K
osmos
Tom 46, Numer 1 (234)1997Strony 87-95
PROBLEMY NAUK BIOLOGICZNYCH___________ Polskie Towarzystwo Przyrodników im. Kopernika
Panu Profesorowi Lechowi Wojtczakowi, Recenzentowi mojej rozprawy doktorskiej i habilitacyjnej, artykuł ten poświęcam wraz z podzięko waniem za zawsze okazywaną życzliwość, zainteresowanie i pomoc
Li l l a Hr y n i e w i e c k a
Zakład Bioenergetyki, Instytut Biologii Molekularnej i Biotechnologii, Uniwersytet im. A. Mickiewicza
Fredry 10, 61-701 Poznań
ALTERNATYWNA OKSYDAZA NIEWRAŻLIWA NA CYJANEK
WPROWADZENIE
Podstawową funkcją mitochondriów jest przekształcanie energii potencjału oksydoredu- kcyjnego w dwie wymienne formy energii swobod nej, wykorzystywane przez komórkę, to jest siłę protonomotoiyczną (Ap) i potencjał fosforylacyjny ATP (AGp). Dlatego w skład wewnętrznej błony mitochondrialnej wszystkich organizmów wcho dzą kompleksy białkowe przenoszące elektrony z substratów oddechowych do tlenu, a zarazem na koszt energii tego transportu wypompowujące protony z matriks mitochondrialnej. Wytwarzana w następstwie przemieszczania protonów Ap na pędza fosfoiylację oksydacyjną, czyli syntezę ATP, cząsteczki stanowiącej główne źródło energii swo bodnej wykorzystywane przez komórki. Ponieważ Ap sprzęga transport elektronów w łańcuchu od dechowym z syntezą ATP, brak możliwości jej wytworzenia prowadzi do rozproszenia energii transportu elektronów, a więc przekształcenia tej energii w ciepło. Mitochondria brunatnej tkanki tłuszczowej ssaków wykorzystują to zjawisko w procesie termogenezy, w którym hormonalnie re gulowane białko — termogenina, uniemożliwia wytwarzanie Ap. Natomiast w mitochondriach roślin wyższych (Do u c e i Ne u b u r g e r 1989, Mo
o r e i Si e d o w 1991, Ry c h t e r 1996) oraz grzybów
i pierwotniaków (Ll o y d 1974, He n r yi Ny n s 1975,
Dr a b i k o w s k a 1978, Hr y n i e w i e c k a 1993) istnieje
nie związana z translokacją protonów droga transportu elektronów, tak zwana droga alterna tywna niewrażliwa na cyjanek, której końcowym fragmentem jest oksydaza alternatywna (w odnie sieniu do oksydazy cytochromowej).
Oddychanie odporne na cyjanki wykryto u roślin ju ż w 1929 roku (He n r y i Ny n s 1975),
jednak długo nie wiązano tego zjawiska z oddy chaniem mitochondrialnym. Dopiero pod ko niec lat sześćdziesiątych rozpoczęto intensywne badania nad drogą alternatywną w mitochon driach, przy czym szczególny nacisk położono na poznanie czynników kontrolujących jej udział w oddychaniu, co mogłoby pomóc w znalezieniu odpowiedzi na pytanie — jaką rolę pełni w metabolizmie komórki transport elektro nów marnotrawiący energię? (Ry c h t e r 1982,
La n c e i współaut. 1985).
Zarówno u roślin wyższych (La n c e i współ
aut. 1985, Ry c h t e r 1982), jak i u mikroorgani
zmów (Ll o y d 1974, Dr a b i k o w s k a 1978) aktyw
ność drogi alternatywnej zależy od gatunku, cyklu rozwojowego i warunków środowiska. W przypadku roślin duże znaczenie ma typ meta boliczny tkanki; w niektórych tkankach alter natywna oksydaza jest enzymem konstytutyw nym, winnych indukowanym ( McIn t o s h 1994).
Aktywację i indukcję drogi alternatywnej obser wowano w ekstremalnie różnych warunkach, na przykład zranienie tkanki, obecność etylenu lub kwasu salicylowego, niska temperatura, nadmiar węglowodanów w komórce, określony etap cyklu rozwojowego (Ry c h t e r 1982, McIn
t o s h 1994, Wa g n e r 1995). To sugeruje, że dro
ga alternatywna pełni rozmaite funkcje w róż nych sytuacjach, co znacznie utrudnia określe nie jej uniwersalnej roli fizjologicznej. Wiadomo, że u Araceae droga alternatywna generuje cie
pło, jednak w mitochondriach mikroorgani zmów i większości gatunków roślinnych jej działanie nie jest związane z termogenezą (Lan c e i współaut. 1985).
Próby izolowania alternatywnej oksydazy okazały się mało efektywne, przede wszystkim ze względu na jej błonową lokalizację, stąd po jawiły się hipotezy negujące istnienie enzymu
(Lance i współaut. 1985). Z powodu trudności z ustaleniem, co jest produktem redukcji tlenu
H2O czy H2O2 lub O2 sugerowano, że aktyw
ność drogi alternatywnej jest efektem nieen- zymatycznej reakcji zachodzącej pomiędzy kwasami tłuszczowymi a nadtlenkowymi rodni kami kwasów tłuszczowych. Sugestię, że droga alternatywna jest oksydazą chinolową przeno szącą elektrony bezpośrednio z ubichinonu do tlenu cząsteczkowego potwierdzono w ostatnich latach dzięki użyciu technik biologii molekular nej (M c In to s h 1994).
CHARAKTERYSTYKA OKSYDAZY ALTERNATYWNEJ NIEWRAŻLIWEJ NA CYJANKI
Alternatywna oksydaza funkcjonuje we we wnętrznej błonie mitochondrialnej obok oksy dazy cytochromowej (rys. 1). Katalizuje ona przeniesienie elektronów z puli ubichinonu bez pośrednio na tlen, stąd niewrażliwa jest na inhibitory drogi cytochromowej — antymycynę A i cyjanek. Oksydaza alternatywna ma mniej sze powinowactwo do tlenu niż oksydaza cyto- chromowa, ale podobnie jak ta ostatnia redu kuje tlen do wody (M o o r e i S ie d o w 1991, Sie- d o w i Umbach 1995). Inhibitorami transportu elektronów alternatywnej oksydazy są kwasy hydroksamowe, (np. kwas salicylohydroksamo- wy — SHAM i kwas benzohydroksamowy — BHAM), galusan n-propylu i disulfiram (M o o r e
i S ie d o w 1991). Ponieważ alternatywna oksyda za nie generuje Ap, energia utleniania substra tów oddających elektrony do ubichinonu z po minięciem kompleksu I a następnie do alterna tywnej oksydazy zamienia się w ciepło. Nato miast utlenianie substratów, w którym bierze udział kompleks I jest związane z syntezą 1 cząsteczki ATP (M o o r e i S ie d o w 1991).
Próby uzyskania homogennego preparatu alternatywnej oksydazy dotychczas nie powiod ły się ze względu na trudności związane z wyod
rębnieniem enzymu z błony i znalezieniem od powiedniego donora elektronów spośród chino nów do pomiarów kinetycznych in vitro (M o o r e
i S ie d o w 1991, R y c h t e r 1996). Metodami bio chemicznymi udało się otrzymać częściowo oczyszczone białko tylko z tkanek termogen- nych Araceae (E lth o n i M c In to s h 1987, B e r t - h o ld i S ie d o w 1993, M o o r e i S ie d o w 1991), niemniej pozwoliło to na uzyskanie dla oksyda zy z Sauromatum guttatum przeciwciał mono- i poliklonalnych specyficznych wobec trzech po- lipeptydów o masie 37, 36 i 35 kDa (E lt h o n i współaut. 1989a, E lt h o n i M c In to s h 1987). Przeciwciała te reagują krzyżowo ze wszystkimi badanymi roślinami wykazującymi aktywność oksydazy alternatywnej (M c In to s h 1994) a tak że z Neurospora crassa (Lam b ow itz i współaut.
1989), Hansenuia anomala (S a k a jo i współaut. 1991), formą T rypanosoma bruceipasożytującą we krwi (C hau dhu ri i współaut. 1995) i amebą Acanthamoeba castellanii (J a rm u szk iew icz i współaut. 1996). Identyfikacja alternatywnej oksydazy za pomocą przeciwciał przerwała dys kusję — czy oddychanie odporne na cyjanki jest rzeczywiście związane z integralnym białkiem łańcucha oddechowego. Dzięki otrzymaniu
R ys.l. Schemat łańcucha od dechowego w mitochondriach roślin wyższych.
I-IV — kompleksy głównego łań cucha oddechow ego (odpow ie d n io: d e h y d r o g e n a z a N AD H , dehydrogenaza bursztynanowa, kompleks bci i oksydaza cyto- chromowa), AOX — oksydaza al ternatywna, NR — dehydrogenaza matriksowego NADH niewrażliwa na rotenon, Dh NAD(P)H dehydro g e n a zy c y to p la z- m atyczn ego NADH i NADPH, cyt c — cyto- chrom c, UQ/UQH2 — pula utle n io n e g o i z re d u k o w a n e g o u b ic h in o n u . In h ib ito ry AO X: SHAM —- kwas salicylohydroksa- mowy, GP — galusan n-propylu i DS — disulfiram.
Alternatywna oksydaza niewrażliwa na cyjanek 89
przeciwciał wyizolowano i ustalono sekwencję pojedynczczego klonu cDNA dla oksydazy alter natywnej z S. guttatum (R h oad s i M c In to s h
1991), H. anomaia (S a k a jo i współaut. 1993), Arobidopsis thaliana (Kum ar i S o l l 1992) i ty toniu (V a n le r b e r g h e i M c In to s h 1994). Poja wienie się trzech prążków na żelu w wyniku immunoelektroforezy wymagało wyjaśnienia, czy otrzymane polipeptydy są produktem trzech genów jądrowych, czy tylko jednego genu, co sugerowano w przypadku mutanta N. crassa
(Lam bow itz i współaut. 1989). Analiza genomu
S. guttatum (Kum ar i S o l l 1992) i A. thaliana
(R h oad s i M c In to s h 1993) przeprowadzona me todą Southern błot wykazała, że alternatywna oksydaza jest produktem jednego genu jądro wego aox-l. Ostatnio analiza DNA soi przepro wadzona metodą łańcuchowej reakcji polimery zacji (PCR) wykazała istnienie trzech genów (aox-l, aox-2, aox-3) kodujących alternatywną oksydazę (W h e la n i współaut. 1996). To mogło by wyjaśnić występowanie trzech form alterna tywnej oksydazy o różnym ciężarze cząsteczko wym w mitochondriach S. guttatum (E lt h o n i współaut. 1989), dwóch w mitochondriach nad ziemnych części soi i jednej w mitochondriach korzeni (K ea rn s i współaut. 1992). Różnice te tłumaczono dojrzewaniem białka prekursowego lub jego posttranslacyjnymi modyfikacjami
(M o o r e i S ie d o w 1991). Jednak badania nad importem białka do mitochondriów izolowa nych z różnych tkanek soi nie potwierdziły tych sugestii (W h e la n i współaut. 1995).
Na podstawie sekwencji am inokwasów określonej przez gen aox-l, uzyskanej z kilku gatunków roślin i drożdży H. anomaia, zapro
ponowano strukturalny model alternatywnej oksydazy (M c In to s h 1994, M o o r e i współaut.
1995). Dojrzałe białko (rys. 2) zawiera dwie hydrofobowe helisy transbłonowe i jedną helisę powierzchniową zlokalizowaną po stronie prze strzeni międzybłonowej. Końce N i C łańcucha polipeptydowego znajdują się po stronie ma triks mitochondrialnej. W h y drofilowej domenie przy końcu C mieści się binuklearne centrum żelazowe, które prawdopodobnie jest miejscem aktywnym enzymu odpowiedzialnym za redu kcję tlenu. Utlenianie ubichinolu, zredukowa nego substratu alternatywnej oksydazy, mogło by mieć miejsce w kieszonce utworzonej przez położone najbliżej matriks obszary obu helis transbłonowych i hydrofilową domenę przy końcu C. Za taką koncepcją przemawia obe cność konserwatywnych sekwencji aminokwa sów w tych fragmentach łańcucha polipeptydo wego oraz położenie miejsca utleniania ubichi nolu obok centrum żelazowego.
Alternatywna oksydaza roślin jest dimerem (rys. 2) występującym w wewnętrznej błonie
mitochondrialnej w dwóch formach: utlenionej — nieaktywnej i zredukowanej — aktywnej (M o o r e i współaut. 1995). W formie utlenionej dwa łańcuchy polipeptydowe są połączone mo stkiem disulfidowym, natomiast w formie zre dukowanej grupy sulfhydrylowe nie tworzą wią zania, zatem dimer jest utrzymywany przez od działywania niekowalencyjne (M o o r e i współ aut. 1995). Natomiast w mitochondriach A. ca- stellanii dominują pojedyncze polipeptydy w formie zredukowanej, a forma utleniona enzy mu (dimer) występuje w niewielkich ilościach
(Jarm u szkiew icz, wyniki nie publikowane).
Rys. 2. Proponowany model al ternatywnej oksydazy.
Zaznaczono reszty cysteinowe -SH przy końcu -N polipeptydu odpowie dzialne za odwracalne tworzenie wiązań disulfidowych w dimerze i reszty cysteinowe położone blisko błony, p ra w d o p o d o b n ie będące miejscem aktywacji enzymu przez a-ketokw asy. PA — hipotetyczne miejsce działania pirogronianu (wg
REGULACJA PRZEPŁYWU ELEKTRONÓW DO OKSYDAZY CYTOCHROMOWEJ I OKSYDAZY ALTERNATYWNEJ
W łańcuchu oddechowym roślin wyższych z alternatywną oksydazą współpracują komple ksy enzymatyczne (nieobecne w mitochon- driach ssaków) (rys. 1) nie związane z translo- kacją protonów. S ą to: dehydrogenaza zewnę trznego NAD(P)H niewrażliwa na rotenon, zlo kalizowana po zewnętrznej stronie wewnętrznej błony mitochondrialnej i utleniająca bezpośred nio cytoplazmatyczny NAD(P)H oraz dehydroge naza wewnętrznego NADH niewrażliwa na rote non, umiejscowiona w wewnętrznej błonie mi tochondrialnej od strony matriks i utleniająca matriksowy NADH (Mo o r e i SlEDOW 1991, Ry-
c h t e r 1996). Tak rozgałęziony system przenoś
ników elektronów pozwala na zróżnicowanie wydajności energetycznej mitochondriów. Utle nianie matriksowego NADH przebiega więc dro gą fosforylującą (kompleks I - 4 oksydaza cyto- chromowa) z wytworzeniem 3 cząsteczek ATP lub drogą niefosforylującą (dehydrogenaza NADH niewrażliwa na rotenon —> oksydaza al ternatywna). Utlenianie bursztynianu i egzo gennego NADH jest związane z syntezą 2 czą steczek ATP, gdy końcowym akceptorem ele ktronów jest oksydaza cytochromowa. W obe cności cyjanku elektrony z bursztynianu swo bodnie przepływają do alternatywnej oksydazy w sposób nie sprzężony z syntezą ATP, nato miast elektrony z egzogennego NADH mają do niej utrudniony dostęp (Mo o r e i Sie d o w 1991).
Wyjątek stanowią mitochondria termogennych tkanek roślin, w których podczas kwitnienia egzogenny NADH jest utleniany równie aktyw nie jak substraty cyklu Krebsa (Mo o r ei Si e d o w
1991).
Systemy regulujące oddychanie w komór kach roślinnych odzwierciedlają konieczność szybkiego przystosowania się mitochondriów do zmiennych warunków metabolicznych oraz ich współdziałania z innymi organellami prze kształcającymi energię, takimi jak chloroplasty i peroksysomy. Dlatego poza typowymi czynni
kami regulującymi aktywność łańcucha odde chowego i fosforylacji oksydacyjnej duże zna czenie ma stopień zaangażowania niefosforylu- jącej drogi alternatywnej w całkowite oddycha
nie. Do niedawna uważano, że o skierowaniu elektronów na drogę alternatywną decyduje wy łącznie stopień redukcji puli ubichinonu a więc tego fragmentu łańcucha oddechowego, który łączy wszystkie drogi transportu elektronów z dehydrogenaz (redukcja UQ) do oksydaz (utle nianie UQ). Dominująca przez prawie dwadzie ścia lat hipoteza Ba h r a i Bo n n e r a (1973) zakła
da, że droga alternatywna może działać dopiero po wysyceniu elektronami drogi cytochromowej lub po jej zahamowaniu, na przykład przez cyjanek, a więc wtedy, gdy ubichinon zostanie całkowicie zredukowany. Przekonanie o słusz ności modelu Bahra i Bonnera utrwalił jeszcze La m b e r s (1982), który dostosował ten model do
warunków fizjologicznych i zaproponował hipo tezę przelewu (overflow), według której droga alternatywna mogłaby być drogą odpływową odbierającą nadmiar elektronów pochodzących z glikolizy w sytuacji, gdy ilość wytworzonych cukrów przekracza zapotrzebowanie komórki, a pojemność drogi cytochromowej jest ograniczo na przez stosunek NAD+ do NADH i potencjał fosforylacyjny. W miarę postępu badań okazało się, że założenia obu hipotez są tylko częściowo słuszne, a aktywność alternatywnej oksydazy zależy od tak różnych czynników jak: rodzaj utlenianego substratu (Mo o r e i Si e d o w 1991),
stan redoks zarówno puli ubichinonu, jak i alternatywnej oksydazy (Si e d o wi Mo o r e 1993),
kowalencyjne modyfikacje form alternatywnej oksydazy, allosteryczne modulatory (Um b a c h i
współaut. 1994, Mi l l a r i współaut. 1996) oraz
cały szereg czynników zewnętrznych i wewnę trznych indukujących ekspresję genu alterna tywnej oksydazy w odpowiedzi na osłabienie drogi cytochromowej (McIn t o s h 1994, Wa g n e r
i Kr a b 1995).
REGULACJA TRANSPORTU ELEKTRONÓW PRZEZ STAN REDUKCJI PULI UBICHINONU
W mitochondriach większości gatunków ro ślin elektrony z egzogennego NADH, w przeci wieństwie do elektronów z substratów cyklu Krebsa, wykazują o wiele silniejsze powinowac two do oksydazy cytochromowej niż do oksyda zy alternatywnej (Mo l l e r i Lin 1986, Mo o r e i
Si e d o w 1991). Często obserwowano, że oksyda
za alternatywna nie odbiera elektronów pocho
dzących z egzogennego NADH nawet po zablo kowaniu oksydazy cytochromowej przez cyja nek. Natomiast w mitochondriach tkanek ter mogennych alternatywna oksydaza utlenia eg zogenny NADH również aktywnie jak inne sub straty. Z kolei w mitochondriach ameby obser wowano sytuację pośrednią; w nieobecności cy janku elektrony z egzogennego NADH są
kiero-Alternatywna oksydaza niewrażliwa na cyjanek 91 wane wyłącznie na drogę cytochromową, nato
miast gdy jest zahamowana droga cytochromo- wa mają równie swobodny dostęp do alterna tywnej oksydazy jak elektrony z substratów cyklu Krebsa (H ry n iew ieck a 1993).
Zależny od rodzaju substratów, nierówno mierny przepływ elektronów przez obie drogi oddechowe początkowo tłumaczono istnieniem niehomogennej puli ubichinonu (Day i współ aut. 1991). Idea kompartmentacji pul ubichino nu (czyli różnych pul) związanych funkcjonal nie z określonymi dehydrogenazami i oksydaza mi sugerowała odmienne zachowanie się ubi chinonu w mitochondriach posiadających al ternatywną oksydazę, niż zakłada model K ró - g e r a i K lin g e n b e r g a (1973) opracowany dla mitochondriów zwierzęcych. Według tego mode lu ruchoma homogenna pula ubichinonu wy kazuje jednakową dostępność dla elektronów ze wszystkich donorów, a kinetyka zależności sta nu redoks puli ubichinonu od szybkości oddy chania jest liniowa. Tymczasem w mitochon driach roślin zależność pomiędzy aktywnością drogi alternatywnej a stanem redoks ubichino nu jest nieliniowa, a liniową kinetykę wykazuje droga cytochromową i wyjątkowo droga alter natywna u roślin termogennych (Day i współ aut. 1991, D r y i współaut. 1989).
Mimo że w ostatnich latach zaproponowano szereg modeli kinetycznych, które mogą w dużej mierze przyczynić się do wyjaśnienia mechani zmu regulacji przepływu elektronów przez roz gałęziony łańcuch oddechowy roślin (K ra b
1995), nadal nie można opracować jednego uni wersalnego modelu. Skoncentrowano się na puli ubichinonu, ale istnieją też inne czynniki kontrolujące oddychanie, takie jak stan energe
tyczny wewnętrznej błony mitochondrialnej (określony wartością Ap), stężenie tlenu czy do stępność substratów. Bardzo użyteczny okazał się model S ie d o w a i M o o r a (1993) oparty na założeniu, że alternatywna oksydaza jest redu kowana przez ubichinol w reakcji dwustopnio wego przeniesienia czterech elektronów. Szyb kość przepływu elektronów przez drogę alterna tywną zależy więc nie tylko od stopnia redukcji puli ubichinonu, ale także od stałej równowagi reakcji odwracalnego transportu elektronów, zachodzącej pomiędzy ubichinolem a alterna tywną oksydazą. W konsekwencji poziom redu kcji ubichinonu wymagany do skierowania ele ktronów na drogę alternatywną nie musi być stały. Progowa wartość współczynnika Qr/Qt, poniżej której nie obserwuje się aktywności dro gi alternatywnej może różnić się w zależności od warunków metabolicznych. Tak więc wysycenie elektronami drogi cy to chromowej nie jest ko nieczne do uaktywnienia drogi alternatywnej
(D r y i współaut. 1989). Dzięki możliwości moni torowania stanu redoks puli ubichinonu meto dą woltametryczną lub ekstrakcji ubichinonu
(van den B e r g e n i współaut. 1994) można obe cnie bezpośrednio sprawdzać proponowane modele kinetyczne. Pomimo komplikacji wyni kających z odmiennej kinetyki obu dróg odde chowych funkcjonujących w jednym łańcuchu oraz z charakteru badanego materiału ostate cznie zaproponowano, że w mitochondriach ro ślin istnieje homogenna, ruchoma pula ubichi nonu zgodnie z modelem Krógera i Klingenber ga, który jednak w przypadku rozgałęzionego łańcucha oddechowego należy zmodyfikować, a hipoteza Bahra i Bonnera wymaga ponownego krytycznego rozpatrzenia (K ra b 1995).
REGULACJA AKTYWNOŚCI ALTERNATYWNEJ OKSYDAZY PRZEZ MODULATORY ALLOSTERYCZNE
Z charakterystycznym dla roślin metabo lizmem łączy się złożony mechanizm utleniania jabłczanu, w którym biorą udział dwa matrikso- we enzymy generujące NADH: dehydrogenaza jabłczanowa (MDH) i enzym jabłczanowy dekar- boksylujący, współpracujący z NAD+ (ME) (Do
u c e i N e u b u r g e r 1989). Przyjęto, że współdzia łanie obu tych dehydrogenaz pozwala na całko wite utlenianie wprowadzonego anaplerotycz- nie jabłczanu, jednakże ostatnio sugeruje się, że obecność ME w matriks mitochondrialnej może być związana z regulacyjną rolą pirogro- nianu, produktu tego enzymu. Stwierdzono, że w obecności niektórych kwasów organicznych, a szczególnie pirogronianu, droga alternatywna może funkcjonować przy niskim stosunku UQH2 do UQ (M i l l a r i współaut. 1996). Po
wykluczeniu jakiegokolwiek związku między stymulacyjnym działaniem pirogronianu a me tabolizmem kwasów organicznych oraz stwier dzeniu, że pirogronian nie podwyższa stosunku Qr do Qt przyjęto, że jest on aktywatorem allo- sterycznym znoszącym różnice w utlenianiu substratów przez drogę alternatywną, co może mieć duże znaczenie irt vivo ( M i l l a r i współaut. 1993). W oparciu o model S ie d o w a i M o o r e a
(1993) zaproponowano, że pirogronian obniża Km reakcji zachodzącej pomiędzy alternatywną oksydazą a pulą ubichinonu (Day i współaut.
1994, S ie d o w i Umbach 1995). Przypuszczalnie alternatywną oksydazę aktywuje zarówno piro gronian dostarczony z cytoplazmy przez glikoli zę, jak i ten wytworzony wewnątrz mitochon driów podczas utleniania jabłczanu i
burszty-nianu (Mi l l a r i współaut. 1993). Tak więc zja
wisko stymulacji aktywności alternatywnej oksy dazy przez pirogronian teraz układa się w logiczną całość z kontrowersyjną hipotezą Ru s t i n a i
współautorów (1980), według której niefosfoiy- lująca droga utleniania jabłczanu (dehydroge naza wewnętrznego NADH niewrażliwa na rote- non —> alternatywna oksydaza) jest związana preferencyjnie z ME, a droga fosforylująca (kompleks I -> oksydaza cytochromowa) z MDH.
W mitochondriach ameby A. castellanii, mi mo obecności w łańcuchu oddechowym dehy drogenazy wewnętrznego NADH niewrażliwej na rotenon, a w matriks mitochondrialnej ME oraz jego produktu — pirogronianu, nie obser wowano ścisłego powiązania pomiędzy ME a drogą alternatywną (Hr y n i e w i e c k a 1993). Nie
stwierdzono także stymulacji drogi alternatyw nej przez jabłczan i bursztynian (Ja r m u s z k i e
-w i c z i Hr y n i e w i e c k a 1994). Obecnie gdy wiado
mo, że w mitochondriach roślin pirogronian stymuluje aktywność alternatywnej oksydazy można już wytłumaczyć tę różnicę. W przypad ku ameby rolę stymulatorów pełnią 5-monofo- sforany nukleozydów puiynowych, z których najbardziej efektywny jest GMP (Hr y n i e w i e c k a
1993). Działanie GMP prawdopodobnie polega na zwiększeniu powinowactwa alternatywnej oksydazy do zredukowanego ubichinonu, podo bnie jak w przypadku pirogronianu w mito chondriach roślin (Ja r m u s z k i e w i c z i współaut.
1996). Wyniki pomiarów redukcji puli ubichi nonu w mitochondriach ameby potwierdziły wcześniejszą sugestię, że mononukleotydy pu- rynowe działają w mitochondriach mikroorga nizmów jako modulatory allosteryczne oksyda zy alternatywnej ( Hr y n i e w i e c k a 1993).
REGULACJA AKTYWNOŚCI ALTERNATYWNEJ OKSYDAZY PRZEZ STAN REDUKCJI/UTLENIANIA JEJ DIMERU
W wewnętrznej błonie mitochondrialnej ro ślin dimery alternatywnej oksydazy stanowią mieszaną populację nieaktywnych form utle nionych i aktywnych form zredukowanych. Aktywność alternatywnej oksydazy mogłaby być regulowana dzięki odwracalność tworzone go pomiędzy monomerami wiązania disulfido- wego (rys. 2). Tak więc przepływ elektronów przez drogę alternatywną byłby zależny nie tyl ko od stopnia redukcji elektronami puli ubichi nonu i alternatywnej oksydazy, ale także od stanu równowagi pary oksydoredukcyjnej: gru pa sulfhydrylowa — wiązanie disulfidowe (Um-
b a c h i współaut. 1994). Ponieważ pirogronian
nie ma wpływu na tworzenie lub zrywanie wią zań disulfidowych proponuje się, aby aktywato rami alternatywnej oksydazy działającymi bez
pośrednio na to wiązanie mogłyby być tioredo- ksyna (Um b a c h i Si e d o w 1993) albo NADPH
(Va n l e r b e r g h e i współaut. 1995) zlokalizowane
w matriks, a pirogronian współdziałałby jako regulator allosteryczny tylko z aktywną formą enzymu (Si e d o w i Um b a c h 1995).
Niewiele wiadomo o wpływie kowalencyj nych modyfikacji oksydazy alternatywnej na jej aktywność w mitochondriach mikroorgani zmów. U A. castellanii występowanie enzymu w postaci zredukowanych monomerów i mała wrażliwość nielicznych utlenionych dimerów na czynniki redukujące mogą świadczyć o braku opisanego powyżej m echanizm u regulacji aktywności alternatywnej oksydazy (Ja r m u s z
k i e w i c z, wyniki nie publikowane).
REGULACJA TRANSPORTU ELEKTRONÓW PRZEZ POZIOM EKSPRESJI GENU(ÓW) ALTERNATYWNEJ OKSYDAZY
Udział w oddychaniu obu dróg, alternatyw nej i cytochromowej, może być regulowany tak że przez zmiany w ekspresji ich genów skoordy nowane z wymaganiami metabolicznymi ko mórki (McIn t o s h 1994, Va n l e r b e r g h e I McIn
t o s h 1996). W tkankach termogennych pod
czas nasilania się procesu termogenezy (Le a c h
i współaut. 1996) a w zawiesinie komórkowej tytoniu (Va n l e r b e r g h e i współaut. 1994) i Pe
tunia hybrida (Wa g n e r i współaut. 1992) na
skutek obecności antymycyny A w hodowli ob serwowano zwiększoną ekspresję genu aox-l, związaną z obniżeniem sprawności drogi cyto
chromowej. Porównanie zużycia tlenu w zawie sinach komórek dzikiego szczepu tytoniu oraz komórek tytoniu transgenicznego zawierają cych zwielokrotniony gen aox-l i gen bezsen sowny wykazało, że alternatywna oksydaza umożliwia oddychanie w przypadku obniżenia sprawności drogi cytochromowej, wynikającego albo z upośledzenia któregoś z przenośników elektronów albo z ograniczenia, jakie narzuca kontrola ze strony potencjału fosfory lacyjnego (Va n l e r b e r g h e i współaut. 1994). Natomiast
dodanie kwasu salicylowego do hodowli komó rek tytoniu bardzo silnie zwiększa udział drogi
Alternatywna oksydaza niewrażliwa na cyjanek 93 alternatywnej w oddychaniu (oraz ekspresję ge
nu CLOX-1) przy niezmienionej pojemności drogi cytochromowej. W większości przypadków in dukcja lub aktywacja alternatywnej oksydazy jest związana jednak z upośledzeniem aktywno
ści drogi cytochromowej. Indukcję ekspresji ge nu aox-l u roślin wywołują różnego rodzaju stresy, takie jak niskie temperatury, zranienie tkanki, brak wody czy nieodpowiednie stężenie soli ( M c i n t o s h 1994, W a g n e r 1995). Wobec sytuacji, w której tak różne przyczyny wywołują jednakowy skutek, powstał problem — skąd i jakie sygnały informujące o ograniczeniu drogi cytochromowej docierają do jądra komórkowe go? Ostatnio zaproponowano, że taką rolę mogą pełnić rodnik ponadtlenkowy i nadtlenek wodo ru ( W a g n e r 1995).
U wielu roślin stwierdzono, że H2O2 bierze udział w reakcjach odpornościowych skierowa nych przeciwko patogennym mikroorganizmom (Ch e n i współaut. 1993). Stężenie H2O2 jest
regulowane przez kwas salicylowy, który wiążąc się z katalazą hamuje jej aktywność. Kwas sa licylowy jest najprawdopodobniej naturalną
cząsteczką sygnałową przekazującą informację dla genów związanych z patogenezą, kodują cych układ odporności nabytej. H2O2 mogłaby
funkcjonować jako sygnał drugiego rzędu dla genów aktywowanych przez różne rodzaje stre su. Połączenie powyższych danych z obserwa cją, że kwas salicylowy i H2O2 indukują ekspre
sję genu aox-l w roślinach dało w wyniku bar dzo interesującą hipotezę, uwzględniającą za równo aktywację, jak i indukcję alternatywnej oksydazy wywołaną wpływem czynników środo wiskowych i wewnątrzkomórkowych upośle dzających drogę cytochromową (rys. 3) (Wa g n e r
1995). Jeżeli stężenie substratów jest zbyt duże dla ograniczonych możliwości osłabionej drogi cytochromowej, gromadzą się kwasy organicz ne, a wzrastająca dzięki nim aktywność drogi alternatywnej zapobiega powstawaniu szkodli wych wolnych rodników. W razie niewystarcza jącej aktywności drogi alternatywnej następuje
akumulacja H2O2 i O2 . Następnie cząsteczki te
przechodzą do jądra i indukują ekspresję genu (lub genów) alternatywnej oksydazy.
Rys. 3. Schemat przedsta wiający hipotetyczne mecha nizmy aktywacji i in- dukcji alternatywnej oksydazy.
AOX — oksydaza alternatywna, cyt — droga cytochromową.
UWAGI KOŃCOWE
Wykorzystanie nowych technik do badań nad strukturą oksydazy alternatywnej w mito- chondriach roślin wyższych, grzybów i pierwot niaków oraz regulacją jej udziału w oddycha niu, dostarczyło wielu cennych informacji. Mi mo to jednoznaczne sprecyzowanie fizjologicz nej roli drogi alternatywnej nadal jest trudne ze względu na jej działanie w bardzo odmiennych warunkach. Proponuje się więc podejście do tego problemu z punktu widzenia szeroko poję
tej regulacyjnej roli alternatywnej oksydazy, a nie tylko jej specyficznych reakcji na określone sytuacje ( Mc i n t o s h 1994). Podsum ow anie
wszystkich danych uzyskanych dotychczas z różnych źródeł prowadzi do wniosku, że zarów no u roślin, jak i u mikroorganizmów droga alternatywna zwiększa szansę na przetrwanie w warunkach niekorzystnych dla komórki. Obecnie opracowuje się takie metody badaw cze, które pozwoliłyby na określenie udziału
drogi alternatywnej w oddychaniu in vivo i po znanie rzeczywistej wydajności energetycznej oddychania roślin (M o o r e i współaut. 1994,
K ra b 1996, R y c h t e r 1996). Jednakże prace na materiale roślinnym utrudnia zależność wydaj ności fosforylacji oksydacyjnej, a więc i aktywno
ści oksydazy alternatywnej, od fotosyntezy i fotooddychania. Dlatego przydatne w rozwiązy waniu wspominanych problemów mogą być heterotroficzne pierwotniaki, które reprezentu ją bardzo prosty układ doświadczalny, jak na
przykład A. castellanii (H ry n iew ieck a 1993).
CYANIDE-INSENSITIVE ALTERNATIVE OXIDASE
Summary The alternative oxidase found in the mitochondria of higher plants and some a microorganisms, is an integral inner membrane protein which branches from the main respiratory chain at the level o f the ubiquinone pool. Elec tron flow through this oxidase is not coupled to ATP syn thesis, and the enzyme catalyses the reduction of oxygen to water. In recent years much attention was focused upon the regulation and nature o f the alternative oxidase. Monoclo nal antibodies raised against the alternative oxidase from S. guttatum have been shown to cross-react with the alter native oxidase o f a wide variety o f plant species and a few microorganisms. Alternative oxidase is encoded by nuclear gene(s) and consists, depending on the species, of 1-3 proteins o f 32-39 kDa. In plant mitochondria it seems to exist as a dimer which is active in the reduced,
noncoval-ently linked form and inactive in the oxidised, covalnoncoval-ently linked form. Extensive kinetic analyses o f regulation o f the alternative pathway activity suggest that this regulation is determined by the redox poise of the ubiquinone pool, the amount o f oxidase protein, the redox status o f the alterna tive oxidase intermolecular sulfhydiyl/disulfide system and the activity o f the quinone-reducing enzymes. The mechan isms o f interplay between all o f these various regulatory systems are still not fully understood. In plants and micro organisms the synthesis o f alternative oxidase can be in duced by a number o f treatments. The alternative pathway respiration can be induced in many ways from lowered temperatures to chemical signals, a common factor being here the inhibition o f the cytochrome pathway.
LITERATURA Ba h rJ. T., Bo n e rW. D., 1973. Cyanide-insensitive respir
ation. II. Control o f the alternative pathway. J. Biol.
Chem. 248, 3446-3450.
Be r th o ld D. A ., Sie d o w J ., 1993 Partial purification o f the cyanlcle-resistant alternative oxidase o f skunk cabbage (Symplocaqms J'aetidus) mitochondria. Plant Physiol.
8 0, 8 3 8 -8 4 2 .
Ch a u d h u r iM., Aja y i W ., Te m ple S ., Hill C., 1995. Identifica tion and partial purification o f a stage-specific 33 IcDa mitochondrial protein as the alternative oxidase o f the Trypanosoma brucel brucei bloodstream trypomastl- gotes. J. Eur. Microbiol. 42, 467-472.
Chen Z ., Silva H., Klessic, F., 1993. Active oxygen species in the induction o f plant systemic acquired resistance by salicylic acid. Science 2 6 2 , 1 8 8 3 -1 8 8 6 .
Da yA., Dr yI. B., So o le K. L., Wisk ic h J. T., Moo r e A. L.,
1991. Regulation o f alternative pathway in plant mito chondria. Plant Physiol. 95, 9 4 8 -9 5 3
Da y A., Milla r A. H., Wiskic h J. T., Wh elan J., 1994.
Regulation o f alternative oxidase activity by pyruvate in soybean mitochondria. Plant Physiol. 106, 1421-1427.
Do u c e R., Ne u b u r g e r M., 1989. The uniqueness o f plant mitochondria. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol
.Biol. 4 0, 3 7 1 -4 1 4 .
Dr a b ik o w sk a A. K ., 1978. Oddychanie niewrażliwe na cy janek. Post. Blochem. 24, 5 9 -7 5 .
Dr yB., Mo o r eA. L, Da yA., Wiskic h J. T., 1989. Regulation o f alternative pathway activity in plant mitochondria: nonlinear relationship between electron flu x and the redox poise o f the quinone pool. Arch. Biochem. Bio-
phys. 2 7 3 , 1 4 8 -1 5 7 .
Elt h o nT. E., McIn to sh L., 1987. Identification o f the alter
native terminal oxidase o f higher plant mitochondria.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 8399-8403.
Elth o n T. E., Nic k e ls R. L., McInto sh L., 1989. Mitochondrial events during development o f thermogenesis in Sauro- matum guttatum (Schott). Planta 180, 8 2 -8 9 .
I-Ie n r y M. P., Nyn s E. J., 1975. Cyanide-insensitive respir
ation. An alternative m itochodrial pathway. Sub-
Cell.Bloch. 4, 1-65.
Hryn iew iec kaL., 1993. Mitochondria ameby (Acanthamoeba
castellanii) łączą energetyczne cechy mitochondriów roślin i zwierząt. Post. Biol. Komórki. 20, 181-199.
Ja r m u s zk ie w ic z W., Hr yn ie w ie c k a L., 1994. Regulation o f
electron flu x in the branched respiratory chain in mito chondria o f Acanthamoeba castellanii. Acta Bioch. Po
lonica 2, 218-220
Ja r m u szk ie w ic z W., Wa g n e r A. M., Hr yn ie w ie c k a L., 1996.
Regulation o f the alternative oxidase in amoeba A. castellanii mitochondria. EBEC Reports 9, 36.
KearnsA., WhelanJ., You ngS., Elth o n T. E., Da yD., 1992.
Tissue-specific expression o f the alternative oxidase in soybean and siratro. Plant Physiol. 99, 712-717.
KrabK., 1995. Kinetic and regulato ly aspects o f thefunction
o f the alternative oxidase in plant respiration. J. Bioen-
erg. Biomembr. 27, 387-396.
Kr o ger A., Kligenberg M., 1973. The kinetics o f the redox
reactions o f ubiqulnoue related to the electron-transport activity in the respiratory chain. Eur. J. Biochem. 34,
358-368.
Kum arA. M., So llD., 1992. Arablclopsis alternative oxidase
sustains Escherichia coll respiration. Proc. Natl. Acad.
Sci. 89, 10842-10846.
La m b e r s H., 1982. Cyanide-resistant respiration: A non-
phosphorylating electron transport pathway acting as an energy ovetjlow. Physiol. Plant 55, 478-485.
Lan c eC., Ciiau ea u M., Diz e n g r e m e lP., 1985. The cyanlcle-
resistant pathway o f plant mitochondria. [W:] Encyclo pedia o f Plant Physiology Higher Plant Cell Respiration,
Do u c e R., Da yD.A., (red.), Berlin-New York: Springer-
Verlag. 8, 202-247.
Lam b o w itzA. M., Sa b o u r in J. R., Be r tr a n d H., Nic k e ls R.,
McIn to sh L., 1989. Immunological identification o f the
alternative oxidase o f Neurosporci crassci mitochondria.
Mol. Cell. Biol. 9, 1362-1364.
LeachG. R., KrabK., Wh ite h o u seD. G., Mo o r eA. L., 1996.
Kinetic analysis o f the mitochondrial quinol-oxlclizing enzymes during development o f thermogenesis in Arum maculatum L . Biochem. J. 317, 313-319.
Alternatywna oksydaza niewrażliwa na cyjanek 95
Llo yd D., 1974. The mitochondria o f microorganisms. Aca
demic Press, London-New-York.
McInto sh L., 1994. Molecular biology o f the alternative
oxidase. Plant Physiol. 105, 781-786.
Millar A. H., Ho e f n a g e l M . H. N., Da y D. A ., Wisk ic h J. T.,
1996. Specificity o f the organic acid activation o f alter
native oxidase in plant mitochondria. Plant Physiol. I l l ,
613-618.
Milla r A. H., Wiskic h J. T., Wh e la n J., Day D. A., 1993.
Organic acid activation o f the alternative oxidase o f plant mitochondria. Fed. Europ. Biochem.Societ. 329,
259-262.
Mo lle r I. M ., Lin W ., 1986. Membrane-bound NAD/P/H dehydrogenases in higher plant cells. Ann. Rev. Plant
Physiol. 37, 3 0 9 -3 3 4 .
Mo o reA. L., Sie d o wJ. M., 1991. The regulation and nature
o f the cyanide-resistant alternative oxidase o f plant mitochondria. Biochim. Biophys. Acta 1059, 121-140.
Mo o reA. L., Um b ac h A. L., Sie d o w J. N., 1995. Structure-
function relationships o f the alternative oxidase o f plant mitochondria: a model o f the active site. J. Bioenerg.
Biomembr. 27, 367-377.
Rh o a d s D. M ., McInto sh L., 1991. Isolation and charac
terization o f a cDNA clone encoding an alternative oxi dase protein o f Sauromatum guttatum (Schott). Proc.
Natl. Acad. Sci. 88, 2122-2126.
Rhoads D. M ., McIn to sh L ., 1993. Cytochrome and alterna
tive pathway respiration in tobacco. Effect o f salicylic acid. Plant Physiol. 103, 877-883.
Ru stin P., Moreau F., La n c e C., 1980. Malate oxidation in
plant mitochondria via malic enzyme and the cyanide- insensitive electron transport pathway. Plant Physiol.
66, 457-462.
Ry c h te r A. M., 1982. Alternatywna droga oddechowa w
roślinach wyższych Post. Biochem. 28, 89-111.
Ry c h te r A. M., 1996. Roślinny łańcuch oddechowy. Post. Biochem. 42, 268-276.
Sa kajo S., Min ag aw a N., Ko m iyam a T., Yo sh im o to A., 1991.
Molecular cloning o f cDNA fo r antimycyn A-inducible mRNA and its role in cyanide-resistant respiration in Hansenula anomala. Bioch. Biophys. Acta 1090, 102-
108.
Sa k ajo S., Min agaw a N., Yo sh im o to A., 1993. Characteri
zation o f the alternative oxidase protein in the yeast Hansanula anomala. FEBS Lett. 318, 310-312.
Sie d o w J. M., Mo o r e A. L., 1993. A kinetic model fo r the
regulation o f electron transfer through the cyanide-resis tant pathway in plant mitochondria. Bioch. Biophys.
Acta 1142, 165-174.
Sie d o w J. N., Um b ac h A. L., 1995. Plant mitochondrial
electron transfer and molecular biology. Plant Cell 7,
821-831.
Um b ac hA. L., Sie d o wJ. N., 1993. Covalent and noncovalent
dimers o f the cyanide-resistant alternative oxidase pro tein in higher plant mitochomdria and thier relationship to enzyme activity. Plant Physiol 103, 845-854.
Um b ac hA. L., Wisk ic hJ. T., Sie d o wJ. N., 1994. Regulation
o f alternative oxidase kinetics by pyruvate and inter- molecular disulfide bond redox status in soybean seed ling mitochondria. FEBS Lett. 348, 181-184.
Va n Den Be r g e n C. W . M ., Wa g n e r A . M ., Krab K., Mo o r e A.
L., 1994. The relationship between electronflux and the
redox poise o f the quinone pool in plant mitochondria. Interplay between quinol-oxidizing and quinone-reduc- ing pathways. Eur. J. Biochem. 226, 1071-1078.
Va n le r b e r g h eG. C., Da yD. A., Wisk ic hJ. T., Va n le r b e r g h e
A. E., McIn to shL., 1994. Alternative oxidase activity in
tobacco leaf mitochondria. Dependence on tricarboxylic acid cycle-mediated redox regulation and pyruvate acti vation. Plant Physiol. 109, 353-361.
Va n le r b e r g h eG. C., McIn to shL., 1994. Mitochondrial elec
tron transport regulation o f nuclear gene expression. Studies with the alternative oxidase gene o f tobacco.
Plant Physiol. 105, 867-874.
Va n le r b e r g h e G. C., McInto sh L., 1996. Signals regulating
the expression o f the nuclear gene encoding alternative oxidase o f plant mitochondria. Plant Physiol. I l l , 589-
595.
Wa g n e rA. M ., Va n Em m e r ik W . A. M ., Zw ie r s J. H., Ka ag m a n
H. M . C. M ., 1992. Energy metabolism o f Petunia hybri
da cell suspensions growing in the presence o f antimycin A. [W :] Molecular, Biochemical and Physiological Aspects o f Plant Respiration, La m b e r sH ., Va n Der PlasL. H. W .
(red), Academic Press, The Hague, The Netherlands, 609-614.
Wa g n e rA. M., 1995. A role active oxygen species as second
messengers in the induction o f alternative oxidase gene expresion in Petunia hybrida cells. FEBS Letters 368,
339-342.
Wa g n e r A . M ., Kr ab K., 1995. The alternative respiration
pathway in plants: Role and regulation. Physiol. Plant.
95, 318-325.
Whelan J., Hu g o s s o nM ., Gl a s e rE., Da yD. A., 1995. Studies
on the import and processing o f the alternative oxidase precursor by isolated soybean mitochondria. Plant Mol.
Biol. 27, 769-778.
Wh e lan J., Mil la r A. H., Da y D. A., 1996. The alternative
oxidase is encoded in a multigene fam ily in soybean.
