Widok Struktura chromatyny a powstawanie i naprawa uszkodzeń DNA

P

W

Zak³ad Radiobiologii Doœwiadczalnej i Klinicznej

Centrum Onkologii - Instytut im. Marii Sk³adowskiej-Curie, Oddzia³ w Gliwicach Wybrze¿e Armii Krajowej 15, 44-100 Gliwice

e-mail: widlak@io.gliwice.pl

STRUKTURA CHROMATYNY A POWSTAWANIE I NAPRAWA USZKODZEÑ DNA

WPROWADZENIE

Genomy wszystkich organizmów nara¿one s¹ na dzia³anie czynników maj¹cych zdolnoœæ modyfikacji chemicznej struktury DNA, czyli in-dukowania uszkodzeñ DNA. Do takich czynni-ków, nazywanych genotoksycznymi, nale¿¹ ró¿-norodne substancje chemiczne i niektóre ro-dzaje promieniowania elektromagnetycznego. Jednym z rodzajów endogennych czynników genotoksycznych s¹ reaktywne formy tlenu, bêd¹ce produktami metabolizmu komórkowe-go. Efektem dzia³ania substancji takich jak wol-ne rodniki tlenowe s¹ oksydacyjwol-ne modyfikacje zasad azotowych DNA (w tym 8-okso-deoksyg-uanina, traktowana czêsto jako znacznik oksy-dacyjnych uszkodzeñ DNA) oraz pêkniêcia jed-nej lub obu nici DNA (ang. single-, do-uble-strand breaks). Œrodowiskowe czynniki ge-notoksyczne to przede wszystkim promienio-wanie ultrafioletowe i promieniopromienio-wanie joni-zuj¹ce, ale równie¿ liczne chemiczne zwi¹zki al-kiluj¹ce i aryluj¹ce (wœród nich policykliczne wêglowodory aromatyczne). Fotouszkodzenia DNA indukowane przez promieniowanie UV to g³ównie dimery pirymidynowe, zaœ promienio-wanie jonizuj¹ce indukuje przede wszystkim oksydacyjne modyfikacje zasad i pêkniêcia nici DNA. Alkiluj¹ce i aryluj¹ce zwi¹zki chemiczne mog¹ kowalencyjnie wi¹zaæ siê z nukleotydami tworz¹c tak zwane addukty DNA. Wszystkie ta-kie uszkodzenia DNA w mniejszym lub wiêk-szym stopniu zmieniaj¹ strukturê chromoso-mów i zaburzaj¹ procesy ich replikacji.

Ponie-wa¿ replikacja DNA zawieraj¹cego uszkodzenia wi¹¿e siê z ryzykiem powstania mutacji, obec-noœæ takich uszkodzeñ jest szczególnie niebez-pieczna w komórkach dziel¹cych siê.

Komórki dysponuj¹ detektorami uszkodzeñ DNA i po ich wykryciu uruchamiaj¹ kilka typów odpowiedzi. Podstawow¹ odpowiedzi¹ komór-ki na uszkodzenia DNA jest jego naprawa, po-zwalaj¹ca na usuniêcie uszkodzenia i odtworze-nie prawid³owej struktury DNA. Jednoczeœodtworze-nie z zainicjowaniem naprawy, w komórkach uru-chamiane s¹ mechanizmy prowadz¹ce do zablo-kowania cyklu komórkowego (ang. checkpoint control system). Zablokowanie cyklu komórko-wego wyd³u¿a czas na naprawê DNA przed re-plikacj¹ i podzia³em chromosomów. Uszkodze-nia DNA, które nie mog¹ byæ naprawione, s¹ czêsto eliminowane razem z ca³¹ komórk¹. Pro-ces umo¿liwiaj¹cy takie rozwi¹zanie nazywamy apoptoz¹, czy inaczej — programowan¹ œmier-ci¹ komórki. W organizmach funkcjonuj¹ ró¿ne mechanizmy naprawy DNA. Najprostszy z nich to tak zwana naprawa bezpoœrednia, pozwa-laj¹ca na naprawê niektórych typów fotouszko-dzeñ (proces katalizowany przez fotoliazy DNA), czy alkilowanych nukleotydów (katalizo-wany przez odpowiednie metylotransferazy). Wiele typów uszkodzeñ usuwanych jest z DNA za poœrednictwem naprawy przez wycinanie. W naprawie takiej uszkodzony nukleotyd usuwa-ny jest wraz z fragmentem jednej nici DNA, a brakuj¹cy fragment syntetyzowany jest na

ma-Numer 1

(254)

trycy nici komplementarnej. W mechanizmie naprawy przez wyciêcie zasady (ang. base exci-sion repair, BER) naprawiane s¹ g³ównie zasady oksydowane lub alkilowane. Z kolei w mechani-zmie naprawy przez wyciêcie nukleotydu (ang. nucleotide excision repair, NER) usuwane s¹ fo-touszkodzenia indukowane przez promienio-wanie UV czy addukty indukowane przez poli-cykliczne wêglowodory aromatyczne. W me-chanizm ten zaanga¿owanych jest ponad trzy-dzieœci bia³ek o ró¿nej aktywnoœci enzymatycz-nej (miedzy innymi helikazy, nukleazy, polime-razy i ligazy DNA). Pêkniêcia obu nici DNA, uszkodzenia szczególnie niebezpieczne dla ko-mórek, naprawiane s¹ dziêki mechanizmom re-kombinacyjnym: rekombinacji homologicznej (HR) oraz ³¹czenia koñców niehomologicznych (NHEJ). Poniewa¿ powstawanie uszkodzeñ DNA jest procesem ci¹g³ym, sprawnoœæ mecha-nizmów naprawy DNA ma ogromne znacznie dla utrzymania stabilnoœci genomu. Os³abienie wydajnoœci naprawy DNA (wynikaj¹ce na przyk³ad z mutacji w genach koduj¹cych bia³ka naprawcze) wi¹¿e siê ze zwiêkszonym ryzy-kiem powstawania mutacji i rozwoju chorób nowotworowych. Szczegó³owe omówienie procesów prowadz¹cych do powstawania uszkodzeñ DNA i mechanizmów ich naprawy oraz zwi¹zków z procesami mutagenezy i nowo-tworzenia znajdzie Czytelnik w innych pracach przegl¹dowych, w tym wielu pracach publiko-wanych w jêzyku polskim (PIETRZYKOWSKA i KRWAWICZ 1999, TRZECIAK i B£ASIAK 1999, TUDEK1999, ZDZIENICKA 1999).

Materia³ genetyczny ma w komórkach eu-kariotycznych postaæ chromatyny, czyli kom-pleksu DNA, histonów i innych bia³ek. Podsta-wow¹ jednostk¹ strukturaln¹ chromatyny jest nukleosom, zbudowany z oktameru histono-wego (centralny tetramer [H3/H4]2i dwa

pe-ryferyjne dimery [H2A/H2B]), wokó³ którego owiniête jest 146 par nukleotydów. Pomiêdzy kolejnymi nukleosomami znajduje siê, wra¿li-wy na dzia³anie nukleaz, DNA ³¹cznikowra¿li-wy o zmiennej d³ugoœci (10-90 par zasad), który mo¿e oddzia³ywaæ z histonem H1 lub innymi niehistonowymi bia³kami chromatyny. W³ókno nukleosomowe mo¿e byæ

pofa³dowa-ne w bardziej skomplikowapofa³dowa-ne struktury o ró¿-nym stopniu upakowania; najwiêkszy stopieñ upakowania osi¹ga chromatyna w chromoso-mie metafazowym. W³ókna chromatyny ko-mórek interfazowych mog¹ oddzia³ywaæ z la-min¹ j¹drow¹ i z hipotetyczn¹, wewn¹trz-j¹drow¹ struktur¹ szkieletow¹, tak zwan¹ ma-cierz¹ j¹drow¹. Oddzia³ywania chromatyny z takimi bia³kami szkieletowymi umo¿liwiaj¹ tworzenie strukturalnie i funkcjonalnie wyod-rêbnionych domen, tak zwanych pêtli chro-matyny. Kolejne struktury chromatyny po-zwalaj¹ na uporz¹dkowane upakowanie d³ugich cz¹steczek DNA na terenie j¹dra ko-mórkowego oraz maj¹ istotne znaczenie dla regulacji wszystkich procesów metabolicz-nych przebiegaj¹cych w j¹drze. Informacje dotycz¹ce struktury nukleosomów i organiza-cji chromatyny w j¹drze znajdzie Czytelnik w innych pracach przegl¹dowych (HAYES i HANSEN2001, WOODCOCKi DIMITROV2001). Nukleosomowa organizacja chromatyny ma, poza funkcjami strukturalnymi, decyduj¹ce znaczenie dla regulacji ekspresji materia³u ge-netycznego. We frakcji chromatyny o du¿ym stopniu kondensacji (tzw. heterochromatyna) nukleosomy s¹ czynnikiem odpowiedzialnym za represjê transkrypcji. Zmiana struktury nu-kleosomów i os³abienie oddzia³ywañ DNA z histonami pozwala na udostêpnienie DNA dla swoistych czynników transkrypcyjnych i poli-meraz RNA. Zmiany struktury nukleosomów i stopnia upakowania chromatyny, pozwa-laj¹ce na regulacjê transkrypcji, zale¿ne s¹ miêdzy innymi od kowalencyjnych modyfika-cji DNA (metylacja) i histonów (acetylacja, metylacja i fosforylacja) oraz od aktywnoœci kompleksów remodeluj¹cych chromatynê. Szersze omówienie zwi¹zków miêdzy tran-skrypcj¹ a nukleosomow¹ struktur¹ chroma-tyny mo¿na znaleŸæ w licznych pracach przegl¹dowych (KORNBERG 1999, ALFS i KINGSTON 2000, WU i GRUNSTEIN 2000). Struktura nukleosomowa chromatyny (i jej ewentualne zmiany) jest czynnikiem decy-duj¹cym równie¿ o przebiegu procesów na-prawy. Zagadnienie to jest przedmiotem ni-niejszej pracy.

STRUKTURA CHROMATYNY MODULUJE PODATNOή DNA NA CZYNNIKI GENOTOKSYCZNE

Decyduj¹ce znaczenie dla powstania dane-go typu uszkodzeñ DNA ma struktura nukle-otydu i jej swoiste oddzia³ywania chemiczne z

czynnikiem uszkadzaj¹cym. Przyk³adowo: do-datkowe wi¹zania indukowane przez promie-niowanie UV tworz¹ siê miêdzy pierœcieniami

s¹siaduj¹cych pirymidyn, a zwi¹zki alkilujace preferuj¹ atom N7 guaniny. Jednak podatnoœæ konkretnego nukleotydu na uszkodzenia mo-dulowana jest przez szereg innych czynników. Nale¿¹ do nich struktura przestrzenna danego fragmentu DNA czy kontekst sekwencji DNA (czyli rodzaj s¹siaduj¹cych nukleotydów). Do-datkowo podatnoœæ konkretnego fragmentu DNA na uszkodzenia modulowana jest przez oddzia³uj¹ce z nim bia³ka. Od lat znany jest fakt, i¿ struktura nukleosomowa ma wp³yw na iloœæ uszkodzeñ DNA. Poziom adduktów indukowa-nych przez wiele chemiczindukowa-nych zwi¹zków ge-notoksycznych, podobnie jak poziom tzw. (6-4)-fotoproduktów indukowanych przez promieniowanie UV, jest wielokrotnie wy¿szy w DNA ³¹cznikowym ni¿ w DNA z rdzenia nu-kleosomów. Z kolei w plemnikach, gdzie histo-ny zast¹pione s¹ przez protamihisto-ny (co pozwala na silniejsz¹ ni¿ w nukleosomach kondensacjê chromatyny), DNA jest bardziej oporny na uszkadzenia ni¿ DNA z komórek somatycznych (WID£AK 1994, 1997). Innymi bia³kami, któ-rych oddzia³ywania z DNA moduluj¹ jego po-datnoœæ na uszkodzenia s¹ czynniki transkryp-cyjne. Zwi¹zanie czynnika transkrypcjnego mo¿e zmniejszyæ lub zwiêkszyæ wydajnoœæ z jak¹ czynniki genotoksyczne uszkadzaj¹ DNA w obrêbie miejsca wi¹zania. Fakt ten

wykorzy-stywany jest do mapowania miejsc wi¹zania czynników transkrypcyjnych w ¿ywej komór-ce (ang. footprinting); wykorzystuje siê do tego najczêœciej proste czynniki alkilujace ta-kie jak siarczan dwumetylu (DMS). Stwierdzo-no, ¿e wi¹zanie takich czynników transkrypcyj-nych jak Sp1, AP-1 czy NF-1 wielokrotnie zwiê-ksza poziom fotouszkodzeñ indukowanych przez promieniowanie UV. Wskazuje to, ¿e po-ziom uszkodzeñ w pewnych regionach DNA mo¿e mieæ charakter swoisty tkankowo (TORNALETTI i PFEIFER 1995).

W niektórych sekwencjach DNA prawdo-podobieñstwo zaistnienia mutacji jest wielo-krotnie wy¿sze ni¿ w innych fragmentach tego samego genu. Powstanie takich gor¹cych punktów mutacyjnych (ang. mutation hot spots) jest wypadkow¹ kilku czynników, mie-dzy innymi: (i) szybkoœci uszkadzania danego nukleotydu, (ii) wydajnoœci naprawy tego nu-kleotydu i (iii) dok³adnoœci z jak¹ polimerazy DNA odczytuj¹ dane uszkodzenie. Struktura chromatyny i obecnoœæ zwi¹zanych bia³ek jest jednym z czynników decyduj¹cych o czêstoœci z jak¹ dany nukleotyd jest uszkadzany. Podob-nie, oddzia³ywanie z bia³kami jest czynnikiem moduluj¹cym wydajnoœæ naprawy tego nukle-otydu. Zagadnienie to zostanie omówione w dalszej czêœci artyku³u.

STRUKTURA CHROMATYNY DECYDUJE O SZYBKOŒCI NAPRAWY DNA

Ju¿ w latach 70. stwierdzono, ¿e naprawcza synteza DNA jest szybsza w DNA ³¹cznikowym ni¿ w DNA zwi¹zanym z rdzeniem nukleoso-mów. Natomiast rekonstytucja nukleosomów na DNA plazmidowym (tworzenie tak zwa-nych minichromosomów) jest czynnikiem wielokrotnie spowalniaj¹cym jego naprawê (WID£AK1997). W po³owie lat 80. w laborato-rium P. Hanawalta wykryto, ¿e indukowane przez promieniowanie UV dimery pirymidyno-we usuwane s¹ wielokrotnie szybciej z aktyw-nego genu reduktazy dwuhydrofolianowej ni¿ z innych czêœci genomu tych samych komórek. Wkrótce potem stwierdzono, ¿e fotouszkodze-nia usuwane s¹ szybciej z nici bêd¹cej matryc¹ w procesie transkrypcji (niæ antysensowna), ni¿ z nie transkrybowanej nici sensownej (BOHR 1991). Taka preferencyjna naprawa DNA dotyczy naprawy przez wycinanie nukle-otydu (NER). Obecnie wiadomo, ¿e w komór-kach funkcjonuj¹ dwa rodzaje tego mechani-zmu reperacyjnego. Naprawa nici

transkrybo-wanej, (ang. transcription-coupled NER TC-NER), ca³kowicie zale¿na jest od transkryp-cji, a sygna³em dla jej rozpoczêcia jest zabloko-wanie polimerazy II RNA na uszkodzonym nu-kleotydzie. W komórkach bakteryjnych prze-bieg TC-NER zale¿ny jest od bia³ka TRCF, które inicjuje dysocjacjê polimerazy RNA z dzonej matrycy i stymuluje wi¹zanie z uszko-dzonym DNA kompleksu naprawczego UvrABC nukleazy. Mechanizm TC-NER w ko-mórkach eukariotycznych nie jest do koñca wyjaœniony; czynniki swoiœcie zwi¹zane z tym rodzajem naprawy w komórkach ludzkich to bia³ka CSA i CSB. DNA nieaktywny transkryp-cyjnie i niæ sensowna genów transkrybowa-nych naprawiana jest w mechanizmie okreœlo-nym z ang. global genome NER, GG-NER. Czyn-nikiem swoistym dla GG-NER jest bia³ko XPC; pozosta³e bia³ka reperacyjne s¹ wspólne dla obu rodzajów naprawy przez wyciêcie nukle-otydu (WID£AK 1997, PIETRZYKOWSKA i KRWAWICZ 1999, TRZECIAK i B£ASIAK 1999).

Preferencyjna naprawa nici transkrybowanej sprawia, ¿e mutacje znacznie czêœciej wywo³ywane s¹ przez uszkodzenia nici sen-sownej ni¿ uszkodzenia nici antysensen-sownej, nawet jeœli obie nici uszkadzane s¹ z podobn¹ czêstoœci¹. Przyk³adem mo¿e byæ wolna napra-wa uszkodzeñ nici sensownej w miejscach od-powiedzialnych za powstawanie „gor¹cych” punktów mutacyjnych w genie p53

(DENISSENKO i wspó³aut. 1998).

Chocia¿, poza aktualnie transkrybowanymi niæmi DNA, ca³y genom naprawiany jest przy udziale mechanizmu GG-NER, to ró¿ne obszary genomu naprawiane s¹ ró¿n¹ szybkoœci¹. Uszkodzenia usuwane s¹ 2-3-krotnie wolniej z DNA znajduj¹cego siê w silnie skondensowa-nej heterochromatynie ni¿ z genów aktywnych lub potencjalnie aktywnych znajduj¹cych siê chromatynie o luŸniejszej strukturze (BOHR

1991). Równie¿ ró¿ne fragmenty tego samego genu mog¹ byæ naprawiane z ró¿n¹ szybkoœci¹. Decyduj¹ o tym swoiste oddzia³ywania z histo-nami lub innymi bia³kami niehistonowymi. Przyk³adem mo¿e byæ bardzo wolna naprawa

promotora w regionie oddzia³uj¹cym z czynni-kami transkrypcyjnymi (GAO i wspó³aut. 1994). Jedn¹ z cech chromatyny aktywnej tran-skrypcyjnie s¹ jej oddzia³ywania ze strukturami szkieletowymi j¹dra, a frakcja DNA zwi¹zanego z macierz¹ j¹drow¹ jest zwykle wzbogacona w geny transkrybowane. Wiadomo, ¿e te rodzaje uszkodzeñ, które mog¹ byæ naprawiane prefe-rencyjnie w mechanizmie TC-NER (np. foto-uszkodzenia) usuwane s¹ najszybciej z frakcji DNA zwi¹zanego z macierz¹ j¹drow¹ (MULLENDERS i wspó³aut. 1990). Ostatnio stwierdzono, ¿e swoiste dla TC-NER bia³ko CSA ulega przemieszczeniu do macierzy j¹drowej w komórkach poddanych dzia³aniu czynników uszkadzaj¹cych DNA (KAMIUCHI i wspó³aut. 2002). Sugeruje to, ¿e mechanizmy naprawy DNA (a przynajmniej mechanizm TC-NER) zlo-kalizowane s¹ w macierzy j¹drowej. Nie mo¿na jednak wykluczyæ, ¿e szybka naprawa DNA zwi¹zanego z macierz¹ j¹drow¹ jedynie od-zwierciedla preferencyjn¹ naprawê genów ak-tywnych transkrypcyjnie, zlokalizowanych w pobli¿u tej struktury.

ZMIANY STRUKTURY CHROMATYNY W TRAKCIE NAPRAWY DNA

Typow¹ cech¹ niemal wszystkich mechani-zmów naprawy jest to, ¿e bior¹ w nich udzia³ olbrzymie kompleksy bia³kowe, a naprawiany DNA poddany jest wielu zmianom struktural-nym (rozplatanie, obróbka nukleolityczna czy synteza nici). Mo¿na wiêc ³atwo wyobraziæ so-bie, ¿e upakowana struktura chromatyny (czy sama obecnoœæ nukleosomów) jest czynni-kiem spowalniaj¹cym lub nawet uniemo¿li-wiaj¹cym naprawê uszkodzeñ. Szereg danych wskazuje, ¿e w trakcie naprawy DNA struktura chromatyny ulega istotnym zmianom. Stwier-dzono na przyk³ad, ¿e dimery pirymidynowe usuwane s¹ z DNA rdzenia nukleosomu z szyb-koœci¹ niezale¿n¹ od ich po³o¿enia wzglêdem oktameru histonowego. Sugeruje to, ¿e w trak-cie naprawy zachodzi rearan¿acja struktury nu-kleosomów (lub nawet ich ca³kowite usuwa-nie) (SMERDON 1991).

Procesy, które u³atwiaj¹ oddzia³ywanie bia³ek naprawczych z uszkodzeniami maj¹ swoje analogie w znacznie lepiej poznanych mechanizmach reguluj¹cych aktywnoœæ tran-skrypcyjn¹ chromatyny i u³atwiaj¹cych wi¹za-nie czynników transkrypcyjnych. Dwa spoœród wielu mechanizmów modyfikuj¹cych struktu-rê chromatyny wydaj¹ siê mieæ decyduj¹ce

zna-czenie dla regulacji aktywnoœci transkrypcyj-nej. Jednym z nich jest acetylacja histonów ka-talizowana przez swoiste acetylotransferazy. Acetylacja reszt lizynowych w aminowych koñ-cach histonów neutralizuje dodatni ³adunek grup aminowych, zmieniaj¹c ich oddzia³ywa-nia z DNA i innymi bia³kami, co inicjuje lokaln¹ dekondensacjê w³ókna nukleosomowego. Na-tomiast deacetylacja histonów katalizowana przez swoiste deacetylazy zwiêksza stopieñ kondensacji chromatyny (BROWN i wspó³aut. 2000, CHENi wspó³aut. 2001). Drugim czynni-kiem u³atwiaj¹cym wi¹zanie czynników tran-skrypcyjnych jest aktywnoœæ kompleksów re-modeluj¹cych chromatynê. Kompleksy te sk³adaj¹ siê z kilku-kilkunastu podjednostek, w ich sk³ad wchodz¹ bia³ka posiadaj¹ce domenê helikazy, a ich aktywnoœæ zale¿na jest od hydro-lizy ATP. Efektem dzia³ania kompleksów remo-deluj¹cych chromatynê jest zwykle przemiesz-czenie DNA wzglêdem oktameru histonowego (mechanizm ich dzia³ania nie jest jednak jasny) (CALIKOWSKI 2001, FLAUS i OWEN-HUGHES

2001). Zarówno acetylotransferazy (i deacety-lazy) histonów, jak i kompleksy remodeluj¹ce chromatynê swoiœcie oddzia³uj¹ z czynnikami transkrypcyjnymi, maj¹c charakter

aktywato-rów (lub represoaktywato-rów) transkrypcji. Przyk³a-dem mog¹ byæ oddzia³ywania acetylotransfe-raz z czynnikiem transkrypcyjnym E2F lub de-acetylaz z kompleksem bia³ek pRB i E2F, regu-luj¹ce aktywnoœæ genów decyduj¹cych o wejœ-ciu komórek w fazê S cyklu komórkowego (HARBOUR i DEAN 2000).

Wyniki badañ prowadzonych w ostatnich latach wskazuj¹, ¿e aktywnoœæ acetylotransfe-raz histonów i kompleksów remodeluj¹cych chromatynê ma istotne znaczenie dla stymula-cji naprawy DNA (przynajmniej w przypadku mechanizmu NER). We wszystkich znanych kompleksach remodeluj¹cych chromatynê obecne s¹ bia³ka z rodziny SWI2/SNF2, ATP-azy maj¹ce domenê strukturaln¹ helikazy DNA. Do rodziny SWI2/SNF2 nale¿y równie¿ kilka bia³ek bior¹cych udzia³ w naprawie DNA: Rad16 (mechanizm GG-NER u dro¿d¿y), CSB/Rad26 (mechanizm TC-NER), Rad5 (na-prawa postreplikacyjna) i Rad54 (na(na-prawa re-kombinacyjna) (FYODOROV i KADONAGA

2001). Stwierdzono, ¿e bia³ko CSB wykazuje zdolnoœæ remodelowania struktury nukleoso-mów (CITTERIO i wspó³aut. 2000). Z kolei na-prawa fotouszkodzeñ obecnych w minichro-mosomach stymulowana by³a przez czynnik re-modeluj¹cy chromatynê ACF (URAi wspó³aut. 2001). Jednym z czynników zwi¹zanych z NER jest bia³ko XPE, sk³adaj¹ce siê dwu podjedno-stek p48 i p127. Bia³ko to swoiœcie wi¹¿ê siê z DNA uszkodzonym przez promieniowanie UV (inna jego nazwa to bia³ko UV-DDB), a jego obecnoœæ jest niezbêdna dla naprawy chroma-tyny, lecz nie „nagiego” DNA. Stwierdzono, ¿e podjednostka p48 oddzia³uje z acetylotransfe-raz¹ histonów CBP/p300 (DATTA i wspó³aut. 2001). Kolejn¹ acetylotransferaz¹ histonów jest bia³ko GCN5, wchodz¹ce miêdzy innymi w sk³ad kompleksu transkrypcyjnego TFTC. In-nym sk³adnikiem tego kompleksu jest bia³ko SAP130, wykazuj¹ce bardzo siln¹ homologiê z podjednostk¹ p127 bia³ka UV-DDB. Stwierdzo-no, ¿e czynnik TFTC preferencyjnie wi¹¿e siê z chromatyn¹ uszkodzon¹ przez promieniowa-nie UV i katalizuje acetylacjê histonów w miej-scu uszkodzenia (BRAND i wspó³aut. 2001).

Czêœæ „instrukcji” o sposobie ekspresji in-formacji genetycznej zawarta jest w struktu-rze chromatyny. Tote¿ naprawa DNA, poza przywróceniem prawid³owej struktury i se-kwencji nukleotydów, musi pozwalaæ na od-tworzenie pierwotnej struktury chromatyny w miejscu uszkodzenia. Precyzyjne odtworze-nie struktury nukleosomów jest szczególodtworze-nie

istotne w regionach reguluj¹cych aktywnoœæ genów. Tak wiêc mechanizmy rekonstytucji chromatyny musz¹ wydajnie wspó³dzia³aæ z mechanizmami naprawy DNA. Zaobserwowa-no, ¿e jeœli DNA plazmidowy zawieraj¹cy uszkodzenia indukowane przez promienio-wanie UV inkubowany by³ z ekstraktami ko-mórkowymi, to naprawa uszkodzeñ skorelo-wana by³a z upakowaniem plazmidu w nukle-osomy. Taka rekonstytucja chromatyny prze-biega³a jednoczeœnie z syntez¹ naprawcz¹ DNA i zale¿na by³a od kompleksu bia³kowego CAF1 (ang. chromatin assembly factor 1), czynnika zwi¹zanego z replikacj¹ DNA (GAILLARD i wspó³aut. 1996). Równie¿ inny czynnik zwi¹zany z replikacj¹, kompleks bia³kowy RCAF (ang. replication-coupling as-sembly factor), mo¿e braæ udzia³ rekonstytucji nukleosomów na DNA zawieraj¹cym fotousz-kodzenia (TYLER i wspó³aut. 1999). Mog³oby to sugerowaæ, ¿e rekonstytucja nukleosomów na naprawianym DNA jest mechanicznie zwi¹zana z reperacyjn¹ syntez¹ DNA. Jednak fakt, ¿e w trakcie naprawy DNA rearan¿acji ulega fragment chromatyny o d³ugoœci nawet kilku tysiêcy par nukleotydów, a nowosynte-tyzowana niæ DNA ma oko³o 30 nukleotydów (w przypadku NER), wskazuje na bardziej z³o¿ony zwi¹zek miedzy napraw¹ a rekonsty-tucj¹ chromosomów. Stwierdzono, ¿e rekon-stytucja nukleosomów w trakcie naprawy DNA plazmidowego obejmuje kilka (4 do 6) nukleosomów w obu kierunkach od uszko-dzenia. Co ciekawe, tak¹ rekonstytucjê nukle-osomów obserwowano nawet jeœli reperacyj-na synteza DNA (lecz nie wczeœniejsze etapy naprawy) zosta³a zablokowana przez inhibi-tor polimerazy DNA (GAILLARD i wspó³aut. 1997). Wskazuje to, ¿e sygna³em dla rekonsty-tucji nukleosomów s¹ poœrednie produkty na-prawy.

Mechanizm NER jest w obecnej chwili naj-lepiej zbadanym mechanizmem naprawy DNA. Najlepiej znane s¹ równie¿ zmiany struktury chromatyny towarzysz¹ce temu rodzajowi na-prawy (Ryc. 1). Mo¿na przypuszczaæ, ¿e podob-ne zmiany, to jest rearan¿acja struktury nukle-somów u³atwiaj¹ca dostêp bia³ek naprawczych do uszkodzenia i koñcz¹ce naprawê odtworze-nie struktury chromatyny, towarzysz¹ rówodtworze-nie¿ innym mechanizmom naprawy DNA. Przyk³ad-owo, aktywnoœæ kompleksu RCAF niezbêdna jest dla naprawy pêkniêæ nici DNA (TYLER i wspó³aut. 1999).

STRUKTURA CHROMATYNY A ROZPOZNANIE USZKODZEÑ DNA

Rozpoznanie uszkodzenia jest pierwszym etapem wszystkich mechanizmów naprawy DNA. Bior¹ w nim udzia³ swoiste bia³ka detek-torowe. Podobne detektory uszkodzeñ rozpo-czynaj¹ równie¿ szlaki przekazywania sygna³u prowadz¹cego do blokady cyklu komórkowe-go czy indukcji apoptozy. Bia³ka naprawcze rozpoznaj¹ce uszkodzenia maj¹ dwojaki cha-rakter. Czêœæ z nich jest enzymami, dla których uszkodzony nukleotyd jest swoistym substra-tem (na przyk³ad glikozylazy DNA zwi¹zane z mechanizmem BER). Inne bia³ka detektorowe rozpoznaj¹ nie tyle zmianê struktury chemicz-nej nukleotydu, co wywo³ane przez uszkodze-nia zaburzeuszkodze-nia dwuniciowej struktury DNA.

Detektorami rozpoznaj¹cymi takie zmiany struktury DNA s¹ kompleksy XPC/HR23B i XPA/RPA, zwi¹zane z mechanizmem NER. Na-tomiast dwuniciowe pêkniêcia DNA rozpozna-wane s¹ przez dimer Ku70/Ku86, podjednost-kê kinazy bia³kowej zale¿nej od DNA (DNA-PK), które to bia³ko bierze udzia³ w me-chanizmie ³¹czenia koñców niehomologicz-nych (NHEJ) (WOOD1999, WID£AK 2000).

Chocia¿ oddzia³ywania bia³ek detektoro-wych z uszkodzonym DNA s¹ doœæ dobrze po-znane, to wiedza na temat rozpoznawania tych samych uszkodzeñ znajduj¹cych siê w œrodowi-sku chromatyny jest bardzo ograniczona. Miê-dzy innymi nie jest w pe³ni jasne, czy rozpozna-nie uszkodzeñ obecnych w chromatyrozpozna-nie wyma-ga dodatkowych bia³ek (takim czynnikiem wspomagaj¹cym mog³oby byæ w przypadku me-chanizmu NER bia³ko UV-DDB). Nie wiadomo równie¿ czy (i do jakiego stopnia) sygna³em dla bia³ek detektorowych s¹ zmiany struktury chro-matyny wywo³ane uszkodzeniem DNA. Takie zmiany w strukturze chromatyny poznane s¹ najlepiej w przypadku dwuniciowych pêkniêæ DNA. W laboratorium W. Bonnera zaobserwo-wano, ¿e w ci¹gu kilku minut od powstania pêk-niêæ DNA, indukowanych przez promieniowa-nie jonizuj¹ce (ale rówpromieniowa-nie¿ powstaj¹cych w trakcie apoptozy lub rekombinacji V(D)J), do-chodzi do lokalnej fosforylacji histonu H2AX (jeden z wariantów histonu H2A). Taka fosfory-lacja katalizowana jest przez serynowo/treoni-nowe kinazy bia³kowe z rodziny ATM — bia³ka DNA-PK, ATM lub ATR i mo¿e prowadziæ do zmian w strukturze nukleosomów. W ci¹gu kil-kudziesiêciu minut od powstania dwunicio-wych pêkniêæ DNA fosforylacjê histonu H2AX obserwuje siê w obszarach chromatyny obej-muj¹cych nawet milion par nukleotydów wokó³ uszkodzenia, tworz¹cych widoczne w mikroskopie foci. W domenach chromatyny, za-wieraj¹cych ufosforylowany histon H2AX, ob-serwuje siê nastêpnie nagromadzenie szeregu bia³ek zwi¹zanych mechanizmami rekombina-cyjnej naprawy pêkniêæ DNA: BRCA1, Rad51, Rad50, Mre11, Nbs1 (MODESTIi KAANAR2001). Mo¿na wiêc spekulowaæ, ¿e sygna³em rozpo-znawanym przez te bia³ka s¹ zmiany struktury nukleosomów inicjowane przez fosforylacjê hi-stonu H2AX. Co ciekawe, dane biochemiczne wskazuj¹, ¿e bia³ka które nagromadzaj¹ siê w domenach zawieraj¹cych ufosforylowany hi-ston H2AX (ATM, BRCA1, Rad51, Rad50, Mre11,

DDB pol DNA HAT DDB pol DNA CAF1 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. DDB DDB DDB pol DNA pol DNA pol DNA HAT DDB HAT DDB DDB pol DNA CAF1 pol DNA pol DNA CAF1 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Ryc. 1. Hipotetyczne zmiany struktury chromaty-ny zwi¹zane z napraw¹ przez wycinanie nukle-otydu (NER).

Kolejne etapy naprawy: 1) powstanie uszkodzenia (bia³y romb); 2) rozpoznanie uszkodzenia przez bia³ko DDB; 3) rozluŸnienie struktury w³ókna nukle-osomowego (np. dziêki acetylacji histonów); 4) utwo-rzenie kompleksu naprawczego, zmiana struktury (lub usuniêcie) nukleosomu zawieraj¹cego uszkodze-nie (bia³y owal); 5) usuniêcie fragmentu uszkodzonej nici DNA, reperacyjna synteza DNA; 6) rekonstytucja nukleosomu na nowosyntetyzowanym DNA (ciemny owal); 7) odtworzenie struktury w³ókna nukleosomo-wego.

Nbs1) tworz¹ wraz z innymi bia³kami napraw-czymi (BLM, MSH2, MSH6, MLH1) olbrzymie kompleksy bia³kowe, tak zwany BRCA1-associ-ated genome surveillance complex (BASC) (WANG i wspó³aut. 2000). Bia³kiem wi¹¿¹cym siê z dwuniciowymi pêkniêciami DNA jest hete-rodimer Ku. Stwierdzono, ¿e bia³ko Ku wi¹¿e siê z bia³kiem Sir3, które wraz z bia³kami Sir2 i Sir4 tworzy kompleksy oddzia³uj¹ce z histona-mi w gêsto upakowanej heterochromatynie (Sir2 jest deacetylaz¹ histonów). Rezerwuarem kompleksów Ku i Sir s¹ telomery i regiony sub-telomerowe chromosomów. Zaobserwowano, ¿e w wyniku powstania dwuniciowych pêkniêæ DNA dochodzi do przemieszczenia tych bia³ek z obszarów telomerowych w miejsce uszkodzeñ i formowanie heterochromatyny w regione za-wieraj¹cym uszkodzenie (HABER1999). Znacze-nie tego zjawiska dla procesów naprawy DNA nie jest jasne. Mo¿na jednak spekulowaæ, ¿e tworzenie struktury heterochromatyny w re-gionie pêkniêcia DNA jest czynnikiem uniemo-¿liwiaj¹cym transkrypcjê uszkodzonych genów. Odrêbnym zagadnieniem jest wi¹zanie z uszkodzonym DNA bia³ek nie bior¹cych udzia³u w naprawie: bia³ek chromatyny i czynników transkrypcyjnych. Powstanie uszkodzeñ DNA w obrêbie sekwencji rozpoznawanych przez czynniki transkrypcyjne zwykle blokuje wi¹za-nie tych czynników (TOMMASI i wspó³aut. 1996). Jednak obecnoœæ niektórych uszkodzeñ indukuje wi¹zanie czynników transkrypcyj-nych do przypadkowych sekwencji DNA. Przyk³adem mo¿e byæ czynnik transkrypcyjny Sp1, wi¹¿¹cy siê z nieswoistymi sekwencjami zawieraj¹cymi addukty indukowane przez ben-zo(a)pyren, lub czynniki transkrypcyjne zawie-raj¹ce domenê HMG, wi¹¿¹ce siê z

nieswoisty-mi sekwencjanieswoisty-mi zawieraj¹cynieswoisty-mi uszkodzenia in-dukowane przez cis-platynê (WID£AK 2000). Cis-platyna jest zwi¹zkiem genotoksycznym wy-korzystywanym w terapii przeciwnowotworo-wej, który indukuje w DNA miêdzy- i wewn¹trz-niciowe wi¹zania sieciuj¹ce. Zaobserwowano, ¿e dwie grupy bia³ek chromatyny: bia³ka HMG-1/2 i histon H1 wykazuj¹ bardzo silne po-winowactwo do tych fragmentów DNA, któ-rych struktura zosta³a zmieniona przez takie wi¹zania sieciuj¹ce. Stwierdzono równie¿, ¿e HMG-1 (i inne bia³ka z tej rodziny) mog¹ hamo-waæ naprawê DNA uszkodzonego przez cis-pla-tynê. Na podstawie takich obserwacji zapropo-nowana zosta³a hipoteza opisuj¹ca wp³yw bia³ek chromatyny na wra¿liwoœæ komórek na cis-platynê. Zgodnie z t¹ hipotez¹ (ang. repair-shielding model), bia³ka chromatyny mog¹ wspó³zawodniczyæ z bia³kami naprawczymi w wi¹zaniu uszkodzonego DNA. Po zwi¹zaniu bia³ka HMG uszkodzony fragment DNA nie by³by rozpoznawany przez bia³ka naprawcze, co powodowa³oby opóŸnienie lub uniemo¿li-wienie jego naprawy (ZAMBLEi LIPPARD1995). Poniewa¿ bia³ka HMG-1/2 maj¹ podwy¿szone powinowactwo równie¿ do innych typów uszkodzeñ DNA (fotouszkodzenia lub addukty indukowane przez policykliczne wêglowodory aromatyczne), zaproponowany model ma bar-dziej uniwersalny charakter i mo¿e byæ roz-ci¹gniêty na wiele typów uszkodzeñ DNA (WID£AK 2000). Hipotetycznie, zwi¹zanie z uszkodzonym DNA czynników transkrypcyj-nych, bia³ek HMG czy histonu H1 mog³oby mieæ przeciwny efekt. Bia³ka te wi¹¿¹c siê z uszkodze-niem mog³yby wymuszaæ przesuniêcie uszko-dzonego fragmentu do DNA ³¹cznikowego, przyczyniaj¹c siê do jego szybszej naprawy.

CHROMATIN STRUCTURE AND DNA REPAIR S u m m a r y

Chromatin structure modulates the rate of DNA damage formation and repair in different regions of eukaryotic genomes. Chromatin rearrangement takes place during repair to increase accessibility of damage to repair proteins. Activity of histone acetyl-transferases and chromatin remodeling complexes seems to be essential for nucleosome rearrangement during repair. Once repair is completed,

reconstitu-tion of nucleosomes is required to recover primary chromatin structure. Such chromatin assembly is cou-pled to repair DNA synthesis. DNA damages induce some modifications to chromatin structure (e.g. phosphorylation of a histone H2A variant in response to DNA double-strand breaks). Such chromatin modifi-cations may serve as signals recognized by DNA repair systems.

LITERATURA ALFSJ. D., KINGSTONR. E., 2000. What does : „chromatin

remodeling” mean. Trends Bioch. Sci. 25, 548–555.

BOHRV. A., 1991. Gene specific DNA repair. Carcinoge-nesis 12, 1983–1992.

BRANDM., MOGGSJ. G., OULAD-ABDELGHANIM., LEKEUNE

F., DILWORTHF. J., STEVENINJ., ALMOUZNIG., TORAL., 2001. UV-damaged DNA-binding protein in the

TFTC complex links DNA damage recognition to nucleosome acetylation. EMBO J. 20, 3187–3196.

BROWNC. E., LECHNERT., HOWEL., WORKMANJ. L., 2000.

The many HATs of transcription coactivators.

Trends Bioch. Sci. 25, 15–19.

CALIKOWSKIT. T., 2001. Przebudowa struktur

chroma-tynowych przez kompleksy wielobia³kowe. Post.

Biochem. 47, 129–137.

CITTERIOE., VANDENBOOMV., SCHNITZLERG., KAANARR.,

BONTE E., KINGSTON R. E., HOEIJMAKERS J. H. J., VERMEULEN W., 2000. ATP-dependent chromatin

remodeling by the Cockayne syndrome B DNA re-pair-transcription-coupling factor. Mol. Cell. Biol.

20, 7643–7653.

CHENH., TINIM., EVANSR. M., 2001. HATs on and bey-ond chromatin. Curr. Opin. Cell Biol. 13, 218–224. DATTAA., BAGCHIS., NAGA., SHIYANOVP., ADAMIG. R.,

YOONT., RAYCHAUDHURIP., 2001. The p48 subunit

of the damaged-DNA binding protein DDB asso-ciates with the CBP/p300 family of histone acetyl-transferases. Mutat. Res. 486, 89–97.

DENISSENKOM. F., PAOA., PFEIFERG. P., TANGM., 1998.

Slow repair of bulky DNA adducts along the non-transcribed strand of the human p53 gene may explain the strand bias of transversion mutations in cancers. Oncogene 16, 1241–1247.

FLAUS A., OWEN-HUGHES T., 2001. Mechanism for

ATP-dependent chromatin remodelling. Curr.

Opin. Gen. Devel. 11, 148–154.

FYODOROVD. V., KADONAGAJ. T., 2001. The many faces

of chromatin remodeling: SWItching beyond transcription. Cell 106, 523–525.

GAILLARD P. H. L., MARINI E. M. D., KAUFMAN P. D., STILLMAN B., MOUSTACCHI E., ALMOUZNI G., 1996.

Chromatin assembly coupled to DNA repair: a new role for chromatin assembly factor 1. Cell 86,

887–896.

GAILLARDP. H. L., MOGGSJ. G., ROCHED. M. J., QUIVYJ. P., BECKERP. B., ALMOUZNIG., 1997. Initiation and

bi-directional propagation of chromatin assembly from a target site for nucleotide excision repair.

EMBO J. 16, 6281–6289.

GAOS., DROUINR., HOLMQUISTG. P., 1994. DNA repair

rates mapped along the human PGK1 gene at nuc-leotide resolution. Science 263, 1438–1440.

HABER J. E., 1999. Sir-Ku-itous routes to make ends

meet. Cell 97, 829–832.

HARBOURJ. W., DEAND. C., 2000. Chromatin

remode-ling and Rb activity. Curr. Opin. Cell Biol. 12,

685–689.

HAYES J. J., HANSEN J. C., 2001. Nucleosomes and the

chromatin fiber. Curr. Opin. Gen. Devel. 11,

124–129.

KAMIUCHI S., SAIJO M., CITTERIO E., DE JAGER M., HOEIJMAKERSJ. H., TANAKAK., 2002. Translocation

of Cockayne syndrome group A protein to the nuc-lear matrix: possible relevance to transcrip-tion-coupled DNA repair. Proc. Natl. Acad. Sci. USA

99, 201–206.

KORNBERGR. D. 1999. Eukaryotic transcriptional

con-trol. Trends Bioch. Sci. 24, M46–M49.

MODESTIM., KAANARR., 2001. DNA repair: spot(light)s

on chromatin. Curr. Biol. 11, R229–R232.

MULLENDERSL. H. F., VENEMAJ., VANHOFFENA., MAYNEL. V., NATARAJANA. T. VAN ZEELAND A. A., 1990. The

role of the nuclear matrix in DNA repair. [W:] Mu-tation and the Environment, part A, Wiley-Liss,

Inc., 223–232.

PIETRZYKOWSKAI., KRWAWICZJ., 1999. Mechanizmy

na-prawy DNA u bakterii i cz³owieka. Kosmos 48,

315–328.

SMERDONM. J, 1991. DNA repair and the role of

chro-matin structure. Curr. Opin. Cell Biol. 3, 422–428.

TOMMASIS., SWIDERSKIP. M., TUY., KAPLANB. E., PFEIFER

G. P., 1996. Inhibition of transcription factor

bin-ding by ultraviolet-induced pyrimidine dimers.

Biochemistry 35, 15693–15703.

TORNALETTIS., PFEIFER G. P., 1995. UV light as a

foot-printing agent: modulation of UV-induced DNA damage by transcription factors bound at the pro-moters of three human genes. J. Mol. Biol. 249,

714–728.

TRZECIAKA., B£ASIAKJ., 1999. Naprawa DNA w

komór-kach ssaków. Post. Biol. Kom. 26, 707–729.

TUDEK B., 1999. Mechanizmy naprawy utlenionych

zasad DNA. Kosmos 48, 339–352.

TYLER J. K., ADAMS C. R., CHEN S. R., KOBAYASHI R., KAMAKAKAR. T., KADONAGAJ. T., 1999. The RCAF

complex mediates chromatin assembly during DNA replication and repair. Nature 402, 555–560.

URAK., ARAKIM., SAEKIH., MASUTANIC., ITOT., IWAIS.,

MIZUKOSHIT., KANEDAY., HANAOKAF., 2001.

ATP-de-pendent chromatin remodeling facilitates nucleo-tide excision repair of UV-induced DNA lesions in synthetic dinucleosomes. EMBO J. 20, 2004–2014.

WANGY., CORTEZD., YAZDIP., NEFFN., ELLEDGES.J., QIN

J., 2000. BASC, a super complex of

BRCA1-associ-ated proteins involved in the recognition and re-pair of abberant DNA structures. Genes Dev. 14,

927–939.

WID£AKP., 1994. Specyfika powstawania i naprawy

mutagennych uszkodzeñ materia³u genetyczne-go. Post. Bioch. 40, 194–199.

WID£AKP., 1997. Struktura nukleosomowa

chromaty-ny a naprawa DNA. Post. Biol. Kom. 24, 325–337.

WID£AKP., 2000. Bia³ka rozpoznaj¹ce i wi¹¿¹ce siê z

uszkodzonym DNA; udzia³ w mechanizmach na-prawy DNA i kancerogenezie. Post. Bioch. 46,

198–206.

WOODR. D., 1999. DNA damage recognition during

nucleotide excision repair in mammalian cells.

Biochimie 81, 39–44.

WOODCOCKC. L., DIMITROVS., 2001. Higher-order

struc-ture of chromatin and chromosomes. Curr. Opin.

Gen. Devel. 11, 130–135.

WUJ., GRUNSTEINM., 2000. 25 years after the

nucleoso-me model: chromatin modifications. Trends

Bioch. Sci. 25, 619–623.

ZAMBLED. B., LIPPARDS. J., 1995. Cisplatin and DNA

re-pair in cancer chemotherapy. Trends Bioch. Sci.

20, 435–439.

ZDZIENICKAM. Z., 1999. Mechanizm naprawy

podwój-nych pêkniêæ DNA (DSB) w komórkach ssaków: podstawy molekularne i konsekwencje biologicz-ne. Kosmos 48, 359–365.