Medycyna Wet. 2008, 64 (4A) 457
Praca oryginalna Original paper
Bacillus cereus rozwijaj¹cy siê w mleku pasteryzo-wanym powoduje wady jego cech organoleptycznych bêd¹ce wynikiem proteolizy bia³ek. Badania prowa-dzone w ci¹gu ostatnich 15 lat wykaza³y przystoso-wywanie siê B. cereus do rozwoju w coraz ni¿szej tem-peraturze (2, 3). Szczególnie korzystne warunki dla selekcji i rozwoju psychrotrofowych szczepów tego gatunku stwarza wyd³u¿anie czasu przetrzymywania mleka pasteryzowanego w warunkach ch³odniczych, a jednoczenie stosowanie w obróbce cieplnej mleka temperatury powy¿ej 80°C, co pobudza kie³kowanie przetrwalników (8).
B. cereus wywo³uje u cz³owieka dwie postacie za-truæ pokarmowych biegunkow¹ i wymiotn¹. Aktu-alnie znanych jest kilka ró¿nych toksyn odpowiedzial-nych za formê biegunkow¹, ale najlepiej poznan¹ wród nich jest hemolityczna toksyna HBL (12). Z po-wy¿szych wzglêdów w ró¿nych krajach prowadzone s¹ badania nad wystêpowaniem psychrotrofowych szczepów B. cereus w mleku surowym i produktach
mlecznych oraz nad charakterystyk¹ ich cech bioche-micznych, ze szczególnym uwzglêdnieniem toksycz-noci. Uwa¿a siê, ¿e spo¿ycie mleka, w którym wy-stêpuje ponad 103 jtk w 1 cm3 B. cereus mo¿e
spowo-dowaæ zatrucie pokarmowe, nawet w przypadku, gdy w mleku nie wystêpuje równoczenie enterotoksyna biegunkowa, co t³umaczy siê mo¿liwoci¹ kolonizo-wania nab³onka jelita cienkiego przez komórki B. ce-reus i tworzenia toksyny dopiero w przewodzie po-karmowym cz³owieka (4, 11). Istotna jednak¿e wyda-je siê mo¿liwoæ tworzenia enterotoksyny przez psy-chrotrofowe szczepy B. cereus w mleku pasteryzowa-nym jeszcze przed jego spo¿yciem przez konsumenta. Celem badañ by³o okrelenie zdolnoci szczepów B. cereus wyizolowanych z mleka surowego i rodo-wiska jego pozyskiwania do rozwoju w mleku prze-trzymywanym w niskiej temperaturze oraz wytwarza-nia w tych warunkach enterotoksyny HBL. W kraju badañ z tego zakresu nie prowadzono, a doniesienia zagraniczne s¹ nieliczne.
Rozwój i tworzenie enterotoksyny HBL w mleku
przez psychrotrofowe szczepy Bacillus cereus
w niskiej temperaturze
ANNA BERTHOLD, KAROLINA RUTKOWSKA
Zak³ad Biotechnologii Mleka Katedry Biotechnologii, Mikrobiologii i Oceny ¯ywnoci Wydzia³u Technologii ¯ywnoci SGGW, ul. Nowoursynowska 159c, 02-787 Warszawa
Berthold A., Rutkowska K.
Growth and production of diarrheal enterotoxin in milk by Bacillus cereus Summary
The aim of this study was to examine the ability of B. cereus, isolated from raw milk and the environment of milk production, to grow and produce the HBL enterotoxin in milk. In this study three B. cereus strains, isolated from raw milk and the surface of teats, were assessed with respect to their ability to grow and produce HBL enterotoxin in milk that has been stored at the following temperature and time combinations: 3337°C/ 16-18 h; 4°, 6° or 8°C/7 days. The incubation of the specimen was conducted under aerobic conditions or in stationary culture. The general number of B. cereus was measured before and after the incubation. To detect the HBL enterotoxin, the BCET-RPLA test (Argenta Sp. z o. o.) was used after incubation. All of the strains produced enterotoxin in milk stored at 33-37°C, regardless of the aerobic conditions. The final number of B. cereus strain cells increased by approx. 6-7 logarithmic rows compared with the initial one. All of the strains produced HBL toxin at 8°C, under an oxygen atmosphere. Only one strain produced it under oxygen--limited conditions. Depending on the strain, the final numbers of B. cereus cells increased by 2-6 logarithmic rows compared with the initial ones. None of the examined strains produced the HBL enterotoxin at 6°C and 4°C, regardless of aerobic conditions. The highest permissible temperature for pasteurized milk storage in trade is 8°C in Poland. However, this temperature is not low enough to guarantee product safety, as it allows for diarrheal enterotoxin production and growth, as well as growth of psychrotrophic B. cereus strains.
Medycyna Wet. 2008, 64 (4A) 458
Materia³ i metody
Badania przeprowadzono na 3 szczepach B. cereus, pochodz¹cych z kolekcji Zak³adu Biotechnologii Mleka, a wyizolowanych z mleka surowego (szczep 228 i 290) i z powierzchni strzyków (szczep 156). Charakterystykê szcze-pów podano w tab. 1. Szczepy przechowywano na skosach po¿ywki PCSMA (Merck, nr kat. 1.15338.) w temperatu-rze 18°C. Ptemperatu-rzed przyst¹pieniem do badañ szczepy kilku-krotnie przesiewano rysowo na po¿ywkê MYP (Merck, nr kat. 1.05267) w celu ich oczyszczenia.
Zakres badañ dla ka¿dego ze szczepów obejmowa³ okre-lenie zdolnoci do wzrostu oraz do tworzenia enterotoksy-ny typu biegunkowego w nastêpuj¹cych warunkach inku-bacji w ja³owym mleku:
16-18 h, 33-37°C, hodowla napowietrzana albo ho-dowla stacjonarna,
7 dni, 8°C, hodowla napowietrzana albo hodowla sta-cjonarna,
7 dni, 6°C, hodowla napowietrzana albo hodowla sta-cjonarna,
7 dni, 4°C, hodowla napowietrzana albo hodowla sta-cjonarna.
Przed przyst¹pieniem do badañ oczyszczone szczepy przeszczepiano rysowo ez¹ na p³ytki Petriego z po¿ywk¹ MYP, w celu ich namno¿enia. P³ytki inkubowano w
tem-peraturze 30°C przez 72 godzi-ny. Nastêpnie ez¹ pobierano nieco hodowli, przenoszono do 8 cm3
ja³owego 0,85% roztworu NaCl, dok³adnie mieszano i ogrzewano w temperaturze 80°C przez 10 mi-nut. Po sch³odzeniu w zawiesinie okrelano metod¹ p³ytkow¹ liczbê B. cereus ogó³em. Do czasu otrzy-mania tego wyniku zawiesinê prze-chowywano w temperaturze 1-2°C. Nastêpnie zawiesinê dodawano równolegle do 4 kolb z 25 cm3 ja³owego mleka (0,5% t³uszczu) oraz 4
handlo-wych opakowañ kartonohandlo-wych z 0,5 l mleka UHT (0,5% t³uszczu) w takiej iloci, aby pocz¹tkowa liczba B. cereus wynosi³a do 103 jtk w 1 cm3 mleka. Zawartoæ wszystkich
kolb i kartonów z mlekiem UHT dok³adnie mieszano i okre-lano pocz¹tkow¹ liczbê B. cereus w zaszczepionym mleku. Jedn¹ z kolb z mlekiem inkubowano przez 16-18 godzin w ³ani wodnej w temperaturze 33-37°C przy ci¹g³ym wy-trz¹saniu (oko³o 250 obr./min.). Jedno z zaszczepionych przetrwalnikami B. cereus mlek UHT w kartonie inkubo-wano w temperaturze 33-37°C w cieplarce. Pozosta³e kol-by i kartony z zaszczepionym mlekiem umieszczano para-mi (kolba i karton) w lodówkach w temperaturze 4°C ± 0,5°C, 6°C ± 0,5°C lub 8°C ± 0,5°C i przetrzymywano przez 7 dni. Zaszczepione mleko w kolbach codziennie do-k³adnie wytrz¹sano, aby napowietrzyæ próbkê. Po zakoñ-czonej inkubacji oznaczano koñcow¹ liczbê B. cereus oraz obecnoæ enterotoksyny HBL w mleku wed³ug instrukcji testu BCET-RPLA (Argenta Sp. z o.o., nr kat. TD 950).
Wyniki i omówienie
Otrzymane wyniki zestawiono w tab. 2 i 3. Opty-malnymi warunkami tworzenia enterotoksyny biegun-kowej przez szczepy B. cereus podawanymi w
pimien-r N u p e z c z s Pochodzenie Ferlmaketnotzaycja Hkyadzreoilnziya wWwytawruanrzkaanciheotopktsyymnaylnHyBcLh* 6 °,5WCz/r1o0stdni Hemolzia 6 5 1 poswrtiezyrzkcóhwnia + + + + 8 2 2 mlekosurowe + + + + + 0 9 2 mlekosurowe + + + + +
Tab. 1. Charakterystyka badanych szczepów Bacillus cereus
Objanienia: * inkubacja w bulionie mózgowo-sercowym (Merck, nr kat. 1.10493), 37°C, 20 h r N u p e z c z s 7 3 °C 8°C 6°C 4°C y z d ê i m a c i n ¿ ó R ¹ w o k t ¹ z c o p a ¹ w o c ñ o k ¹ b z c il B.cereus m c 1 w k tj g o l( 3) e i n e z r o w T y n y s k o t y z d ê i m a c i n ¿ ó R ¹ w o k t ¹ z c o p a ¹ w o c ñ o k ¹ b z c il B.cereus m c 1 w k tj g o l( 3) e i n e z r o w T y n y s k o t y z d ê i m a c i n ¿ ó R ¹ w o k t ¹ z c o p a ¹ w o c ñ o k ¹ b z c il B.cereus m c 1 w k tj g o l( 3) e i n e z r o w T y n y s k o t y z d ê i m a c i n ¿ ó R ¹ w o k t ¹ z c o p a ¹ w o c ñ o k ¹ b z c il B.cereus m c 1 w k tj g o l( 3) e i n e z r o w T y n y s k o t 6 5 1 6,88 + 6,00 1,11 0,40 8 2 2 5,72 + 2,28 + 0,28- 0,37- 0 9 2 5,75 + 3,20 2,20 0,78
Tab. 3. Wzrost i tworzenie toksyny biegunkowej przez badane szczepy B. cereus w mleku nie poddawanym napowietrzaniu
Objanienia: jak w tab. 2
r N u p e z c z s 7 3 °C 8°C 6°C 4°C y z d ê i m a c i n ¿ ó R ¹ w o k t ¹ z c o p a ¹ w o c ñ o k ¹ b z c il B.cereus m c 1 w k tj g o l( 3) e i n e z r o w T y n y s k o t y z d ê i m a c i n ¿ ó R ¹ w o k t ¹ z c o p a ¹ w o c ñ o k ¹ b z c il B.cereus m c 1 w k tj g o l( 3) e i n e z r o w T y n y s k o t y z d ê i m a c i n ¿ ó R ¹ w o k t ¹ z c o p a ¹ w o c ñ o k ¹ b z c il B.cereus m c 1 w k tj g o l( 3) e i n e z r o w T y n y s k o t y z d ê i m a c i n ¿ ó R ¹ w o k t ¹ z c o p a ¹ w o c ñ o k ¹ b z c il B.cereus m c 1 w k tj g o l( 3) e i n e z r o w T y n y s k o t 6 5 1 6,97 + 6,18 + 0,66 0,96 8 2 2 6,49 + 1,90 + 0,14- 0,61* 0 9 2 5,68 + 3,31 + 2,45 1,87
Tab. 2. Wzrost i tworzenie toksyny biegunkowej przez badane szczepy B. cereus w mleku napowietrzanym
Medycyna Wet. 2008, 64 (4A) 459 nictwie (1, 5) jest hodowla w bulionie
mózgowo-ser-cowym w temperaturze 33-37°C w czasie oko³o 18 godzin przy ci¹g³ym wytrz¹saniu próbki. Zdolnoæ do wytwarzania enterotoksyny biegunkowej w tych wa-runkach mia³y wszystkie badane szczepy (tab. 1).
Tworzenie enterotoksyny biegunkowej przez szcze-py B. cereus w temperaturze optymalnej, tzn. 33-37°C okrelono w mleku odt³uszczonym. Bez wzglêdu na dostêp powietrza w czasie inkubacji wszystkie szcze-py wytworzy³y enterotoksynê. Koñcowa liczba komó-rek badanych szczepów zawiera³a siê w granicach od 108 do 109 jtk/cm3 i by³a o oko³o 6-7 rzêdów wielkoci
wiêksza od liczby pocz¹tkowej. Tylko w przypadku szczepu 290 przyrost liczby komórek w warunkach hodowli stacjonarnej by³ wiêkszy w porównaniu do zmiany liczby w mleku poddawanym napowietrzaniu, chocia¿ ró¿nica by³a niewielka (w mleku napowietrza-nym wzrost liczby komórek wyniós³ 5,68 rzêdu loga-rytmicznego, a w hodowli stacjonarnej 5,75). Do-stêp powietrza wp³yn¹³ na zwiêkszenie aktywnoci wzrostu i wytworzenie wiêkszej masy komórkowej szczepów 156 i 228.
Christiansson i wsp. (5) wyizolowali 136 szczepów B. cereus z mleka i mietanki. Blisko po³owa szcze-pów tworzy³a toksynê HBL w bulionie mózgowo-ser-cowym w temperaturze 32°C, podczas gdy w napo-wietrzanym mleku w temperaturze 30°C a¿ 73% szczepów. Wyniki otrzymane w niniejszych badaniach potwierdzaj¹, ¿e mleko o temperaturze 33-37°C jest odpowiednim rodowiskiem do tworzenia toksyny bie-gunkowej.
W temperaturze 8°C przy napowietrzaniu mleka wszystkie trzy szczepy wytworzy³y enterotoksynê bie-gunkow¹, a liczba ich komórek w czasie inkubacji wzros³a o od 1,90 rzêdu logarytmicznego (szczep 228) do 6,18 rzêdu logarytmicznego (szczep 156). W mle-ku w kartonie, a wiêc bez dodatkowego napowietrza-nia próbki, przechowywanym w temperaturze 8°C, badane szczepy rozwija³y siê z podobn¹ aktywnoci¹. Tylko szczep 228 wytworzy³ w tych warunkach toksy-nê, choæ równoczenie przyrost liczby komórek by³ najmniejszy (o 2,28 rzêdu logarytmicznego). Intere-suj¹cym wydaje siê fakt, ¿e szczep 156 w mleku prze-chowywanym w temperaturze 8°C przy napowietrza-niu próbki osi¹gn¹³ po 7 dniach inkubacji liczbê oko-³o 108 jtk/cm3 i wytworzy³ w tych warunkach toksynê,
natomiast w warunkach ograniczonego dostêpu powie-trza toksyny w próbce nie stwierdzono, choæ przyrost liczby komórek by³ podobny, a koñcowa ich liczba na tym samym poziomie. Podobnie zachowa³ siê szczep 290.
W mleku przetrzymywanym w temperaturze 6°C ¿aden z badanych szczepów nie wytworzy³ enterotok-syny biegunkowej niezale¿nie od dostêpu powietrza. W warunkach napowietrzania próbki mleka tylko u jednego ze szczepów (szczep 290), zaobserwowano silniejszy rozwój, od liczby pocz¹tkowej 2,8 × 104 do
koñcowej 7,9 × 106 jtk/cm3, czyli o ponad 2 rzêdy
lo-garytmiczne. U szczepu 156 koñcowa liczba komórek by³a o nieco ponad 1 rz¹d logarytmiczny wiêksza od liczby pocz¹tkowej. W przypadku szczepu 228 zaob-serwowano zmniejszenie siê liczby komórek w ostat-nim dniu dowiadczenia, ale zmiana ta nie przekra-cza³a 1 rzêdu logarytmicznego. W temperaturze 6°C, ale przy braku dodatkowego napowietrzania mleka zaobserwowano ponownie najsilniejszy rozwój szcze-pu 290. Zwiêkszenie liczby komórek tego szczeszcze-pu wynosi³o 2,2 rzêdu logarytmicznego w 1 cm3. W
tem-peraturze 6°C przy braku napowietrzania mleka przy-rost liczby komórek w 1 cm3 o nieco ponad 1 rz¹d
logarytmiczny stwierdzono tak¿e u szczepu 156. W przypadku szczepu 228 koñcowa liczba komórek zmniejszy³a siê w stosunku do pocz¹tkowej o 0,28 rzê-du logarytmicznego.
Z charakterystyki badanych szczepów zamieszczo-nej w tab. 1 wynika, ¿e szczep 290 jest zdolny do roz-woju na po¿ywce sta³ej w warunkach 6,5°C/10 dni. W niniejszych badaniach wykazano zdolnoæ tego szczepu do wzrostu w mleku w temperaturze 6°C w czasie 7 dni, a wiêc potwierdzono jego psychrotro-fowoæ.
W mleku przetrzymywanym w temperaturze 4°C ¿aden z badanych szczepów nie wytworzy³ enterotok-syny biegunkowej niezale¿nie od dostêpu powietrza. W warunkach napowietrzania próbki mleka wzrost liczby komórek szczepu 290 wynosi³ 1,87 rzêdu loga-rytmicznego (koñcowa liczba wynosi³a 2,4 × 106 jtk/
cm3), a przy ograniczonym dostêpie powietrza nieco
poni¿ej 1 rzêdu logarytmicznego. Niewielki wzrost liczby komórek zaobserwowano tak¿e dla szczepu 156 w temperaturze 4°C niezale¿nie od dostêpu powietrza. Wzrost liczby komórek dla tego szczepu wyniós³ 0,96 rzêdu logarytmicznego w warunkach hodowli napo-wietrzanej i 0,40 w nienaponapo-wietrzanej. W przypadku szczepu 228, podobnie jak w czasie inkubacji w tem-peraturze 6°C zaobserwowano zmniejszenie siê licz-by komórek, ale spadek nie przekracza³ 1 rzêdu loga-rytmicznego.
Podsumowuj¹c, w mleku przetrzymywanym w tem-peraturze 8°C wszystkie badane szczepy wytworzy³y enterotoksynê w warunkach napowietrzania próbki i tylko jeden szczep przy ograniczonym dostêpie po-wietrza. ¯aden ze szczepów nie wytworzy³ toksyny w temperaturze 4°C i 6°C bez wzglêdu na dostêpnoæ tlenu w rodowisku. Otrzymane wyniki znajduj¹ po-twierdzenie w danych pimiennictwa. Nothermans i Tatini (13) badali rozwój i tworzenie toksyny bie-gunkowej w bulionie mózgowo-sercowym i w mleku przez dwa szczepy B. cereus, wyizolowane z przypad-ku zatrucia pokarmowego. Inprzypad-kubacjê prowadzili w temperaturze 10°C i 15°C w czasie 72 godzin przy ci¹g³ym wytrz¹saniu próbki. W temperaturze 10°C tylko jeden z badanych szczepów wytworzy³ toksynê zarówno w bulionie, jak i w mleku. W temperaturze 15°C oba szczepy wytworzy³y toksynê ju¿ po 24 go-dzinach inkubacji w obu stosowanych po¿ywkach.
Medycyna Wet. 2008, 64 (4A) 460
Liczba B. cereus wynosi³a 106-107 jtk w 1 cm3. Van
Netten i wsp. (16) stwierdzili wytwarzanie toksyny biegunkowej przez szczepy B. cereus w mleku prze-chowywanym w niskiej temperaturze. Obecnoæ tok-syny wykryli w mleku przetrzymywanym w tempera-turze 4°C w 24. dniu inkubacji, w mleku przetrzymy-wanym w temperaturze 7°C w 12. dniu, a przy inku-bacji w temperaturze 17°C ju¿ po 2 dniach. Jedno-czenie liczba B. cereus w 1 cm3 mleka wynosi³a
106-107 jtk we wszystkich zastosowanych wariantach
temperatury. W 38% próbek mleka pasteryzowanego handlowego przechowywanego w temperaturze 10°C, Odumeru i wsp. (14) stwierdzili w ostatnim dniu przy-datnoci do spo¿ycia obecnoæ enterotoksyny biegun-kowej. W próbkach tych B. cereus obecny by³ w licz-bie od 103 do 106 jtk w 1 cm3. W ¿adnej z próbek
mleka, ale przechowywanych w temperaturze 4°C, entertoksyna nie by³a obecna, co potwierdza wyniki uzyskane w niniejszych badaniach. Griffiths (10), sto-suj¹c ten sam test do wykrywania enterotoksyny, jak w niniejszych badaniach (BCET-RPLA), wykaza³ jej wytwarzanie przez psychrotrofowe szczepy B. cereus w mleku przetrzymywanym w temperaturze 6°C. Psy-chrotrofowe szczepy B. cereus mog¹ wytwarzaæ ente-rotoksynê biegunkow¹ w mleku przetrzymywanym przez 7 dni w temperaturze 8°C i 6°C (6). Toksyna by³a wytwarzana jedynie w mleku napowietrzanym.
O ogromnym wp³ywie dostêpnoci tlenu w rodo-wisku na wytwarzanie przez B. cereus toksyny bie-gunkowej wiadcz¹ tak¿e wyniki opublikowane przez Christiansson i wsp. (5). Toksynotwórczy szczep B. cereus wyizolowany z mleka, wprowadzili do mle-ka w mle-kartonowych opakowaniach oraz do bitej mie-tany, a nastêpnie próbki przechowywali w temperatu-rze 8°C w czasie 4 dni. Toksynê w mleku stwierdzili tylko w kartonie, który przez ca³y czas dowiadczenia by³ otwarty i wytrz¹sany. W pozosta³ych próbkach mleka nie wykryli obecnoci enterotoksyny, chocia¿ zaobserwowali rozwój B. cereus. Natomiast w bitej mietanie ju¿ w 3. dniu inkubacji stwierdzili toksynê biegunkow¹, a liczba B. cereus by³a na tym samym poziomie, co w mleku. W niniejszych badaniach uzys-kano wyniki potwierdzaj¹ce wp³yw obecnoci tlenu w pod³o¿u na tworzenie toksyny przez B. cereus. W temperaturze 8°C w mleku nienapowietrzanym toksynê wytworzy³ tylko szczep 228, podczas gdy przy zwiêkszonym dostêpie tlenu wszystkie badane szczepy.
Aktywnoæ enterotoksynotwórcza szczepów B. ce-reus fermentuj¹cych laktozê jest wiêksza ni¿ szcze-pów, które tego cukru nie wykorzystuj¹. Obecnoæ w rodowisku wêglowodanów np. laktozy w iloci po-wy¿ej 10 g/l zwiêksza wytwarzanie toksyn (7, 15). Wród szczepów B. cereus badanych przez Giffela i wsp. (9) za toksynotwórcze uznano 68% nie wyko-rzystuj¹cych laktozy i oko³o 90% laktozododatnich. Wszystkie szczepy poddane niniejszym badaniom fer-mentowa³y laktozê.
Wnioski
1. Najwy¿sza dopuszczalna w Polsce temperatura przechowywania mleka spo¿ywczego pasteryzowane-go w handlu (8°C) nie jest temperatur¹ wystarczaj¹c¹ do zagwarantowania bezpieczeñstwa zdrowotnego produktu ze wzglêdu na mo¿liwoæ rozwoju i tworze-nia toksyny biegunkowej przez psychrotrofowe szcze-py B. cereus.
2. Przechowywanie mleka w temperaturze poni¿ej 6°C do 7 dni zapobiega wytwarzaniu przez B. cereus enterotoksyny biegunkowej.
3. W mleku i rodowisku jego pozyskiwania wystê-puj¹ szczepy B. cereus zdolne do kie³kowania i roz-woju w mleku w temperaturze 4°C w czasie 7 dni.
4. Jednym z warunków wytwarzania enterotoksyny biegunkowej jest dostêpnoæ tlenu w rodowisku roz-woju B. cereus.
Pimiennictwo
1.Baker J., Griffiths M.: Growth of and toxin production by psychrotrophic Bacillus cereus. J. Dairy Sci. 1992, 75, supl. 1, 136-143.
2.Berthold A.: Zdolnoæ szczepów Bacillus cereus pochodz¹cych z mleka surowego, rodowiska jego pozyskiwania oraz z produktów mlecznych do rozwoju w niskiej temperaturze. Medycyna Wet. 2007, 63, 471-474. 3.Borge G., Skeie M., Sorhaug T., Langsrud T., Granum P.: Growth and toxin
profiles of Bacillus cereus isolated from different food sources. Int. J. Food Microbiol. 2001, 69, 237-246.
4.Christiansson A., Giffel M.: Taxonomy and identification of Bacillus cereus. Bulletin IDF 2000, 357, 40-43.
5.Christiansson A., Naidu A., Nilsson I., Waldstróm T., Pettersson H.: Toxin production by Bacillus cereus dairy isolates in milk at low temperatures. Appl. Environ. Microbiol. 1989, 55, 2595-2600.
6.Fermanian C., Lapeyre C, Fremy J., Clarisse M.: Diarrhoeal toxin produc-tion at low temperature by selected strains of Bacillus cereus. J. Dairy Res. 1997, 64, 551-559.
7.Garcia-Arribas M., Kramer J.: The effect of glucose, starch and pH on growth and haemolysin production by strains of Bacillus cereus associated with food poisoning and nongastrointestinal infection. Int. J. Food Microbiol. 1990, 47, 21-34.
8.Giffel M., Beumer R., Christiansson A., Griffiths M.: Bacillus cereus in milk and milk products. Advances in detection, typing and epidemiology. Bulle-tin IDF 2000, 357, 47-54.
9.Giffel M., Beumer R., Granum P., Rombouts F.: Isolation and characteri-zation of Bacillus cereus from pasteurized milk in household refrigerators in the Netherlands. Int. J. Food Microbiol. 1997, 34, 307-318.
10.Griffiths M.: Toxin production by psychrotrophic Bacillus spp. present in milk. J. Food Prot. 1990, 53, 790-792.
11.McKillip J.: Prevalence and expression of enterotoxins in Bacillus cereus and other Bacillus spp., a literature review. Antonie van Leeuwenhoek 2000, 77, 393-399.
12.Nothermans S., Giffel M.: Bacillus cereus: its toxins and their significance. Bulletin IDF 357, 43-47.
13.Nothermans S., Tatini S.: Characterization of Bacillus cereus in relation to toxin production. Neth. Milk Dairy J. 1993, 47, 71-77.
14.Odumeru J., Toner A., Muckle C., Griffiths M., Lynch J.: Detection of Bacil-lus cereus diarrholeal enterotoxin in raw and pasteurized milk. J. Food Prot. 1997, 60, 1391-1393.
15.Sutherland A., Limond A.: Influence of pH and sugars on the growth and production of diarrhoeagenic toxin by Bacillus cereus. J. Dairy Sci. 1993, 60, 575-580.
16.Van Netten P., van De Moosolijk A., van Hoensel P., Mossel D., Perales I.: Psychrotrophic strains of Bacillus cereus producing enterotoxin. J. Appl. Bacteriol. 1990, 69, 73-79.
Adres autora: dr in¿. Anna Berthold, ul. Nowoursynowska 159c, 02-787 Warszawa; e-mail: anna.berthold@wp.pl
