Wpływ śliny na zdolność adhezji i tworzenia biofilmu przez szczepy Candida albicans izolowane od pacjentów ze stomatopatią protetyczną

Magdalena Kaczała | Stefania Giedrys-Kalemba

Wpływ śliny na zdolność adhezji i tworzenia

biofilmu przez szczepy Candida albicans

izolowane od pacjentów ze stomatopatią

protetyczną

The influence of saliva on ability to adhesion and biofilm formation

by Candida albicans strains isolated from patients with denture stomatitis

Katedra i Zakład Mikrobiologii i Immunologii Pomorskiego Uniwersytetu Medycznego w Szczecinie

} Magdalena Kaczała, Katedra i Zakład Mikrobiologii i Immunologii Pomorskiego Uniwersytetu Medycznego, Al. Powstańców Wielkopolskich 72, 70-111 Szczecin, Tel.: (91) 466 16 52, Fax: (91) 466 16 59, e-mail: magdulek8@wp.pl

Wpłynęło: 20.02.2012 Zaakceptowano: 08.03.2012

Streszczenie: Celem przeprowadzonych badań było określenie

zdolności adhezji oraz rozwoju biofilmu na materiale akrylowym (w obecności śliny i bez) szczepów Candida albicans izolowanych od pacjentów użytkujących akrylowe uzupełnienia protetyczne, u których stwierdzono przewlekłe zapalenie błony śluzowej o róż-nym nasileniu. Badania mikologiczne wykonano u 97 pacjentów w wieku 43−85 lat, użytkujących ruchome akrylowe uzupełnienia protetyczne. Do badania adhezji grzybów i zdolności tworzenia biofilmu ostatecznie zakwalifikowano 41 szczepów C. albicans. W ocenie stopnia adhezji zastosowano 4-stopniową skalę przy-gotowaną na potrzeby badania. Stopień wzrostu biofilmu ocenia-no spektrofotometrycznie po 48, 72, 96 godzinach. Każdą ocenę przeprowadzano 3-krotnie, z uzyskanych wartości wyliczano śred-nią arytmetyczną, która następnie posłużyła do analizy porów-nawczej. Wszystkie gatunki C.  albicans izolowane od pacjentów ze stomatopatią protetyczną wykazały zdolność adhezji i tworze-nia biofilmu na materiale akrylowym, aczkolwiek bardzo zróżni-cowaną. Nie stwierdzono wyraźnego wpływu śliny na zdolność adhezji i tworzenia biofilmu na materiale akrylowym. Właściwości biologiczne szczepu C. albicans wydają się mieć większy wpływ na zdolność adhezji i tworzenia biofilmu na materiale akrylowym niż czynniki środowiskowe.

Słowa kluczowe: adhezja | biofilm | Candida | stomatopatia Abstract: The aim of the study was to determine the ability of

adhesion and biofilm development to acrylic material (in the pre-sence of saliva or without) Candida albicans strains isolated from patients consuming acrylic denture with chronic inflammation of palatal mucosa. Mycological analysis was performed in 97 pa-tients aged 43−85 years consuming moving acrylic restorations. For testing the ability of adhesion and biofilm formation

ultima-Wstęp

Grzyby z rodzaju Candida, występujące we florze fizjolo-gicznej człowieka, w przypadku obecności czynników pre-dysponujących stają się czynnikiem etiologicznym zakaże-nia. W ontocenozie jamy ustnej, którą stanowi ponad 600 różnych gatunków drobnoustrojów, występują także różne gatunki Candida. Najczęściej izoluje się C. albicans oraz ko-lejno: C. parapsilosis, C. guilliermondii, C. kruzei, C.

dubli-niensis, C. famata. Gatunek C. albicans uważany jest również

za najczęstszy czynnik etiologiczny zakażeń grzybiczych w przebiegu stomatopatii protetycznych, występujących w jamie ustnej osób użytkujących akrylowe uzupełnienia protetyczne. Według danych z piśmiennictwa, są to warto-ści rzędu 70% w porównaniu z innymi gatunkami [1, 2].

tely enrolled 41strains of C. albicans. The degree of adhesion was assessed using 4-point scale, prepared for the study. The degree of biofilm growth was assessed spectrophotometrically after 48, 72, 96 hours. Each evaluation was performed 3 times, with obtained values calculated arithmetic mean, which then was used for com-parative analysis. All C. albicans strains isolated from patients with denture stomatitis showed the ability of adhesion and the biofilm formation on acrylic material, although very different. There was no apparent effect of saliva on the ability of adhesion and biofilm formation on acrylic material by strains of C. albicans. Biological properties of the strain seem to have a greater influence on the ability of adhesion and biofilm formation on acrylic material than environmental factors.

Key words: adhesion | biofilm | Candida | denture stomatitis

jest zabronione i stanowi poważne naruszenie przepisów prawa autorskiego oraz grozi sankcjami prawnymi.

pH, wilgotność, stały dostęp substratów pokarmowych (wę-glowodany), sprzyjają namnażaniu się grzybów. Obecność biomateriału (proteza akrylowa) przyczynia się do miej-scowego wzrostu temperatury, utrudnia samooczyszczanie powierzchni błon śluzowych przez ślinę, a jego porowatość, szorstka struktura strony dośluzówkowej materiału i zdol-ność absorpcji wody ułatwiają adhezję i tworzenie biofil-mu grzybiczego. Obok czynników miejscowych, warunku-jących rozwój zakażenia grzybiczego, wymienia się wiele ogólnoustrojowych czynników ryzyka, jak: przewlekłe cho-roby ogólne, spadek odporności, przewlekła farmakoterapia (przede wszystkim antybiotykoterapia, steroidoterapia, im-munosupresja, leczenie onkologiczne) [3].

Przekroczenie granicy fizjologicznej kolonizacji i rozwój zakażenia zależą zatem od ogólnej kondycji gospodarza, na którą wpływa z kolei wiele czynników. Ze strony drob-noustroju o zakażeniu decyduje zdolność adhezji komórek grzyba do komórek gospodarza i biomateriału, wytworze-nie biofilmu oraz zdolność inwazji w głąb tkanek [4].

Adhezja będąca procesem wstępnym, poprzedzającym kolonizację ontocenozy jamy ustnej, nie zawsze doprowadza do rozwoju zakażenia, ale jest uznawana za ważny czynnik wirulencji i ochrony komórek grzybiczych przed mecha-nizmami obronnymi gospodarza. Namnażanie zaadhero-wanych do powierzchni komórek grzyba prowadzi do wy-tworzenia specyficznej formy wzrostu drobnoustrojów, czyli struktur skomplikowanego biofilmu, którego budowa wykazuje znaczne różnice nie tylko w obrębie rodzaju, ale także gatunku. Rozwój drobnoustrojów w biofilmie nadaje im określone cechy, a przede wszystkim zwiększa oporność na stosowane leki oraz czynniki obronne gospodarza. Ist-nieje wiele czynników modyfikujących przyleganie komórek grzybów w środowisku jamy ustnej. Należą do nich składni-ki śliny (proteiny, mucyny). Rola wpływu śliny na procesy

noznacznie określona [5, 6].

Zakażenia grzybicze pacjentów zaopatrzonych protetycz-nie stanowią wyzwaprotetycz-nie dla lekarza ze względu na trudności w leczeniu, będące konsekwencją bardzo dużego odsetka nawrotów po zaprzestaniu kuracji przeciwgrzybiczej [7].

Jako stomatopatię protetyczną określa się zespół różnych objawów patologicznych (obiektywnych i subiektywnych), za które odpowiada przede wszystkim użytkowanie akrylo-wych uzupełnień protetycznych. Przyczyny rozwoju stoma-topatii mogą być bezpośrednie, związane z mechanicznym urazem wywołanym oddziaływaniem biomateriału na pod-łoże protetyczne (najczęściej błona śluzowa kontaktująca się z płytą protezy akrylowej górnej pokrywającej podniebie-nie twarde). Pośredni wpływ mają choroby ogólnoustrojo-we, nawyki higieniczne, wiek użytkowanego uzupełnienia, skład płytki protez (ang. denture plaque), poziom pH śro-dowiska, a także zakażenia grzybicze [8, 9].

Celem badań było określenie wpływu śliny na zdolność adhezji i tworzenia biofilmu przez szczepy C. albicans izolo-wane od pacjentów ze stomatopatią protetyczną.

Materiał i metody

Badania mikologiczne wykonano u 97 pacjentów w prze-dziale wieku 43−85 lat, użytkujących ruchome akrylowe uzupełnienia protetyczne (obecność protezy górnej z pod-niebienną płytą akrylową) i wykazujących różnie nasilony stan zapalny błony śluzowej w miejscu przylegania płyty protezy. Od każdego pacjenta pobierano wymazy z błony śluzowej podniebienia twardego oraz z dośluzówkowej stro-ny płyty akrylowego uzupełnienia protetycznego. Wyniki posiewów w kierunku grzybów były zróżnicowane: posiewy ujemne, pojedyncze kolonie, dość liczne kolonie. Po

prze-Ryc. 1. 24-dołkowe płytki polistyrenowe z płyn-nym, selektywnym podłożem Sabourauda.

prowadzeniu identyfikacji gatunku do badań adhezji i two-rzenia biofilmu zakwalifikowano 41 szczepów C. albicans.

Do badania adhezji i tworzenia biofilmu użyto jałowych płytek akrylowych, które inkubowano z zawiesiną wyj-ściową o gęstości 107 _{komórek/ml. Stopień adhezji}

anali-zowano według skali (I°–IV°) przygotowanej na potrzeby badań. Jednoczasowo oceniano stopień adhezji do płytek akrylowych czystych oraz opłaszczonych śliną. Obliczono średni stopień adhezji w każdej grupie. Płytki akrylowe przeznaczone do oceny biofilmu umieszczczano w 24-doł-kowych płytkach polistyrenowych z płynnym, selektyw-nym podłożem Sabourauda (z dodatkiem gentamycyny i chloramfenikolu w celu zahamowania wzrostu bakterii występujących fizjologicznie w ślinie), inkubowano 4 dni w warunkach delikatnego wstrząsania, w temperaturze 37°C (Ryc. 1). Stopień wzrostu biofilmu oceniano spektro-fotometrycznie w trzech okresach wzrostu, po upływie 48, 72 i 96 godzin.

Każdą ocenę przeprowadzano trzykrotnie, z uzyskanych wartości wyliczano średnią arytmetyczną, która następnie posłużyła do analizy porównawczej.

Wyniki

Dodatnie posiewy wskazujące na stomatopatię o etio-logii grzybiczej uzyskano u 49 pacjentów, co stanowiło 50,5% wszystkich badanych. U 34 (35,1%) osób izolowano pojedyncze kolonie Candida – tych pacjentów zakwalifi-kowano do grupy z fizjologiczną kolonizacją, natomiast

u 14 (14,4%) pacjentów hodowle w kierunku grzybów były ujemne (Ryc. 2).

Zdolność adhezji i tworzenia biofilmu stwierdzono u wszystkich badanych szczepów C. albicans. Wykazywały one podobny stopień adhezji do płytek akrylowych zarów-no bez śliny, jak i ze śliną – najwięcej szczepów wykazało I° lub II°(Tabela 1, Ryc. 3).

W badanej grupie znalazły się trzy szczepy, które w obec-ności śliny wykazywały obecność pseudostrzępek. Jeden z nich wykazał III° adhezji, dwa pozostałe II°. Obraz obser-wowanych pseudostrzępek przedstawiają Ryciny 4A i 4B.

Wartości pomiaru spektrofotometrycznego biofilmu two-rzonego przez poszczególne szczepy C. albicans wykazywały duże zróżnicowanie, z wyraźną tendencją wzrostową w ko-lejnych przedziałach czasowych, jednakże nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic w zdolności tworzenia biofil-mu na płytkach opłaszczonych śliną, jak i bez śliny –  >0,05. Wyniki przedstawiono graficznie na Rycinie 5.

Dyskusja

Według danych z piśmiennictwa, infekcje grzybicze są stawiane na drugim miejscu, zaraz po urazach mecha-nicznych, jako przyczyna stomatopatii protetycznych  [10], a u pacjentów w podeszłym wieku, użytkujących całodo-bowo uzupełnienia, sięgać mogą nawet 100%  [11]. W in-nych publikacjach jest to odsetek rzędu 37% [12], a według ośrodków amerykańskich stomatopatie związane z zakaże-niem grzybiczym dotyczą 11−67% pacjentów [2].

Ryc. 2. Wyniki badania mikologicznego u pacjentów ze stomatopatią protetyczną.

Szczepy C. albicans bez śliny ze śliną

Stopień adhezji I II III IV I II III IV Liczba szczepów 22 13 5 1 16 18 7 0 Odsetek (%) 54 32 12 2 39 44 17 0 Średni stopień adhezji 1,63 1,88

Tabela 1. Adhezja szczepów C. albicans. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 0 1 2 3 4 5 ze śliną

Ryc. 3. Adhezja szczepów C. albicans.

51%

35%

14%

W badaniach własnych etiologię grzybiczą stomatitis po-twierdzono u 50,5% wszystkich badanych. Różne wartości stomatopatii grzybiczej, uzyskane w badaniach na całym świecie, wynikać mogą z różnej randomizacji badanej popu-lacji. Stomatopatia protetyczna znacznie częściej występuje u tych pacjentów, gdzie w wyniku choroby podstawowej do-chodzi do upośledzenia reakcji odpornościowych, a w kon-sekwencji do szybkiego i łatwego rozwoju zakażenia [13].

Adhezja jest procesem poprzedzającym kolonizację danego środowiska przez drobnoustroje i zależy od wielu czynników związanych z cechami biologicznymi komórek drożdży oraz zależnych od komórek gospodarza, a także-środowiskowych, w tym śliny. Badania nad wpływem śliny na adhezję Candida do materiału akrylowego prowadzo-ne były w wielu ośrodkach i w większości wykazały brak wpływu śliny na ten proces [14]. Podobne wyniki uzyska-no w badaniach własnych, gdzie nie stwierdzouzyska-no istotnego wpływu śliny na stopień adhezji szczepów Candida. Nie wykazano także wpływu śliny na proces tworzenia biofil-mu. Brak wpływu śliny, która zapewnia dostęp składników odżywczych i białek zwiększających przyczepność, można tłumaczyć jej jednoczesnym działaniem przeciwdrobno-ustrojowym poprzez obecność swoistych i nieswoistych czynników obronnych. Suma takiego dwukierunkowe-go oddziaływania w tym przypadku nie ma przełożenia na wzrost adhezji.

Zdolność transformacji morfologicznej komórki droż-dżowej i tworzenie pseudostrzępek odgrywają ważną rolę w patogenezie zakażenia Candida [15]. Powszechnie uważa się, że pseudomycelium wykazuje lepsze zdolności adherent-ne, co wynika z występowania na jej powierzchni odmien-nego zestawu adhezyn w porównaniu z formą drożdżową oraz jest bardziej odporna na fagocytozę przez granulocyty obojętnochłonne, a także ma lepsze zdolności penetrujące tkanki, dzięki zawartej w strzępkach fosfolipazie  [16]. Po-twierdzają to badania własne, w których szczepy

wytwarza-jące pseudostrzępki wykazywały wyższe stopnie adhezji niż pozostałe. Wyższy był także poziom wytworzonego przez te szczepy biofilmu w porównaniu z pozostałymi badanymi szczepami C. albicans [17].

Bardzo duże zróżnicowanie w wynikach adhezji i zdol-ności tworzenia biofilmu przez badane szczepy Candida

al-bicans, jak również brak wpływu śliny na te procesy pozwala

przypuszczać, że poszczególne szczepy posiadają indywidu-alne cechy biologiczne, które dodatkowo są modyfikowane przez czynniki środowiskowe. Wpływają one niewątpliwie na indywidualnie przebiegający proces wzrostu, rozwoju i wywoływania klinicznych objawów zakażenia. Możliwości wyjaśnienia uzyskanego zróżnicowania wyników mogą dać jedynie badania genetyczne szczepów, które pozwolą poznać mechanizmy kontrolujące adhezję i powstawanie struktur biofilmu na poziomie molekularnym. Być może przyczynią się one do opracowania bardziej skutecznych metod walki z zakażeniami grzybiczymi, w tym u pacjentów ze stomato-patią protetyczną.

Ryc. 4A. Obraz pseudostrzępek szczepu o adhezji II°; Ryc. 4B. Obraz pseudostrzępek szczepu o adhezji III°.

0,35 0,40 0,45 0,50 0,55 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85

bez śliny ze śliną

biofilm 48 biofilm 72 biofilm 96

Wszystkie gatunki C.  albicans izolowane od pacjentów ze stomatopatią protetyczną wykazały zdolność adhezji i tworzenia biofilmu na materiale akrylowym, aczkolwiek bardzo zróżnicowaną.

Nie stwierdzono wyraźnego wpływu śliny na zdolność adhezji i tworzenia biofilmu na materiale akrylowym.

Właściwości biologiczne szczepu C. albicans wydają się mieć większy wpływ na zdolność adhezji i tworzenia biofil-mu na materiale akrylowym niż czynniki środowiskowe.

Deklaracja przejrzystości:

Badania finansowane ze środków na naukę w latach 2008−2011 w ramach projektu badawczego.

Konflikt interesów: nie zgłoszono.

Piśmiennictwo

1. Macura AB. Patomechanizm zakażeń grzybiczych. In: Baran E (ed.). Zarys Mikologii Lekarskiej. Volumed, Wrocław, 1998, pp. 289−295.

2. Ramage G, Martínez JP, López-Ribot JL. Candida biofilms on implan-ted biomaterials: a clinically significant problem. FEMS Yeast Res 2006;6(7):979−986.

3. Mierzwińska-Nastalska E, Gołecka M, Ołdakowska-Jedynak U, Pączek L. Wpływ przewlekłej terapii immunosupresyjnej na występowanie sto-matopatii protetycznych powikłanych infekcją grzybiczą u pacjentów po przeszczepieniu narządów. Stomatologia Współczesna 2002;6:21−26. 4. López-Ribot JL. Candida albicans biofilms: more than filamentation. Curr

Biol 2005;15(12):R453−R455.

2007;97(1):32−38.

6. Théraud M, Bédouin Y, Guiguen C, Gangneux JP. Efficacy of antiseptics and disinfectants on clinical and environmental yeast isolates in plank-tonic and biofilm conditions. J Med Microbiol 2004;53(10):1013−1018. 7. Majewski S. Badania nad rolą grzybów drożdżopodobnych w

etiopato-genezie stomatitis prothetica. Rozprawa habilitacyjna. Akademia Me-dyczna, Kraków, 1979.

8. Spiechowicz E. Dylematy współczesnej rehabilitacji protetycznej. Protet Stomatol 2006;56(3):175−185.

9. Spiechowicz E. Przyczyny powstawania stomatopatii protetycznych. In: Widłak-Piernikowa T (ed.). Stomatopatie Protetyczne. Wydawnictwo Le-karskie PZWL,Warszawa, 1993, pp. 21−37.

10. Spiechowicz E. Rozpoznawanie i różnicowanie stomatopatii protetycz-nych. In: Widłak-Piernikowa T (ed.). Stomatopatie Protetyczne. Wydaw-nictwo Lekarskie PZWL, Warszawa, 1993, pp. 39−57.

11. Budtz-Jörgensen E. Etiology, pathogenesis, therapy and prophylaxis of oral yeast infection. Acta Odontol Scand 1990;48(1):61−69.

12. Weber-Dubaniewicz M, Bereznowski Z, Kędzia A, Ochocińska J. Stężenie białka całkowitego, immunoglobuliny A (IgA), laktoferyny i lizozymu w ślinie użytkowników akrylowych protez ruchomych z objawami sto-matopatii protetycznej. Protet Stomatol 2007;57(5):339−343.

13. Dorocka-Bobkowska B, Leśniewska K, Łukaszewska M. Wydzielnicza immunoglobulina A śliny u pacjentów ze stomatopatią protetyczną po-wikłaną zakażeniem grzybiczym. Dent Med Probl 2009;46(4):417−423. 14. Ramage G, Tomsett K, Wickes BL, López-Ribot JL, Redding SW. Denture

stomatitis: a role for Candida biofilms. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2004;98(1):53−59.

15. Mnichowska M, Giedrys-Kalemba S. Funkcjonalne, strukturalne i moleku-larne spojrzenie na adhezję Candida spp. Mikol Lek 2004;11(4):309−316. 16. Sysło J, Macura AB. Badania nad niektórymi determinantami

patogenno-ściu grzybów z rodzaju Candida. Mikol Lek 1998;5(3):149−155. 17. Kaczała M. Wpływ czynników środowiska naturalnego na tworzenie

bio-filmu przez szczepy Candida spp. izolowane z różnych ontocenoz i ma-teriałów klinicznych. Praca doktorska. Pomorski Uniwersytet Medyczny, Szczecin, 2011.