Praca oryginalna Original paper
Problem regulacji zdolnoci rozrodczych u suk zaj-muje obecnie istotne znaczenie w praktyce lekarsko-weterynaryjnej. Podstawê do szerokiego stosowania in-iekcyjnej formy estrogenów stanowi¹ pozytywne wyni-ki badañ klinicznych przeprowadzonych na ponad 300 sukach, którym podawano dwukrotnie dawkê 10 µg/kg benzoesanu estradiolu w trzecim i pi¹tym dniu po kry-ciu (26). W przypadku podejrzenia o powtórne krycie podawano równie¿ trzeci¹ dawkê (w 7. dniu), co we-d³ug naszych obserwacji jest zbêdne. Aplikacja estro-genów w koñcowym okresie rui powoduje d³ugotrwa³e zamkniêcie cieni jajowodu, zak³óca transport embrio-nów, wywo³uj¹c w nich zmiany toksyczne, uniemo¿li-wia implantacje i w rezultacie zapobiega powstawaniu ci¹¿y (28, 31).
Zarejestrowano wiele preparatów estrogenowych do stosowania w celu zapobiegania ci¹¿y, s¹ one tanie i ³atwe do zastosowania, jednak¿e mog¹ wywo³ywaæ nie-po¿¹dane efekty uboczne (1, 5, 7, 13). Z tego powodu szereg towarzystw weterynaryjnych wycofa³o
rekomen-dacje ich stosowania, uzasadniaj¹c to brakiem wyników badañ prognostycznych oraz brakiem okrelenia skutecz-nej i bezpieczskutecz-nej wielkoci dawki (31). Wyniki doko-nanej przez nas oceny histopatologicznej macicy suk w 14. i 28. dniu po aplikacji 10 lub 100 µg/kg benzo-esanu estradiolu (14) wykaza³y wystêpowanie cech co najmniej rozrostu z³o¿onego (complex hyperplasia).
Obserwowane zmiany komórek nab³onka powierz-chownego, jak i gruczo³ów podstawnych wykazywa³y cechy budowy nab³onka transformowanego dzia³aniem progesteronu.
Zmiany zachodz¹ce w macicy pod wp³ywem estra-diolu i progesteronu regulowane s¹ za porednictwem receptorów estrogenowych (ER) oraz receptorów pro-gesteronowych (PR) pe³ni¹cych rolê aktywatorów trans-krypcji genów bia³ek. Receptory NR3A1 i NR3A2 dla estrogenów kodowane s¹ na dwóch ró¿nych genach i znane jako ERa i ERb (21). Struktura obu typów ER jest bardzo zbli¿ona i oba wi¹¿¹ estradiol z podobnym powinowactwem, jednak ich aktywnoæ transkrypcyjna nie jest jednakowa (16, 27). Receptory dla progestero-nu kodowane s¹ na jednym genie, ale jego transkrypcja
Zmiany receptorów steroidowych macicy
po antykoncepcji estrogenowej u suk*
)
PIOTR JURKA, MAREK SNOCHOWSKI*, ZDZIS£AW BORYCZKO
Zak³ad Rozrodu, Andrologii i Biotechnologii Rozrodu Zwierz¹t Katedry Nauk Klinicznych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej SGGW, ul. Nowoursynowska 159 C, 02-766 Warszawa
*Instytut Fizjologii i ¯ywienia Zwierz¹t PAN, ul. Instytucka 3, 05-110 Jab³onna Jurka P., Snochowski M., Boryczko Z.
Changes in uterine steroid receptors after estrogen contraception in bitches Summary
The aim of the present study was to evaluate the effect of estradiol benzoate (EB) treatment on estradiol (E2) and progesterone (P4) in blood, and on estrogen (ER) and progesterone (PR) receptors in the uteri of mixed breed bitches. Injections of 10 µg EB/kg (Mesalin, Intervet) and 100 µg EB/kg (Oestradiolum benzoicum, Polfa) were given on day 3 and 5 after the first acceptance of males. Steroids were measured in samples collected from the vena cephalic using the immunofluorescent method. The average level of E2 was elevated to 190 and 260 pg/ml, respectively, and declined to control values within less than 12 days. An increase in P4 was observed only during the first 4 days. ER and PR were determined in uterine samples collected during hysterectomy performed on day 14 or 28 following the first EB injection. The radioligand assay was used for soluble (100.000 g cytosol) and structural (0.6 M NaCl extract) fractions. Typical binding characteristics for ER and PR were found in all analyzed samples. The amount of ER was unchanged over time in the untreated group, while PR significantly declined. The lower dose caused a 3-fold elevation of ER and PR (mainly soluble fractions) which on day 28 declined to control values with the exception of an uncompleted decline of soluble ER. The effect of higher doses on ER was only significant in its soluble fraction on day 14. However its influence on the PR (initially unchanged) occurred on day 28 and was elevated more than 10-times (mainly structural fraction). The results obtained indicate that uterine ER and PR responded differently to high and low doses of estrogen treatment.
Keywords: bitch, contraception, estradiol benzoate
mo¿e byæ inicjowana za porednictwem dwóch ró¿nych promotorów odpowiedzialnych za syntezê form ró¿ni¹-cych siê d³ugoci¹ N-koñcowego ³añcucha aminokwa-sów receptorów PR-A i PR-B (29).
Receptory ER i PR mog¹ pe³niæ rolê regulacyjn¹ w wielu miejscach komórki. Sygna³y hormonalne mog¹ byæ odbierane przez receptor znajduj¹cy siê na mem-branie cytoplazmatycznej, w cytozolu, w j¹drze komór-kowym jak równie¿ w mitochondriach (20). Dynamicz-nie zachodz¹ce zmiany lokalizacji wewn¹trzkomór-kowej receptorów s¹ precyzyjnie sterowane poprzez zawarte w ich strukturach tzw. miejsca sygna³owe loka-lizacji j¹drowej odpowiedzialne za ich eksport i import z przestrzeni j¹drowej (22, 30). W tkankach macicy ilociowo dominuj¹ receptory ERa i PR-B, ale dystry-bucja i ekspresja lub koekspresja innych form mo¿e mieæ zasadnicze znaczenie dla indukcji aktywnoci specyficz-nych typów komórek.
Tak zró¿nicowane w³aciwoci obu receptorów po-woduj¹ brak jednej, uniwersalnej metody ich pomiaru. Metody oparte o analizê mRNA lub detekcjê bia³ka re-ceptorowego przeciwcia³em informuj¹ o aktywnoci genów koduj¹cych receptor czy te¿ obecnoci bia³ka okrelonego typu (izoformy) receptora i ka¿da z nich niesie nieco inn¹ informacje. Natomiast technika radio-ligandu umo¿liwia ilociowe oszacowanie aktywnoci wszystkich form receptorów aktualnie zdolnych do re-akcji z hormonem (funkcjonalny receptor). Po³¹czenie jej z metodami biochemicznymi pozwala na wybiórczy pomiar frakcji receptorów znajduj¹cych siê w stanie wol-nym (cytoplazma, nukleoplazma) oraz frakcji zwi¹za-nej ze strukturami wewn¹trzkomórkowymi (24, 25). Sposób ten zosta³ zastosowany w niniejszej pracy, po-niewa¿ pozwala na ogóln¹ ocenê aktywnoci obu re-ceptorów w narz¹dach o zró¿nicowanej strukturze, do których nale¿y macica.
Dotychczas nie badano u suk wp³ywu estrogenów podawanych w koñcowym okresie rui na stan recepto-rów steroidowych macicy we wczesnej fazie porujowej (23). Wiadomo natomiast, ¿e zaburzenia hormonalne w tym okresie mog¹ mieæ ró¿ne niepo¿¹dane skutki z wyst¹pieniem ropomacicza w³¹cznie (15). Uzyskane wyniki stanowi¹ pierwszy opis zmian aktywnoci re-ceptorów macicy w okresie cyklu, który wydaje siê szczególnie istotny dla oceny przyczyn wystêpowania zmian klinicznych oraz poprawnoci stosowania estro-genów w celu zapobiegania niepo¿¹danej ci¹¿y.
Celem przeprowadzonych badañ by³o okrelenie wp³ywu estrogenów, aplikowanych w dwóch ró¿nych dawkach we wczesnej fazie porujowej na stê¿enia estradiolu i progesteronu w krwi oraz na aktywnoæ receptorów estrogenowego (ER) i progesteronowego (PR) macicy suk.
Materia³ i metody
Badania przeprowadzono na 30 sukach, mieszañcach w wieku od 1 do 3 lat (10-14 kg). Zwierzêta z fizjologicznym cyklem jajnikowym podzielono na grupê kontroln¹ (K; n = 6) oraz dwie grupy dowiadczalne po 12 suk, którym podano dwukrotnie benzoesan estradiolu. Pierwsza z nich (grupa M)
otrzyma³a dawkê 10 µg (Mesalin, Intervet), a druga (grupa O) 100 µg (Oestradiolum benzoicum, Polfa) na kilogram masy cia³a. Iniekcje wykonano domiêniowo w trzecim i pi¹tym dniu po wyst¹pieniu odruchu tolerancji. Próbki krwi pobiera-no w odstêpach 2-dniowych z ¿y³y odpromieniowej (v. ce-phalica), wirowano 15 min. przy 1500 g, a oddzielon¹ suro-wicê przechowywano w 20°C do czasu wykonania analiz hormonalnych.
Pomiary stê¿eñ progesteronu i estradiolu wykonano me-tod¹ immunofluorescencyjn¹ (TR-FIA) z wykorzystaniem komercyjnych zestawów Delfia Estradiol kit i Delfia Proge-sterone kit (Wallac Oy, Finland) po uprzedniej trzykrotnej eks-trakcji octanem etylu. Pomiar fluorescencji wykonano w apa-racie Delfia Fluorometer 1232, Wallac Oy, Finland. Wszyst-kie analizy wykonano w jednej serii w duplikatach. Wydaj-noæ ekstrakcji dla obu hormonów waha³a siê od 92% do 99%, a czu³oæ oznaczeñ i b³¹d wewn¹trzseryjny wynosi³y odpo-wiednio dla estradiolu 10 pg/ml (37 pmol/l) i 9,6%, a dla pro-gesteronu 0,25 ng/ml (0,8 nmol/l) i 8,0%.
Zabieg usuniêcia macicy i jajników wykonano u po³owy zwierz¹t z ka¿dej grupy w 17. dniu lub w 31. dniu po wyst¹-pieniu odruchu tolerancji, co odpowiada u grup dowiadczal-nych 14. lub 28. dniu po pierwszej iniekcji estradiolu. Do ba-dañ pobierano wycinki z po³owy d³ugoci obu rogów macicy, p³ukano w roztworze fizjologicznym, a po osuszeniu zmra¿a-no w ciek³ym azocie i przechowywazmra¿a-no w 80°C do czasu analizy. Czas od wyciêcia macicy do momentu zamro¿enia nie przekracza³ 3 minut. Ocenê aktywnoci receptorów wy-konano w 14. i 28. dniu po podaniu pierwszej dawki w odnie-sieniu do wartoci fizjologicznych oznaczonych w 17. i 31. dniu po wyst¹pieniu odruch tolerancji.
Pomiar receptorów, bia³ka cytozolowego oraz DNA wy-konano zgodnie z uprzednio opublikowan¹ procedur¹ (24, 25). Próbki tkanki macicy rozcierano w ciek³ym azocie, odwa-¿ano 1 g i zawieszano w 5 ml buforu (10 mM TRIS-HCl, 1,5 mM EDTA, 1 mM tioglikolanu sodu, 10 mM molibdenia-nu sodu, 10% glicerolu; pH 7,4). Frakcjê woln¹ receptorów przygotowywano w formie cytozolu po wirowaniu homoge-natu przy 100 000 g przez 60 min. w 4°C. Frakcjê zwi¹zan¹ otrzymywano po 60 min. inkubacji pozosta³ego osadu z do-datkiem 2,5 ml 0,6 M NaCl (4°C), dodaniu 2,5 ml buforu i ponownym wirowaniu przez 60 min. przy 100 000 g w 4°C. Porcje po 0,2 ml zawieraj¹ce 0,1 ml frakcji receptorowej inkubowano w duplikatach w obecnoci 6 ró¿nych stê¿eñ radioligandu od 0,08 do 2,6 nM (ER: 3H-17b-estradiol,
3,18 TBq/mmol, Amersham Pharmacia Biotech, UK; PR:
3H-promegeston, 3,2 TBq/mmol, New England Nuclear, USA)
w ci¹gu 20 godz. w 4°C. Wolne steroidy oddzielano metod¹ adsorpcji na wêglu aktywowanym, a pomiar radioaktywnoci wykonano w liczniku scyntylacji ciek³ej (Beckman LC 6000 TA). Wielkoæ wi¹zania niespecyficznego oznaczano w rów-noleg³ych inkubatach zawieraj¹cych 200-krotny nadmiar di-etylstilbestrolu (ER) lub nieznakowanego promegestonu (PR). Maksymaln¹ iloæ miejsc wi¹¿¹cych (Bmax) i pozorn¹ sta³¹ dysocjacji (Kd) wyznaczano wg Scatcharda po uprzedniej korekcie na wi¹zanie niespecyficzne. Wartoci wi¹zania frak-cji wolnej wyra¿ono w odniesieniu do zawartego w niej bia³-ka, a frakcji strukturalnej do iloci DNA oznaczonego w osa-dzie. Ca³kowit¹ zawartoæ receptorów wyznaczano jako sumê obu frakcji w odniesieniu do masy wie¿ej tkanki. W celu bezporedniego porównania zawartoci receptorów w po-szczególnych frakcjach wyniki przedstawiono w postaci red-niej iloci cz¹steczek receptora w komórce, mno¿¹c przez
wspó³czynnik konwersji, który dla wartoci re-ceptora wyra¿onego w jednostkach (fmol/mg DNA) wynosi F = 3,7338 (25).
Istotnoæ ró¿nic pomiêdzy grupami okrelono przy pomocy programu komputerowego Statis-ticaTM PL, stosuj¹c test Kruskala-Wallisa oraz
U-test Mann-Whitneya na poziomie p £ 0,05.
Wyniki i omówienie
Zmiany stê¿eñ estradiolu i progesteronu w krwi obwodowej u suk kontrolnych ob-serwowane od pierwszego dnia po wyst¹pie-niu odruchu tolerancji mia³y typowy przebieg dla cyklu jajnikowego (6, 32, 33). W ci¹gu pierwszych 6 dni obserwowano spadek stê-¿enia estradiolu z oko³o 30 pg/ml do warto-ci ustalonych w pozosta³ym okresie na po-ziomie 18 ± 7 pg/ml. Natomiast stê¿enia pro-gesteronu by³y niskie w ci¹gu pierwszych 4 dni (oko³o 2 ng/ml), a nastêpnie stopnio-wo wzrasta³y, osi¹gaj¹c po 17. dniu sta³y,
wy-soki poziom (60-80 ng/ml), który utrzymywa³ siê do koñ-ca obserwacji (ryc. 1). Zwiêkszone pocz¹tkowo stê¿e-nia estradiolu przy niskich poziomach progesteronu oraz brak ró¿nic pomiêdzy grupami w okresie poprzedzaj¹-cym iniekcje estradiolu wskazuj¹, ¿e okres cyklu, w któ-rym rozpoczêto obserwacje by³ podobny u wszystkich zwierz¹t i odpowiada³ fazie pêcherzykowej (4, 8). Wy-sokie stê¿enia progesteronu w koñcowym okresie ob-serwacji by³y typowe dla fazy lutealnej trwaj¹cej u suk oko³o 75 dni (17).
Iniekcje estrogenu spowodowa³y podobne i propor-cjonalne do zastosowanej dawki zmiany stê¿eñ tego hormonu w krwi. Podanie niskiej dawki, 10 µg/kg, wy-wo³a³o bezporedni wzrost poziomu estradiolu, rednio do 190 pg/ml, który w okresie nastêpuj¹cych 6 dni wynosi³ 50-60 pg/ml, po czym do 12. dnia nastêpowa³ dalszy spadek do wartoci nieró¿ni¹cych siê od fizjolo-gicznie wystêpuj¹cych. Natomiast podanie dziesiêcio-krotnie wy¿szej dawki spowodowa³o gwa³towny wzrost poziomu estradiolu, rednio do 260 pg/ml, który sukce-sywnie mala³ w ci¹gu nastêpuj¹cych 6 dni, a dalszy prze-bieg zmian by³ zbli¿ony do poziomów obserwowanych w grupie traktowanej ni¿sz¹ dawk¹ (ryc. 1).
W czasie pierwszych czterech dni po iniekcji estro-genu stwierdzono podwy¿szony poziom progesteronu, jednak bez wp³ywu na jego dalszy wzrost i czas wyst¹-pienia maksymalnych stê¿eñ. Mo¿e to wskazywaæ na przejciowy efekt wzmo¿onej sekrecji progesteronu do krwi obwodowej. Efekt podania estradiolu na stê¿enia obu hormonów w krwi zanika³ po 12 dniach od iniek-cji, niezale¿nie od stosowanej dawki. Wynika z tego, i¿ podanie zarówno niskiej, jak i wysokiej dawki estroge-nu spowodowa³o wyst¹pienie stê¿eñ estradiolu (przez okres 6 dni) znacznie przekraczaj¹cych wartoci szczy-towe w okresie poprzedzaj¹cym owulacjê (5, 17). Zrów-nanie obwodowych stê¿eñ obu hormonów we wszyst-kich badanych grupach nast¹pi³o po 15. dniu od wyst¹-pienia odruchu tolerancji i nie podlega³y one znacz¹-cym zmianom do koñca obserwacji. St¹d mo¿na
stwier-dziæ, i¿ w okresach, kiedy by³y pobierane wycinki ma-cicy do analizy receptorów, rednie stê¿enie hormonów we krwi by³o podobne u wszystkich zwierz¹t i wynosi-³o dla estradiolu 21 ± 8 pg/ml, a dla progesteronu 68 ± 8 ng/ml.
Analiza receptorów wykaza³a obecnoæ miejsc wi¹-¿¹cych typowych dla ER i PR we wszystkich badanych próbach. Wartoci sta³ej dysocjacji by³y podobne we wszystkich oznaczanych preparatach i by³y ni¿sze dla ER (1,14 ± 0,20 nmol/l) ani¿eli dla PR (1,81 ± 0,55 nmol/l). Wyj¹tek stanowi³y wy¿sze wartoci Kd dla PR oznaczone w próbach pobranych w 28. dniu po pierw-szej iniekcji 100 µg/kg (grupa O) zarówno dla frakcji wolnej (3,82 ± 0,61 nmol/l), jak i strukturalnej (3,33 ± 0,81 nmol/l). Podobny wzrost wartoci Kd (do 6 nmol/l) wystêpuje podczas szczytowych stê¿eñ tego receptora w pierwszych dniach cyklu owulacyjnego (12).
Uzyskane wyniki ilociowe pomiarów ER i PR przed-stawiono w jednostkach charakterystycznych dla frak-cji, a ich sumy jako ca³kowit¹ zawartoæ w gramie tkan-ki (tab. 1). Dane pozwalaj¹ce na bezporednie porów-nanie iloci receptora frakcji wolnej i strukturalnej wy-ra¿ono w postaci redniej iloci cz¹steczek receptora w komórce (ryc. 2). U suk z grupy kontrolnej ca³kowita iloæ ER, jak równie¿ zawartoæ w poszczególnych frak-cjach nie podlega³a znacz¹cym zmianom w czasie. War-toci rednie liczone z obu okresów ³¹cznie wynosi³y dla frakcji wolnej 53 ± 14 fmol/mg bia³ka cytozolowe-go, dla strukturalnej 823 ± 324 fmol/mg DNA, a ich sumaryczna zawartoæ w tkance 5,97 ± 2,18 pmol/g. Analogicznie okrelona rednia zawartoæ cz¹steczek ER w komórce wynios³a 5500 ± 2100, w której niezna-cz¹c¹ wiêkszoæ stanowi³a frakcja strukturalna (55% i 57%). Iloci ER i PR w pierwszym okresie by³y po-dobne, natomiast w drugim okresie obserwowano spa-dek ca³kowitego PR z 4500 ± 1050 do 1900 ± 1530 n/ komórkê z zachowaniem przewagi frakcji strukturalnej (67% i 65%). Obserwowane iloci obu receptorów s¹ charakterystyczne dla fazy lutealnej, w której u suk ER Ryc. 1. Zmiany stê¿eñ estradiolu (E) oraz progesteronu (P) we krwi obwo-dowej suk z fizjologicznym cyklu jajnikowym (K) oraz po iniekcji benzo-esanu estradiolu w dawce 10 µg/kg (M) lub 100 µg/kg (O) aplikowanej w 3. i 5. dniu (strza³ki) po wyst¹pieniu odruchu tolerancji
utrzymuje siê na niskich poziomach, a PR ulega sukce-sywnie zmniejszeniu pod wp³ywem wysokich stê¿eñ progesteronu w krwi (9, 12, 19).
Podanie niskiej dawki estrogenu (grupa M) spowo-dowa³o w 14. dniu po pierwszej iniekcji ponad 3-krot-ny wzrost ca³kowitej iloci ER oraz 4-krot3-krot-ny wzrost PR, osi¹gaj¹c poziom wartoci szczytowych wystêpuj¹cych w pierwszych dniach cyklu jajnikowego (9, 12, 19). Wzrost ten dotyczy³ g³ównie frakcji wolnej, udzia³ frak-cji strukturalnej ER zmala³ do 32%, a w przypadku PR nast¹pi³o zrównanie ilociowe obu frakcji. Wywo³ane zmiany prawie ca³kowicie zanik³y w drugim okresie obserwacji, ustalaj¹c siê na poziomach oznaczonych w grupie kontrolnej z wyj¹tkiem frakcji wolnej ER, któ-rej iloæ pomimo znacznego spadku, pozosta³a istotnie wy¿sza (ryc. 2).
Podanie wysokiej dawki estrogenu (grupa O) wywo-³a³o zaskakuj¹co niewielkie zmiany ER, powoduj¹c je-dynie w 14. dniu po iniekcji wzrost frakcji strukturalnej do wartoci obserwowanych w grupie M. Brak istot-nych zmian ca³kowitego ER wiadczy o procesie trans-lokacji, w wyniku której a¿ 72% cz¹steczek zosta³o zwi¹zanych ze strukturami komórkowymi. Natomiast zmiany PR stwierdzono jedynie w drugim okresie, któ-rego iloci pocz¹tkowo nieró¿ni¹ce siê od wystêpuj¹-cych fizjologicznie wzros³y do najwy¿szych zmierzo-nych, przewy¿szaj¹c niemal dwukrotnie iloci obserwo-wane w 14. dniu po podaniu niskiej dawki estradiolu. Wartoci te wskazuj¹ na brak hamuj¹cego wp³ywu wy-sokich stê¿eñ obwodowych progesteronu (down regu-lation), a iloci ca³kowitego PR odpowiada³y wartoci 28 pmol/g okrelonej dla koñcowej fazy rujowej (19).
Istotny jest równie¿ fakt, ¿e wzrost ten by³ do-minuj¹cy dla frakcji strukturalnej, zwiêkszaj¹c jej udzia³ procentowy do 81%.
Przedstawione dane stanowi¹ pierwszy opis zmian ER i PR macicy po zastosowaniu anty-koncepcji hormonalnej u suk. Uzyskane wyniki wykazuj¹ jednoznaczne zmiany aktywnoci obu receptorów. Jednak charakter obserwowanych zmian wskazuje na dwa jakociowo ró¿ne pro-cesy zale¿ne od zastosowanej dawki. Dwukrot-na iniekcja 10 µg/kg estrogenu spowodowa³a zmiany charakterystyczne dla wzmo¿onej ak-tywnoci ERa, który pod wp³ywem hormonu stymuluje ekspresje zarówno w³asnego genu, jak i genu koduj¹cego PR (16, 18, 20). Natomiast spadek iloci obu receptorów z czasem mo¿e byæ konsekwencj¹ dzia³ania hamuj¹cego PR na ekspresje w³asnego genu, jak i stymulowan¹ hormonem aktywnoæ ER (22). Analogicznie podana dawka 100 µg/kg spowodowa³a efekty wskazuj¹ce na antagonistyczne dzia³anie ERa i ERb, których równoczesna aktywacja hormo-nem prowadzi do zablokowania ekspresji ko-duj¹cych ich genów (16). Natomiast opóniony w czasie wzrost iloci PR mo¿e byæ zwi¹zany r o t p e c e r y n a d a B ) g k / g µ ( * u n e g o rt s e a k w a D 0 10 100 * * ij c a w r e s b o ñ e iz D 4 1 28 14 28 14 28 y w o n e g o rt s E y n l o W ) a k ³ a i b g m /l o m f( 50 a ) 4 1 ( 56 a ) 7 1 ( 352 b ) 1 6 1 ( 117 c b ) 1 4 ( 92 c ) 2 1 ( 55 a ) 9 ( y n l a r u t k u rt S ) A N D g m /l o m f( 856 a ) 3 6 1 ( 790 a ) 2 8 4 ( 1520 b ) 1 7 ( 818 a ) 2 6 2 ( 1430 b ) 7 4 8 ( 1050 a ) 2 7 2 ( y ti w o k ³ a C )i k n a k t g /l o m p ( 6,06 a ) 5 9 , 2 ( 5,88 a ) 9 7 , 1 ( 20,90 b ) 9 7 , 1 ( 8,17 a ) 8 4 , 2 ( 10,50 a ) 8 8 , 4 ( 5,64 a ) 4 7 , 2 ( y w o n o r e t s e g o r P y n l o W ) a k ³ a i b g m /l o m f( 28 a ) 9 ( 18 a ) 6 ( 257 b ) 1 4 1 ( 16 a ) 3 ( 50 a ) 7 1 ( 142 b ) 0 6 ( y n l a r u t k u rt S ) A N D g m /l o m f( 815 a ) 7 8 1 ( 331 b ) 0 9 ( 2160 c ) 0 1 6 1 ( 385 b ) 4 2 1 ( 982 a ) 1 4 1 ( 7060 c ) 0 3 1 1 ( y ti w o k ³ a C )i k n a k t g /l o m p ( 4,68 a ) 9 0 , 1 ( 2,16 b ) 7 1 , 0 ( 18,70 c ) 6 7 , 3 ( 2,03 b ) 6 1 , 0 ( 6,88 a ) 2 4 , 1 ( 28,90 d ) 3 7 , 6 (
Tab. 1. Wyniki pomiarów receptora estrogenowego i progesteronowe-go macicy suk po wyst¹pieniu spontanicznej rui oraz po podaniu dwóch ró¿nych dawek benzoesanu estradiolu (x ± SD)
Objanienia: * iniekcja i.m. benzoesanu estradiolu w 3. i 5. dniu po wyst¹-pieniu odruchu tolerancji; ** liczba dni po pierwszej iniekcji estrogenu. Ró¿ne oznaczenia literowe w wierszach wskazuj¹ istotne ró¿nice
wartoci rednich (p < 0,05)
Ryc. 2. Zmiany ilociowe frakcji wolnej i strukturalnej re-ceptora estrogenowego oraz progesteronowego macicy suk po podaniu dwóch ró¿nych dawek benzoesanu estradiolu sto-sowanych w celach antykoncepcyjnych. Wyniki pomiarów wy-konanych w tkankach pobranych w 14. i 28. dniu po pierw-szej iniekcji (patrz tab. 1) wyra¿ono w postaci redniej iloci cz¹steczek receptora w komórce. Istotnoæ ró¿nic wartoci rednich (p £ 0,05) zaznaczono dla grup, w których wyst¹pi-³y ró¿nice pomiêdzy frakcjami receptora w tkance (*) oraz dla ró¿nic pomiêdzy grupami szacowanymi oddzielnie dla frakcji wolnej (a) i strukturalnej (b)
z odblokowaniem jednego z trzech niezale¿nych pozna-nych szlaków dzia³ania estrogenów na PR w macicy (I) poprzez klasyczny ERa (II), poprzez ERb lub (III) tzw. mechaniczny z udzia³em progesteronu, który stymuluje ró¿nicowanie komórek doczesnowych w podcielisku (11, 18). Wyniki te wskazuj¹ jednoznacznie na brak proporcjonalnoci efektów do wielkoci stosowanej dawki, co pozwala na wysuniêcie hipotezy o istnieniu wartoci progowej dawki estrogenów, powy¿ej której nastêpuje zmiana w lokalnym systemie regulacji estro-genowej macicy.
Obecnie wiadomo, i¿ stosowanie estrogenów (szcze-gólnie w wysokich dawkach) mo¿e prowadziæ do przed-³u¿onego wystêpowania rui, ropomacicza, supresji szpi-ku kostnego i anemii aplastycznej. Z danych w pimien-nictwie wynika, ¿e ryzyko wystêpowania efektów ubocz-nych mo¿e byæ znacznie ograniczone w przypadku stosowania estrogenów w koñcowym okresie rui u suk (3, 26). Wyniki ostatnio przeprowadzonych badañ po-pulacyjnych u ludzi wskazuj¹, i¿ stosowanie estroge-nów w okresie naturalnie wystêpuj¹cych ich zwiêkszo-nych stê¿eñ, nie powoduje zmian nowotworowych i jest bardziej bezpieczne ani¿eli podawanie w kombinacji z progestagenami (10). Przyjmuj¹c wzmo¿on¹ aktyw-noæ ER za wskanik zagro¿enia nowotworowego, to uzyskane wyniki pozwalaj¹ na stwierdzenie, ¿e zasto-sowanie wysokiej dawki (100 µg/kg) jest stosunkowo bezpieczne. Wskazuj¹ na to równie¿ wyniki opisanej przez nas oceny histopatologicznej, z której wynika, i¿ dawka ta powoduje ca³kowity zanik figur mitotycznych komórek nab³onka gruczo³owego macicy (14). Brak jest jednak danych odnonie do implikacji klinicznych za-obserwowanego znacznego wzrostu PR, który zlokali-zowany g³ównie we frakcji strukturalnej jest chroniony przed degradacj¹ (2). Nie jest jednak wykluczone, i¿ sto-sowanie niskich dawek mo¿e byæ równie bezpieczne, poniewa¿ wysokie wartoci ER znacz¹co malej¹ w okre-sie pomiêdzy 14. a 28. dniem po aplikacji estrogenu, a iloæ PR ustala siê na poziomach wystêpuj¹cych fiz-jologicznie.
Podsumowuj¹c, mo¿na stwierdziæ zró¿nicowane jakociowo dzia³anie niskich i wysokich dawek estro-genów na aktywnoæ receptorów estrogenowych i pro-gesteronowych w macicy. Aby estrogeny mog³y byæ wykorzystane jako bezpieczny rodek zapobiegania nie-po¿¹danej ci¹¿y u suk, konieczne jednak s¹ dalsze badania nad mechanizmem ich dzia³ania oraz ustalenie minimalnej i efektywnej dawki.
Pimiennictwo
1.Boryczko Z., Katkiewicz M., Bostedt H., Gajewski Z.: Ropomacicze u suk etiopatogeneza, objawy, rozpoznawanie i leczenie. Medycyna Wet. 2001, 57, 246--250.
2.Botos J., Xian W., Smith D. F., Smith C. L.: Progesterone receptor deficient in chromatin binding has an altered cellular state. J. Biol. Chem. 2004, 279, 15231--15239.
3.Bowen R. A., Olson P. N., Behrendt M. D., Wheeler S. L., Husted W., Nett T. M.: Efficacy and toxicity of estrogens commonly used to terminate canine pregnancy. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1985, 186, 783-788.
4.Concannon P. W., McCann J. P., Temple M.: Biology and endocrinology of ovula-tion, pregnancy and parturition in the dog. J. Reprod. Fertil. Suppl. 1989, 39, 3-25. 5.Concannon P. W., Meyers-Wallen V. N.: Current and proposed methods for contra-ception and termination of pregnancy in dogs and cats. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1991, 198, 1214-1225.
6.Edqvist L. E., Johansson E. D., Kasstrom H., Olsson S. E., Richkind M.: Blood plasma levels of progesterone and oestradiol in the dog during the oestrous cycle and pregnancy. Acta Endocrinol. (Copenh) 1975, 78, 554-564.
7.Eilts B. E.: Pregnancy termination in the bitch and queen. Clin. Tech. Small Anim. Pract. 2002, 17, 116-123.
8.England G., Concannon P. W.: Determination of the optimal breeding time in the bitch: Basic considerations, [w:] Concannon P. W., England G., Verstegen III J., Linde-Forsberg C. (wyd.): Recent Advances in Small Animal Reproduction. International Veterinary Information Service, Ithaca NY 2002.
9.Fernandes P. A., Bowen R. A., Sawyer H. R., Nett T. M., Gorell T. A.: Concentra-tion of receptors for estradiol and progesterone in canine endometrium during estrus and diestrus. Am. J. Vet. Res. 1989, 50, 64-67.
10.Gadducci A., Biglia N., Sismondi P., Genazzani A. R.: Breast cancer and sex ste-roids: Critical review of epidemiological, experimental and clinical investigations on etiopathogenesis, chemoprevention and endocrine treatment of breast cancer. Gynecol. Endocrinol. 2005, 20, 343-360.
11.Grümmer R., Hewitt S. W., Traub O., Korach K. S., Winterhager E.: Different regulatory pathways of endometrial connexin expression: preimplantation hormonal-mediated pathway versus embryo implantation-initiated pathway. Biol. Reprod. 2004, 71, 273-281.
12.Johnston S. D., Kiang D. T., Seguin B. E., Hegstad R. L.: Cytoplasmic estrogen and progesterone receptors in canine endometrium during the estrous cycle. Am. J. Vet. Res. 1985, 46, 1653-1658.
13.Jurka P.: Ocena zmian zachodz¹cych w macicy i jajnikach po stosowaniu stero-idowych preparatów antykoncepcyjnych u suk. Praca doktorska, SGGW, Warsza-wa 1999.
14.Jurka P., Snochowski M., Boryczko Z.: Wp³yw dawki estrogenu na zmiany morfo-logiczne jajnika i macicy u suk. Medycyna Wet. 2007, w druku.
15.Karczewski W., Ostrzeszewicz G., Nagajewski M.: Analiza czynników usposabia-j¹cych do wystêpowania ropomacicza oraz wyników leczenia operacyjnego tego schorzenia Medycyna Wet. 1984, 4, 487-488.
16.Koehler K. F., Helguero L. A., Haldosén L. A., Warner M., Gustafsson J. A.: Reflections on the discovery and significance of estrogen receptor b. Endocr. Rev. 2005, 26, 465-478.
17.Kooistra H. S., den Hertog E., Okkens A. C., Mol J. A., Rijnberk A.: Pulsatile secretion pattern of growth hormone during the luteal phase and mid-anoestrus in beagle bitches. J. Reprod. Fertil. 2000, 119, 217-222.
18.Kurita T., Lee K. J., Saunders P. T. K., Cooke P. S., Taylor J. A., Lubahn D. B., Zhao C., Mäkelä S., Gustafsson J. A., Dahiya R., Cunha G. R.: Regulation of progesterone receptors and decidualization in uterine stroma of the estrogen receptor-a knockout mouse. Biol. Reprod. 2001, 64, 272-283.
19.Lessey B. A., Gorell T. A.: A cytoplasmic estradiol receptor in the immature Beagle uterus. J. Steroid. Biochem. 1980, 13, 211-217.
20.Levin E. R.: Integration of the extranuclear and nuclear actions of estrogen. Mol. Endocrinol. 2001, 19, 1951-1959.
21.Nuclear Receptors. Nomenclature Committee. Cell 1999, 97, 161-163. 22.Qiu M., Olsen A., Faivre E., Horwitz K. B., Lange C. A.: Mitogen-activated
pro-tein kinase regulates nuclear association of human pogesterone receptors. Mol. Endocrinol. 2003, 17, 628-642.
23.Reynaud K., Fontbonne A., Marseloo N., Thoumire S., Chebrout M., de Lesegno C. V., Chastant-Maillard S.: In vivo meiotic resumption, fertilization and early embryonic development in the bitch. Reproduction 2005, 130, 193-201. 24.Snochowski M.: Receptory tkankowe. Metody radioimmunologiczne i
radiokom-petycyjne stosowane w klinice (Red. Kokot F., Stupnicki R.) PZWL, Warszawa 1985, 3, 55-66.
25.Snochowski M., Romanowicz K.: The use of estrogen receptor for evaluation of phytoestrogens activities in mammals. Pol. J. Food Nutr. Sci. 2003, 51, 175-187. 26.Sutton D. J., Geary M. R., Bergman J. G.: Prevention of pregnancy in bitches following unwanted mating: a clinical trial using low dose oestradiol benzoate. J. Reprod. Fertil. Suppl. 1997, 51, 239-243.
27.Tata J. R.: One hundred years of hormones: A new name sparked multidiscipli-nary research in endocrinology, which shed light on chemical communication in multicellular organisms. EMBO Rep. 2005, 6, 490-496.
28.Tsutsui T., Mizutani W., Hori T., Oishi K., Sugi Y., Kawakami E.: Estradiol ben-zoate for preventing pregnancy in mismated dogs. Theriogenology 2006, 66, 1568--1572.
29.Turgeon J. L., McDonnell D. P., Martin K. A., Wise P. M.: Hormone therapy: physiological complexity belies therapeutic simplicity. Science 2004, 304, 1269--1273.
30.Tyagi R. K., Amazit L., Lescop P., Milgrom E., Guiochon-Mantel A.: Mechanisms of progesterone receptor export from nuclei: role of nuclear localization signal, nuclear export signal, and Ran guanosine triphosphate. Mol. Endocrinol. 1998, 12, 1684-1695.
31.Wanke M. M., Romagnoli S., Verstegen J., Concannon P. W.: Pharmacological approaches to pregnancy termination in dogs and cats including the use of prosta-glandins, dopamine agonists, and dexamethasone, [w:] Concannon P. W., England G., Verstegen J., Linde-Forsberg C. (wyd.): Recent Advances in Small Animal Reproduction. Ithaca 2002.
32.Weilenmann R., Arnold S., Dobeli M., Rusch P., Zerobin K.: Estradiol and proge-sterone concentrations in the plasma of nonpregnant bitches during the sexual cycle. Schweiz Arch. Tierheilkd. 1993, 135, 51-57.
33.Weng B. C., Chew B. P., Wong T. S., Park J. S., Kim H. W., Lepine A. J.: Beta-carotene uptake and changes in ovarian steroids and uterine proteins during the estrous cycle in the canine. J. Anim. Sci. 2000, 78, 1284-1290.
Adres autora: dr Piotr Jurka, ul. Nowoursynowska 159 C, 02-766 War-szawa; e-mail: piotr_jurka@sggw.pl
