Medycyna Wet. 2009, 65 (10) 693
Praca oryginalna Original paper
Angiogeneza (neowaskularyzacja, naczyniotworze-nie) jest procesem wieloetapowym, prowadz¹cym do powstania nowych naczyñ krwiononych na bazie ist-niej¹cych naczyñ gospodarza zarówno w tkankach zdrowych, jak i nowotworowych (10). Fizjologiczna angiogeneza wystêpuje w okresie embriogenezy, owu-lacji, ci¹¿y oraz podczas gojenia ran i pozostaje pod cis³¹ kontrol¹ czynników aktywuj¹cych lub hamuj¹-cych podzia³y komórek endotelialnych (1, 10, 17). Jest procesem samoograniczaj¹cym w tkankach prawid³o-wych, podczas gdy w tkankach patologicznie zmie-nionych komórki ródb³onka dziel¹ siê 20-2000 razy szybciej i prze¿ywaj¹ znacznie d³u¿ej (6).
Naczyniotworzenie stanowi tak¿e wa¿ny element patogenezy wielu chorób. Wykazano jego znaczenie w rozwoju takich chorób, jak: ³uszczyca, reumatoidal-ne zapalenie stawów, zapalenie naczyñ, schorzenia gastrologiczne (nieswoiste zapalenie jelit, zapalenie b³ony luzowej ¿o³¹dka), mia¿d¿yca, choroba niedo-krwienna serca oraz cukrzyca (2, 10, 20). Zasadnicz¹ rolê angiogeneza odgrywa w rozwoju chorób nowo-tworowych (1, 6, 10, 15, 17, 19, 20).
Folkman (4) stwierdzi³, ¿e guz w pocz¹tkowej fazie jest od¿ywiany drog¹ dyfuzji i mo¿e przetrwaæ w sta-dium przedinwazyjnym przez wiele miesiêcy. Stan taki mo¿e trwaæ do czasu, a¿ w pewnej grupie komórek pojawi siê fenotyp angiogenny i proces angiogenezy wymyka siê spod mechanizmów kontrolnych. Docho-dzi do sta³ego uwalniania przez komórki guza czynni-ków stymuluj¹cych komórki ródb³onka do prolifera-cji i tworzenia nowej kapilary (17).
Celem badañ by³o okrelenie stopnia unaczynienia tkanek nowotworowych oraz tkanek prawid³owych mi¹¿szu ledziony psów.
Materia³ i metody
Materia³ do badañ stanowi³y ledziony pobrane od psów leczonych w Katedrze i Klinice Chirurgii Zwierz¹t UP w Lublinie. Pierwsz¹ grupê stanowi³y ledziony ze zmia-nami patologicznymi, pobrane podczas splenektomii (ryc. 1, 2). Operowano 4 samice i 5 samców w wieku 8-13 lat, ró¿-nych ras: rottweiler 2, owczarek niemiecki 2, miesza-niec 2 oraz owczarek collie, spaniel i jamnik. Psy nie by³y wczeniej leczone z powodu choroby nowotworowej.
Angiogeneza w nowotworach z³oliwych
ledziony u psów
ALEKSANDRA SOBCZYÑSKA-RAK, PIOTR SILMANOWICZ, EL¯BIETA SOBOLEWSKA*
Katedra i Klinika Chirurgii Zwierz¹t Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej UP, ul. G³êboka 30, 20-612 Lublin *Katedra i Zak³ad Patomorfologii Klinicznej UM, ul. Jaczewskiego 8, 20-090 Lublin
Sobczyñska-Rak A., Silmanowicz P., Sobolewska E.
Angiogenesis in malignant spleen cancers in dogs Summary
The aim of the study was to determine the level of vascularization of neoplastic and healthy splenic parenchyma tissue in dogs. The first research group comprised spleen samples with diagnosed tumor changes extracted during splenectomy. Four male and five female dogs, aged between 8 and 13 years and of various races, were operated on. The second group comprised 10 samples of healthy spleen tissue extracted post-mortem. After staining with haematoxylin and eosin, the samples were diagnosed and the tumor type classified according to the official WHO classification. In order to render the vascular endothelium visible, immunohistochemical staining was performed with the use of the polyclonal antibody against the von Willebrand factor F VIII and the DAKO EnVision system. Angiogenesis that was observed in malignant spleen cancer tissue was intensified in comparison to that in healthy perenchyma tissue. The mean vascular density observed in malignant splenic tumors was 87 capillary vessels/mm2. The mean vessel density was 60/mm2
in lymphomas, while in angiosarcomas it averaged 108/mm2. In healthy splenic tissue the observed mean
vascular density was 14 vessels/mm2. The highest vascular density was noted in tumors with metastases
to other abdominal cavity organs (mean 132 vessels/mm2). The observations may provide practitioners with
a valuable prognostic insight into the potential danger of metastasis. Keywords: angiogenesis, tumour, spleen, dog
Medycyna Wet. 2009, 65 (10) 694
We wszystkich przypadkach w³aciciele informo-wali o zaburzeniach w przyjmowaniu pokarmu i nag³ej utracie masy cia³a zwierzêcia. U 50% osob-ników objawem dominuj¹cym by³y uporczywe wymioty. Badanie rtg i/lub usg w 2 przypadkach wykaza³o nowotworowe ogniska przerzutowe w w¹trobie, w jednym zmiany w p³ucach, u innego osobnika wykazano obecnoæ przerzutów w trzust-ce i jelitach. Zmiany nowotworowe obejmuj¹trzust-ce wy³¹cznie mi¹¿sz ledziony stwierdzono u 6 psów. Drug¹ badan¹ grupê (10 próbek) stanowi³y pra-wid³owe tkanki ledziony pobrane podczas sekcji od psów poddanych eutanazji z powodu chorób innych ni¿ nowotworowe.
Materia³ po splenektomii dostarczano do Kated-ry Anatomii Patologicznej Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej UP w Lublinie. Wycinki guzów utrwalano w 10% buforowanej formalinie przez 24 h. Po utrwaleniu materia³ odwadniano we wzra-staj¹cych stê¿eniach alkoholi i zatapiano w parafi-nie. Na podstawie preparatów barwionych hema-toksylin¹ i eozyn¹ ustalano rozpoznanie i okrela-no typ okrela-nowotworu wed³ug obowi¹zuj¹cej klasyfi-kacji WHO. W celu uwidocznienia ródb³onka
naczyñ wykonano barwienie immunohistochemiczne z za-stosowaniem poliklonalnego przeciwcia³a przeciwko czynni-kowi von Willebranda F VIII przy u¿yciu systemu EnVision firmy DAKO.
Identyczn¹ procedurê zastosowano do barwienia prepa-ratów z tkanek ledziony prawid³owej. Wybarwione pre-paraty oceniano w Katedrze i Zak³adzie Patomorfologii Klinicznej UM w Lublinie. Do ilociowej oceny naczyñ krwiononych wykazuj¹cych ekspresjê czynnika F VIII wykorzystano system komputerowo wspomaganej analizy obrazu mikroskopowego. W dziesiêciu polach widzenia li-czono naczynia i okrelano redni¹ liczbê naczyñ przypa-daj¹c¹ na 1 mm2.
Wyniki i omówienie
Wyniki badania histopatologicznego i immunohisto-chemicznego podano w tab. 1.
Badanie histopatologiczne potwierdzi³o z³oliwy charakter wszystkich nowotworów. W 5 przypadkach rozpoznano naczyniakomiêsaka (haemangiosarcoma), a w 4 ch³oniaka z³oliwego (lymphosarcoma).
Badanie immunohistochemiczne (ryc. 3, 4). red-nia gêstoæ naczyñ w nowotworach z³oliwych ledzio-ny wynios³a 87 kapilar/mm2. Najwiêksz¹ liczbê
na-czyñ stwierdzono w 2 naczyniakomiêsakach wyno-si³a ona 183 i 162 naczynia/mm2 powierzchni guza.
W pozosta³ych 3 naczyniakomiêsakach gêstoæ naczyñ waha³a siê w granicach 48-96/mm2. W ch³oniakach
liczba naczyñ by³a mniejsza i wynios³a rednio 60/mm2.
W tkance pobranej z niezmienionych nowotworowo ledzion rednia gêstoæ naczyñ wynios³a 14 naczyñ/ 1 mm2 powierzchni guza (ryc. 5). Najwiêcej naczyñ
stwierdzono w tkance nowotworowej 4 osobników, u których wystêpowa³y przerzuty do innych narz¹dów. W przypadkach tych zanotowano wyniki od 88 do 183
Ryc. 2. Ch³oniak z³oliwy obraz ródoperacyjny
Ryc. 1. Naczyniakomiêsak ledziony obraz ródoperacyjny
a s p s i p O hisRtoopzapotozlnoagniciezne Przerzuty naGcêzysñto/mæm2 r 5 , 9 , ,r e li e w tt o R (hnaaecmzyanniagikoosmaricêosamka) wjeilclztinaech, e c t s u z rt 1831 l 1 1 , , c e i n a z s e i M l(ymcphh³oosnairackoma) wpilc³uzcnaech 88 l 8 , ,i k c e i m e i n k e r a z c w O l(ymcphh³oosnairackoma) brak 62 l 2 1 , , e il l o c k e r a z c w O l(ymcphh³oosnairackoma) brak 30 l 3 1 , , c e i n a z s e i M (hnaaecmzyannigaikoosmaircêosamka) brak 48 l 0 1 , ,l e i n a p S (hnaaecmzyannigaikoosmaircêosamka) brak 52 l 9 , ,i k c e i m e i n k e r a z c w O (hnaaecmzyanniagikoosmaircêosamka) w¹rtoba 96 l 1 1 , ,r e li e w tt o R (hnaaecmzyanniagikoosmariêcosamka) w¹rtoba 1621 l 0 1 , , k i n m a J l(ymcphh³oosnairackoma) brak 60 Tab. 1. Charakterystyka pacjentów i wyników badañ
Medycyna Wet. 2009, 65 (10) 695
(rednio 132) kapilar/mm2. Mniejsze nasilenie
angio-genezy wykazano w guzach bez przerzutów, a naj-mniejsz¹ liczbê kapilar stwierdzono w zdrowym mi¹¿-szu ledziony (ryc. 6).
Nowotwory ledziony rozpoznawane s¹ u psów co-raz czêciej. Mog¹ rozwijaæ siê jako guzy pierwotne lub przerzutowe. Do najczêciej stwierdzanych nowo-tworów z³oliwych ledziony u zwierz¹t miêso¿ernych nale¿¹: naczyniakomiêsaki (haemangiosarcomata), ch³oniaki z³oliwe (lymphosarcomata) i miêsaki (sar-comata), rzadziej spotyka siê nowotwory niez³oliwe: t³uszczaki i miêniaki (11).
Naczyniakomiêsaki s¹ nowotworami wywodz¹cy-mi siê z komórek ródb³onka naczyñ krwiononych (3). Predysponowanymi rasami s¹: owczarki niemiec-kie, retrievery, dogi, boksery, setery angielskie i mie-szañce (3, 11). Guzy pojawiaj¹ siê zazwyczaj u osob-ników starszych, w wieku 8-13 r. ¿. (1, 8, 13, 14, 18). Rosn¹ one w postaci szarych lub czerwono-czarnych pojedynczych lub mnogich guzów. Nale¿¹ do guzów wolno rosn¹cych i mog¹ do momentu rozpoznania
osi¹gn¹æ rozmiary od kilku milimetrów do kilkunastu centymetrów. Czêsto w masie nowotworu stwierdza siê ogniska martwicy i wylewy krwawe (11, 14). Prze-rzuty przy naczyniakomiêsakach pojawiaj¹ siê g³ów-nie w w¹trobie i p³ucach. redni czas prze¿ycia psów po splenektomii wynosi 4-5 miesiêcy (1, 5, 8, 11, 18). Ch³oniaki z³oliwe ledziony wywodz¹ siê z lim-focytów. Znaczne powiêkszenie ledziony i rozrost nowotworowy pojawiaj¹ siê zwykle w postaci wielo-ogniskowej ch³oniaka i wówczas zmiany chorobowe dotycz¹ tak¿e wêz³ów ch³onnych, w¹troby oraz szpiku kostnego (11, 13, 16). Mog¹ wystêpowaæ w ró¿nych grupach wiekowych, ale najczêciej dotycz¹ psów w wieku rednim. W przypadku zaawansowanej wie-loogniskowej postaci ch³oniaka limfatycznego obraz kliniczny jest bardzo zró¿nicowany. Mog¹ go charak-teryzowaæ niespecyficzne objawy ¿o³¹dkowo-jelitowe oraz zaburzenia uk³adu krwiotwórczego (15).
Trzecim typem nowotworu rozpoznawanym w mi¹¿-szu ledziony s¹ miêsaki. Do grupy tej nale¿¹: w³ók-niakomiêsaki, miêsaki histiocytarne oraz miêsaki
nie-Ryc. 4. Naczyniakomiêsak barwienie immunohistochemicz-ne, powiêkszenie 200 × (rycina przedstawia 41 wybarwionych naczyñ krwiononych)
Ryc. 3. Prawid³owy mi¹¿sz ledziony barwienie immuno-histochemiczne, powiêkszenie 600 × (rycina przedstawia 9 wy-barwionych naczyñ krwiononych)
108 60 14,5 0 20 40 60 80 100 120 Badane grupy
Naczyniakomiêsak Ch³oniak z³oœliwy Grupa kontrolna
2 Liczba naczyñ/mm 0 20 40 60 80 100 120 140 2 Liczba naczyñ/mm Nowotwory z³oœliwe z przerzutami Nowotwory z³oœliwe bez przerzutów Grupa kontrolna
Ryc. 6. Porównanie angiogenezy w nowotworach z³oliwych, nowotworach z³oliwych z przerzutami i grupie kontrolnej Ryc. 5. Porównanie redniej gêstoci naczyñ w badanych
Medycyna Wet. 2009, 65 (10) 696
zró¿nicowane. Wystêpuj¹ one najczêciej w postaci pojedynczych guzków uwypuklaj¹cych siê nad po-wierzchniê narz¹du (11, 13).
Objawy kliniczne guzów ledziony zale¿¹ od ich lokalizacji i wielkoci. Czêsto guz rozpoznawany jest przypadkowo podczas omacywania jamy brzusznej lub badania radiologicznego. Nowotwory ledziony mog¹ wywo³ywaæ objawy niespecyficzne, tj.: os³abienie, powiêkszenie objêtoci brzucha, wymioty, bladoæ b³on luzowych, znaczne wychudzenie, zaburzenia kr¹¿eniowe i oddechowe oraz zmiany hematologicz-ne, takie jak: leukocytoza, anemia lub trombocyto-penia (7-9, 11). W przypadku pêkniêcia guzów zlo-kalizowanych w ledzionie mo¿e dojæ do mierci zwierzêcia wród objawów wstrz¹su (13, 14). Po po-twierdzeniu rozpoznania na podstawie badania rtg lub usg postêpowaniem z wyboru jest splenektomia (7, 11, 14).
Tworzenie naczyñ w guzie jest procesem warunku-j¹cym jego dalszy rozwój i zwiastuje pocz¹tek obja-wów choroby nowotworowej (17). Ocena unaczynie-nia guzów wykorzystywana jest w prognozowaniu, terapii oraz ocenie efektów leczenia nowotworów. Do badania nasilenia angiogenezy wykorzystywana jest metoda polegaj¹ca na znakowaniu ródb³onka naczy-niowego, przy u¿yciu ró¿nych typów przeciwcia³. Po wybarwieniu okrela siê gêstoæ mikronaczyñ (micro-vessel density MVD) (7, 12, 18, 19). W przeprowa-dzonych badaniach u¿yto poliklonalnego przeciwcia-³a przeciwko czynnikowi von Willebranda F VIII (15). Wykazano znacznie wiêksz¹ gêstoæ naczyñ w nowo-tworach z³oliwych ledziony w porównaniu z niezmie-nionym chorobowo mi¹¿szem narz¹du. Najwiêksz¹ gêstoæ naczyñ stwierdzano w naczyniakomiêsakach z przerzutami do narz¹dów jamy brzusznej (rednio 132 naczynia/mm2).
Do chwili obecnej udowodniono wzmo¿enie pro-cesu angiogenezy podczas rozwoju guzów litych: pier-si, krtani, gruczo³u krokowego, pêcherza moczowe-go, p³uc i jelita grubego u ludzi. Wykazano, ¿e jest ona zwi¹zana ze stopniem zaawansowania kliniczne-go choroby nowotworowej, czêstoci¹ pojawiania siê przerzutów i rokowaniem (6, 10, 12, 15, 17).
We wczeniejszych badaniach w³asnych (15) po-twierdzono wartoæ diagnostyczn¹ i prognostyczn¹ angiogenezy w nowotworach z³oliwych skóry i tkan-ki podskórnej u psów. Wykazano, ¿e du¿a gêstoæ na-czyñ (218-335/mm2) w raku p³askonab³onkowym,
guzach komórek tucznych i nowotworach zatoki przy-odbytowej mo¿e zostaæ uznana za marker histologicz-nego stopnia z³oliwoci (15). Od niedawna trwaj¹ badania nad rol¹ powstawania naczyñ w chorobach rozrostowych uk³adu krwiotwórczego. Wykazano na-silenie angiogenezy w pocz¹tkowym okresie przewle-k³ej bia³aczki limfoblastycznej u dzieci. W badanej grupie gêstoæ naczyñ uleg³a znacznemu zmniejsze-niu w okresie remisji, lecz nie mia³a statystycznie istot-nego wp³ywu na rokowanie (12). Podczas badañ
pa-cjentów ze szpiczakiem plazmocytowym i ch³oniakiem z³oliwym wykazano nasilon¹ neowaskularyzacjê, któ-ra jednak nie korelowa³a ze zwiêkszonym naciekiem nowotworowym i rokowaniem (6).
Dane pimiennictwa oraz badania w³asne pozwala-j¹ zatem wysun¹æ hipotezê, ¿e nasilenie angiogenezy mo¿e stanowiæ wskazówkê dla lekarza weterynarii odnonie do tendencji pojawiania siê przerzutów w in-nych narz¹dach, szczególnie w okresie pooperacyjnym. Natomiast przed rozpoczêciem leczenia okrelenie gêstoci mikronaczyñ (microvessel density MVD) mo¿e stanowiæ wartociow¹ informacjê w ocenie ro-kowania rozwoju choroby nowotworowej.
Pimiennictwo
1.Akhtar N., Padilla M. L., Dickerson E. B., Steinberg H., Breen M., Auer-bach R., Helfand S. C.: Interleukin-12 inhibitis tumor growth in a novel angiogenesis canine hemangiosarcoma xerograf model. Neoplasia 2004, 6, 106-116.
2.Carmeliet P., Jain R. K.: Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature 2000, 407, 249-257.
3.De Lorimier L. P., Kitchell B. E.: Leczenie pacjentów z naczyniakomiêsa-kiem krwiononym. Weterynaria po Dyplomie 2003, 4, 16-24.
4.Folkman J.: Clinical applications of research on angiogenesis. N. Engl. J. Med. 1995, 333, 1757-1763.
5.Fosmire S. P., Dickerson E. B., Scott A. M., Bianco S. R., Pettengill M. J., Meylemans H., Padilla M., Frezer-Abel A. A., Akhtar N., Getzy D. M., Wojcieszyn J., Breen M., Helfand S. C., Modiano J. F.: Canine malignant hemangiosarcoma as a model of primitive angiogenic endothelium. Lab. Invest. 2004, 84, 562-572.
6.Grosicki S., Grosicka A., Ho³owiecki J.: Kliniczne znaczenie angiogenezy i czynników j¹ modyfikuj¹cych w onkohematologii. Wiad. Lek. 2007, 60, 39-46.
7.Gûlbahar M. Y., Gûvenc T., Besalti O.: Splenic hemangiosarcoma with abdominal dissemination in a dog. Tr. J. Vet. Anim. Sci. 1998, 22, 459-463. 8.Johnson K. A., Powers B. E., Withrow S. J., Sheetz M. J., Curtis C. R., Wrigley R. H.: Splenomegaly in dogs. Predictors of neoplasia and survival after splenectomy. J. Vet. Intern. Med. 1989, 3, 160-166.
9.Kessler M., Maurus Y., Kõstin R.: Hemangiosarcoma of the spleen: clinical aspects in 52 dogs. Tierarztl. Prax. Ausg. Klientiere 1997, 6, 651-656. 10.Mizia-Malarz A., Sobol G., Wo H.: Angiogeneza w przewlek³ych
schorze-niach zapalnych i nowotworowych. Pol. Merk. Lek. 2008, 141, 185-189. 11.Morris J., Dobson J.: Small Animal Oncology. Blackwell Science Ltd,
London 2001.
12.Owoc-Lempach J., Chybicka A.: Znaczenie angiogenezy w nowotworach wystêpuj¹cych w populacji dzieciêcej. Okol. Pol. 2006, 9, 87-92. 13.Sapierzyñski R., Malicka E., Bielecki W., Krawiec M., Osiñska B.,
Sendec-ka H., Sobczyk-Filipiak M.: Powiêkszenie ledziony u psów: przegl¹d 97 przy-padków. Medycyna Wet. 2007, 63, 88-71.
14.Sapierzyñski R., Sapierzyñska E.: Nowotwory naczyniowe u psów i kotów. ¯ycie Wet. 2005, 80, 36-40.
15.Sobczyñska-Rak A.: Angiogeneza w nowotworach skóry i tkanki podskór-nej. Medycyna Wet. 2009, 65, 110-114.
16.Soko³owska J.: Ch³oniaki u psów. Czêæ I. wystêpowanie, objawy i etiologia. ¯ycie Wet. 2005, 80, 162-165.
17.Swidziñska E., Naumnik W., Chyczewska E.: Angiogeneza i neoangiogeneza znaczenie w raku p³uca i innych nowotworach. Pneumonol. Alergol. Pol. 2006, 74, 414-420.
18.Warren A. L., Summers B. A.: Epithelioid variant of hemangioma and hemangiosarcoma in the dog, horse and cow. Vet. Pathol. 2007, 44, 15-24. 19.Wolfesberger B., Tonar Z., Witter K., Guija de Arespocohaga A., Skalicky M.,
Walter I., Thalhammer G. F.: Microvessel density in normal lymph nodes and lymphomas of dogs and their correlation with vascular endothelial growth factor expression. Res. Vet. Sci. 2008, 1, 56-61.
20.Zielonka T. M.: Angiogeneza czêæ I. Mechanizm powstawania nowych naczyñ. Alergia Astma Immunologia 2003, 8, 169-174.
Adres autora: dr Aleksandra Sobczyñska-Rak, ul. G³êboka 30, 20-612 Lublin; e-mail: olsob@poczta.onet.pl
