. G., Leese H. J.: Energy metabolism in pig oocytes and early embryos. Reproduction 2003, 126, 197-204.
30.Swain J. E., Bormann C. L., Krisher R. L.: Development and viability of in vitro derived porcine blastocyst cultured in NCSU-23 and G1.2/2.2 sequential medium. Theriogenology 2001, 56, 459-469.
31.Thompson J. G., Partridge J., Houghton F. D., Cox C. I., Leese H. J.: Oxygen uptake and carbohydrate metabolism by in vitro derived bovine embryos. J. Reprod. Fertil. 1996, 106, 299-306.
32.Urner F., Saakas D.: Glucose participates in sperm-oocyte fusion in the mouse. Biol. Reprod. 1996, 55, 917-922.
33.Wales R. G., Edirisinghe W. R.: Volume of fluid and concentration of cations and energy substrates in the uteri of mice during early pseudopregnancy. Reprod. Fertil. Dev. 1989, 1, 171-178.
34.Wheeler T. J., Hinkle P. C.: The glucose transporter of mammalian cells. Ann. Rev. Phys. 1985, 47, 503-517.
Adres autora: Marta Wasielak, ul. Tuwima 10, 10-747 Olsztyn; e-mail: marta@pan.olsztyn.pl
