Praca oryginalna Original paper
Wród chemicznych zanieczyszczeñ rodowiska sta-nowi¹cych powa¿ne zagro¿enie dla zdrowia ludzi i zwierz¹t szczególne miejsce zajmuje kadm (Cd+2).
Ten powszechnie wystêpuj¹cy w rodowisku metal ciê¿ki, jest obecny w powietrzu, glebie, wodzie oraz w tkankach rolin i zwierz¹t (13). W organizmie ludzi i zwierz¹t kadm kumuluje siê w przede wszystkim w nerkach i w¹trobie (15). Narz¹dami nara¿onymi na dzia³anie tego metalu s¹ równie¿: p³uca, koci i uk³ad immunologiczny (5). Kadm jest pierwiastkiem o udo-wodnionym dzia³aniu nefrotoksycznym, hepatotok-sycznym i neurotokhepatotok-sycznym oraz dzia³aniu odleg³ym: mutagennym i kancerogennym. Zalicza siê go do czyn-ników rodowiskowych o dzia³aniu rakotwórczym dla ludzi (kategoria A1) (1). Ekspozycja na dzia³anie kad-mu prowadzi do indukcji nowotworów nerek, trzust-ki, p³uc i prostaty (29, 30).
Wielokierunkowy charakter toksycznego dzia³ania kadmu na organizm wynika z jego interakcji z cyn-kiem (Zn), miedzi¹ (Cu) ¿elazem (Fe) i selenem (Se) polegaj¹cej, miêdzy innymi, na wzajemnym wypiera-niu siê z kompleksów z metalotionein¹ oraz z
wi¹za-nia siê z reaktywnymi grupami funkcyjnymi wa¿nych biologicznie makrocz¹steczek (np. -SH, -OH, -COOH, NH2, -PO3H2, w których atomy N i O s¹ donorami elek-tronów) (20). Dzia³anie kadmu mo¿e prowadziæ do zaburzenia czynnoci narz¹dów i uk³adów organizmu. Mimo intensywnych badañ mechanizm toksycznego dzia³ania kadmu na organizmy ¿ywe nie zosta³ do koñ-ca poznany. Obecny stan wiedzy wskazuje, ¿e toksycz-ne dzia³anie kadmu na komórki organizmu mo¿e byæ wynikiem ró¿nych mechanizmów. Jednym z nich mo¿e byæ zaburzenie w komórkach homeostazy oksyda-cyjno-redukcyjnej, czego konsekwencj¹ jest indukcja stresu oksydacyjnego, os³abienie systemu antyoksyda-cyjnego i utrata integralnoci b³on komórkowych (21, 25, 27).
Bior¹c po uwagê fakt, i¿ w¹troba obok nerek jest organem nara¿onym zarówno na kumulacjê, jak i tok-syczne dzia³anie kadmu, podjêto badania maj¹ce na celu okrelenie wp³ywu tego metalu na aktywnoæ en-zymów antyoksydacyjnych w izolowanych hepatocy-tach szczura. Do realizacji badañ wykorzystano izolo-wane hepatocyty szczura jako alternatywny model
ba-Wp³yw kadmu na aktywnoæ
enzymów antyoksydacyjnych
w izolowanych hepatocytach szczura
HANNA CZECZOT, DOROTA CIBIOR-BENTKOWSKA, MICHA£ SKRZYCKI, MA£GORZATA PODSIAD, WOJCIECH KARLIK*, ADAM B¥KA£A*,
DANUTA GRONO*, MARIA WIECHETEK*
Katedra i Zak³ad Biochemii I Wydzia³u Lekarskiego Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego, ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa
*Zak³ad Farmakologii i Toksykologii Katedry Nauk Przedklinicznych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej SGGW, ul. Nowoursynowska 166, 02-787 Warszawa
Czeczot H., cibior-Bentkowska D., Skrzycki M., Podsiad M., Karlik W., B¹ka³a A., Grono D., Wiechetek M.
Effect of cadmium on the activity of antioxidant enzymes in isolated rat hepatocytes Summary
The aim of the study was to evaluate the effect of cadmium on the antioxidant enzyme activity in rat hepatocytes. The experiments were conducted on isolated rat hepatocytes, which were incubated for two hours in modified Williams E medium (MWE) with 25, 50, and 200 µM cadmium chloride (CdCl2). Hepato-cytes incubated in MWE medium without cadmium chloride were used as a control. The activity of anti-oxidant enzymes superoxide dismutases (SOD1 and SOD2), catalase (CAT), total glutathione peroxidase (tot. GSHPx), selenium-dependent glutathione peroxidase (Se-GSHPx), glutathione S-transferase (GST) and glutathione reductase (GSHR) - and the values of the studied oxidative stress markers the concentration of tiobarbituric-acid-reacting substances (TBARS) and reduced glutathione (GSH) indicate that cadmium induces oxidative stress in rat hepatocytes, which impairs antioxidative mechanisms.
dawczy in vitro, uznany powszechnie za odpowiedni do badania metabolizmu ksenobiotyków oraz dzia³a-nia hepatotoksycznego i ogólnego dzia³adzia³a-nia cytotok-sycznego.
Materia³ i metody
Do badañ wykorzystano szczury szczepu Wistar (sam-ce) o masie cia³a 200-250 g.
W czasie kwarantanny (2 tygodnie) i przed samym ekspe-rymentem zwierzêta mia³y wolny dostêp do wody i karmy. Izolowanie i inkubacja hepatocytów z chlorkiem kad-mu (CdCl2). Hepatocyty izolowano z w¹trób szczurów zgodnie z protoko³em INVITTOX Nr 20 obejmuj¹cym: wy-konanie zabiegu chirurgicznego, przeprowadzenie dwustop-niowej perfuzji w¹troby, otrzymanie zawiesiny izolowanych hepatocytów oraz jej jakociowa i ilociowa ocena. Do badañ wykorzystano komórki, których prze¿ywalnoæ ozna-czana testem wychwytu b³êkitu trypanu (28) przekracza³a 85%. Izolowane hepatocyty (1 × 106 ¿ywych komórek/ml)
inkubowano przez 2 godziny w modyfikowanym (pozba-wionym fosforanów i wêglanów) medium WilliamsE (MWE) o pH 7,35 w obecnoci chlorku kadmu w stê¿e-niach: 25, 50 i 200 µM. Uk³ad kontrolny stanowi³y hepato-cyty inkubowane w hodowlanym medium MWE bez do-datku chlorku kadmu. Inkubacjê hepatocytów przeprowa-dzano w kolbkach Erlenmayera w ³ani wodnej (Hermle--Labortechnik, Niemcy) o temperaturze 38°C, ze sta³ym wytrz¹saniem (100 cykli na minutê). Podczas inkubacji zawiesinê hepatocytów wysycano karbogenem (5% CO2 + 95% O2). Próbki do analiz pobierano w momencie roz-poczêcia oraz po 1. i 2. godzinie inkubacji. Wykonano 3 od-dzielne dowiadczenia.
Izolowanie i inkubacjê hepatocytów z chlorkiem kadmu przeprowadzono w Zak³adzie Farmakologii i Toksykologii SGGW. Na wykonanie badañ uzyskano zgodê III Lokalnej Komisji Etycznej ds. Dowiadczeñ na Zwierzêtach przy SGGW w Warszawie (Nr 16/2006).
Badania biochemiczne. Przed i po 1- i 2-godzinnej in-kubacji w zawiesinie hepatocytów oznaczono aktywnoæ enzymów antyoksydacyjnych: dysmutazy ponadtlenkowej (SOD1 i SOD2), katalazy (CAT), ca³kowitej peroksydazy glutationowej (ca³. GSHPx), selenozale¿nej peroksydazy glutationowej (SeGSHPx), transferazy glutationowej (GST) i reduktazy glutationowej (GSHR) oraz markery stresu oksydacyjnego: stê¿enie zwi¹zków reaguj¹cych z kwasem tiobarbiturowym (TBARS), które okrela poziom perok-sydacji lipidów i stê¿enie zredukowanego glutationu (GSH). Ponadto oznaczano stê¿enie bia³ka ca³kowitego w hepato-cytach. Wszystkie oznaczenia wykonano Katedrze i Zak³a-dzie Biochemii WUM.
Oznaczanie aktywnoci enzymów antyoksydacyj-nych. Aktywnoæ miedziowo-cynkowej dysmutazy ponad-tlenkowej (CuZnSOD; SOD1) (EC 1.15.1.1) oznaczano za pomoc¹ zestawu RANSOD firmy RANDOX (Wielka Bry-tania). W metodzie tej w reakcji ksantyny z oksydaz¹ ksan-tynow¹ powstaje anionorodnik ponadtlenkowy, który re-dukuje chlorek 2-(4-jodofenylo)-3(4-nitrofenylo)-5-5 feny-lotetrazylu (INT), tworz¹c barwny formazan. Aktywnoæ manganowej dysmutazy ponadtlenkowej (MnSOD; SOD2)
(EC 1.15.1.1) oznaczano wg metody Beauchamp i Frido-vich (3), zmodyfikowanej przez Oberleya i Spitza (16). Powstaj¹cy w reakcji ksantyny z oksydaz¹ ksantynow¹ anionorodnik ponadtlenkowy redukuje chlorek b³êkitu ni-trotetrazolowego NBT (chlorek 2,2-di-p-nitrofenylo-5,5--difenylo-3,3-[3,3-dimetoxy-4,4difenyleno]-ditetrazolu), tworz¹c barwny kompleks. Aktywnoæ katalazy (CAT) (EC 1.11.1.6) oznaczano wg Goth (10). Metoda polega na po-miarze szybkoci rozk³adu nadtlenku wodoru. Ca³kowita aktywnoæ peroksydazy glutationowej (ca³. GSHPx) (EC 1.11.1.9) oznaczano wg metody Wendel (32). W metodzie tej GSHPx katalizuje utlenianie GSH przy udziale nadtlen-ku nadtlen-kumenu. Aktywnoæ selenozale¿nej peroksydazy gluta-tionowej (Se-GSHPx) (EC 1.11.1.9) oznaczano na podsta-wie metody opisanej przez Wendel (32) oraz Paglia i Va-lentine (18). W metodzie tej Se-GSHPx katalizuje utlenia-nie GSH przy udziale nadtlenku wodoru. Aktywnoæ trans-ferazy glutationowej (GST) (EC 2.5.1.18) oznaczano wg metody Habig i wsp. (11), stosuj¹c jako substrat 1-chloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB). Aktywnoæ reduktazy glutatio-nowej (GSHR) (EC 1.6.4.2) oznaczano wed³ug metody opisanej przez Goldberg i Spooner (9). Jako substratu u¿y-to utlenionego glutationu (GSSG).
Oznaczenia markerów stresu oksydacyjnego. Poziom peroksydacji lipidów oznaczano wg metody Ohkawa i wsp. (17). Metoda polega na oznaczeniu stê¿enia substancji re-aguj¹cych z kwasem tiobarbiturowym (TBARS) dialde-hydu malonowego (MDA) i innych wtórnych produktów peroksydacji lipidów. Stê¿enie zredukowanego glutationu (GSH) oznaczano na podstawie metody opracowanej przez Ellman (7), Sedlak i Lindsay (23). Metoda ta oparta jest na tworzeniu barwnego produktu, który powstaje w reakcji GSH z kwasem 5,5-ditio-bis-nitrobenzenowym (DTNB). Stê¿enie bia³ka oznaczano zgodnie z metod¹ Bradford (4). Aktywnoæ badanych enzymów wyra¿ono w U/mg bia³-ka. Stê¿enie GSH i TBARS wyra¿ono odpowiednio w µmol/ mg bia³ka i nmol/mg bia³ka. Wszystkie wyniki przedsta-wiono jako rednie arytmetyczne z trzech niezale¿nych dowiadczeñ ± SD. Analizê statystyczn¹ uzyskanych wy-ników przeprowadzono wykorzystuj¹c testy analizy warian-cji (ANOVA). Istotnoæ ró¿nic oznaczono testem t-Studenta. Ró¿nice miêdzy rednimi arytmetycznymi przyjêto za istot-ne statystycznie przy p £ 0,05.
Wyniki i omówienie
Zmiany w poziomie markerów stresu oksydacyj-nego. Ekspozycja izolowanych hepatocytów szczura na chlorek kadmu (25, 50 i 200 µM) doprowadza³a do podwy¿szenia poziomu peroksydacji lipidów ocenia-nego na podstawie stê¿enia TBARS (ryc. 1). Stopieñ wzrostu stê¿enia TBARS zale¿a³ zarówno od czasu ekspozycji komórek na kadm, jak i od stê¿enia kad-mu. W przypadku hepatocytów inkubowanych w obec-noci kadmu przez 1 godzinê istotne podwy¿szenie po-ziomu peroksydacji lipidów (w porównaniu do stwier-dzonego w hepatocytach kontrolnych) obserwowano jedynie w komórkach eksponowanych na chlorek kad-mu w stê¿eniu 200 µM (ryc. 1). D³u¿sze (dwugodzin-ne) nara¿enie hepatocytów na chlorek kadmu
dopro-wadza³o do wyranego wzrostu stê¿enia TBARS w ko-mórkach; istotny, w porównaniu do
hepatocytów kontrolnych, wzrost stê¿enia TBARS stwierdzano ju¿ w hepatocytach eksponowanych na chlorek kadmu w najni¿szym (25 µM) stosowanym w dowiad-czeniu stê¿eniu (ryc. 1). Jednocze-nie stwierdzony w tych warunkach poziom peroksydacji lipidów by³ istotnie wy¿szy od obserwowanego w komórkach poddanych 1-godzin-nej ekspozycji na chlorek kadmu w stê¿eniu 25 µM. Ekspozycja he-patocytów na kadm w wy¿szych (50 i 200 µM) stê¿eniach doprowa-dza³a do dalszego wzrostu poziomu peroksydacji lipidów; najwy¿sze stê¿enie TBARS obserwowano w he-patocytach inkubowanych przez 2 godziny w obecnoci chlorku kad-mu w stê¿eniu 200 µM (ryc. 1).
Ekspozycja hepatocytów na chlo-rek kadmu doprowadza³a równie¿ do wyranego wzrostu stê¿enia zredukowanego glutationu (GSH) w komórkach (ryc. 2). Statystycz-nie istotny wzrost stê¿enia GSH
(w porównaniu z uk³adem kontrolnym) stwierdza-no ju¿ podczas inkubacji hepatocytów w obec-noci kadmu w najni¿szym stosowanym w do-wiadczeniu stê¿eniu (25 µM). Ekspozycja hepa-tocytów na kadm w wy¿szych stê¿eniach (50 i 200 µM) prowadzi³a do dalszego wzrostu stê¿enia GSH, przy czym stê¿enie GSH w hepatocytach nara¿onych na dzia³anie chlorku kadmu przez 2 godziny by³o ni¿sze od obserwowanego po jed-nogodzinnej ekspozycji komórek na ten metal (ryc. 2). Statystycznie istotne ró¿nice stwierdza-no w przypadku hepatocytów ekspostwierdza-nowanych na kadm w stê¿eniu 200 µM; stê¿enie GSH w hepa-tocytach poddanych dwugodzinnej ekspozycji by³o o 26,3% ni¿sze od stwierdzonego po jedno-godzinnym nara¿eniu komórek na kadm (ryc. 2). Zmiany aktywnoci enzymów antyoksyda-cyjnych. Aktywnoæ enzymów antyoksydacyj-nych przedstawiono w tab. 1. Statystycznie istot-ny wzrost aktywnoci SOD1 i SOD2 w hepato-cytach (w porównaniu z uk³adem kontrolnym) stwierdzono w komórkach eksponowanych przez jedn¹ lub dwie godziny na kadm w stê¿eniu 50 i 200 µM. Najwy¿sz¹ aktywnoæ obu izoenzymów SOD stwierdzono w hepatocytach eksponowa-nych na chlorek kadmu w stê¿eniu 200 µM. Zna-mienne ró¿nice aktywnoci enzymów, zale¿ne od czasu ekspozycji komórek na kadm stwierdzono tylko w odniesieniu do aktywnoci SOD1 i jedy-nie w przypadku nara¿enia komórek na kadm w stê¿eniu 200 µM (tab. 1).
Ryc. 2. Wp³yw chlorku kadmu na stê¿enie GSH w izolowanych he-patocytach szczura
Objanienia: jak w tab. 1
Ryc. 1. Wp³yw chlorku kadmu na poziom peroksydacji lipidów w izo-lowanych hepatocytach szczura
Objanienia: jak w tab. 1
0 0,5 1 1,5 2 2,5 Stê¿enie kadmu (µM) Stê¿enie TBARS (nM/mg bia³ka) 0 25 50 200 1 h 2 h 0 5 10 15 20 25 Stê¿enie kadmu (µM) Stê¿enie GSH (µM/mg bia³ka) 0 25 50 200 1 h 2 h æ o n w y t k A w ó m y z n e a k ³ a i b g m / U s a z C ij c y z o p s k e ). z d o g ( u m d a k u k r o l h c e i n e ¿ ê t S 0 25 50 200 1 D O S 1 1,84±0,47 2,19±0,50 2,50±0,50* 2,90±0,66*** 2 1,75±0,44 1,95±0,33 2,25±0,62* 3,42±0,76*/** 2 D O S 1 1,23±0,25 1,60±0,30 1,84±0,49* 2,26±0,85* 2 1,48±0,20 1,60±0,25 1,96±0,20* 2,56±0,68* T A C 1 265,40±63 474,07±195* 577,80±106* 709,00±195*** 2 267,50±75 473,80±137* 495,80±63* 332,80±48*/** x P H S G .³ a c 1 0,50±0,10 0,60±0,13** 0,66±0,05** 0,67±0,16** 2 0,43±0,15 0,44±0,11** 0,47±0,07** 0,49±0,15** x P H S G -e S 1 0,36±0,10 0,33±0,09 0,30±0,03 0,39±0,10** 2 0,28±0,10 0,28±0,14 0,33±0,05 0,32±0,13** T S G 1 0,25±0,02 0,31±0,02* 0,34±0,04* 0,44±0,07*** 2 0,30±0,02 0,30±0,02* 0,36±0,07* 0,37±0,03*/** R H S G 1 0,055±0,01 0,056±0,02** 0,066±0,01*** 0,083±0,02*** 2 0,085±0,02 0,100±0,02** 0,13±0,06*/** 0,18±0,05*/** Tab. 1. Wp³yw chlorku kadmu na aktywnoæ enzymów antyoksydacyjnych w izolo-wanych hepatocytach szczura
Objanienia: * ró¿nica statystycznie istotna w odniesieniu do uk³adu kontrolnego (p £ 0,05); ** ró¿nica statystycznie istotna w odniesieniu do 1-godzinnej ekspozycji hepatocytów szczura na chlorek kadmu (p £ 0,05); uk³ad kontrolny stanowi³y hodowle hepatocytów inkubowane w medium MWE bez dodatku chlorku kadmu
Ekspozycja hepatocytów na kadm doprowadza³a do wzrostu aktywnoci CAT; znamienny (w porównaniu z uk³adem kontrolnym) wzrost aktywnoci enzymu stwierdzano ju¿ w hepatocytach inkubowanych (przez jedn¹ lub dwie godziny) w obecnoci chlorku kadmu w stê¿eniu 25 µM. Jednogodzinne nara¿enie komórek na kadm w wy¿szych stê¿eniach (50, 200 µM) dopro-wadza³o do znacznego, zale¿nego od stê¿enia kadmu podwy¿szenia aktywnoci CAT (tab. 1). Aktywnoæ CAT w hepatocytach eksponowanych przez 2 godziny na chlorek kadmu w stê¿eniu 200 µM by³a statystycz-nie istotstatystycz-nie ni¿sza od obserwowanej w hepatocytach inkubowanych w obecnoci kadmu w takim samym stê¿eniu przez 1 godzinê (tab. 1).
Aktywnoæ ca³. GSHPx i Se-GSHPx w hepatocy-tach eksponowanych przez jedn¹ lub dwie godziny na chlorek kadmu (25, 50 i 200 µM) nie ró¿ni³a siê istot-nie od aktywnoci tych enzymów w hepatocytach in-kubowanych w medium MWE bez dodatku kadmu (tab. 1). Wyrane zmiany aktywnoci wymienionych enzymów obserwowano natomiast w hepatocytach nara¿onych na dzia³anie kadmu w zale¿noci od cza-su ekspozycji komórek na ten metal. W hepatocytach poddanych dwugodzinnej ekspozycji na kadm istot-nie ni¿sz¹ (od obserwowanej po jednogodzinnej eks-pozycji) aktywnoæ ca³. GSHPx stwierdzono w hepa-tocytach inkubowanych w obecnoci kadmu w stê¿e-niach: 25, 50 i 200 µM, a aktywnoæ Se-GSHPX jedy-nie w komórkach eksponowanych na kadm w stê¿e-niu 200 µM (ale wy¿sz¹ w porównastê¿e-niu z kontrol¹) (tab. 1).
Aktywnoæ GST w hepatocytach eksponowanych przez jedn¹ lub dwie godziny na chlorek kadmu by³a wy¿sza w porównaniu do stwierdzonej w hepatocy-tach kontrolnych; po jednogodzinnej ekspozycji ko-mórek na kadm istotny wzrost aktywnoci GST stwier-dzano ju¿ w hepatocytach inkubowanych w obecno-ci kadmu w najni¿szym stosowanym stê¿eniu (25 µM), a po dwugodzinnej ekspozycji w hepatocytach ekspo-nowanych na kadm w dwukrotnie wy¿szym (50 µM) stê¿eniu. Najwy¿sz¹ aktywnoæ GST stwierdzono po jednogodzinnej ekspozycji komórek na kadm w stê-¿eniu 200 µM; dwugodzinne nara¿enie hepatocytów na kadm w tym stê¿eniu doprowadza³o do istotnego obni¿enia aktywnoci GST (tab. 1).
W hepatocytach eksponowanych przez jedn¹ godzi-nê na kadm istotn¹ zmiagodzi-nê aktywnoci GSHR stwier-dzono jedynie w komórkach inkubowanych w obec-noci kadmu w najwy¿szym (200 µM) stosowanym stê¿eniu. Dwugodzinne nara¿enie komórek na dzia³a-nie kadmu doprowadza³o do znacznego, zale¿nego od stê¿enia kadmu, statystycznie istotnego podwy¿szenia aktywnoci GSHR: znamienny (w porównaniu z uk³a-dem kontrolnym i krótszym czasem ekspozycji) wzrost aktywnoci enzymu stwierdzano ju¿ w komórkach eksponowanych na kadm w stê¿eniu 25 µM (tab. 1).
Mechanizm toksycznego dzia³ania kadmu nie jest dobrze poznany. Wiadomo z pimiennictwa, ¿e
pier-wiastek ten bezporednio nie uczestniczy w powsta-waniu wolnych rodników tlenowych i ich reaktywnych form (RFT) (14). Wa¿n¹ rolê w ochronie komórek przed jego toksycznym dzia³aniem wydaj¹ siê pe³niæ enzymy antyoksydacyjne i drobnocz¹steczkowe anty-oksydanty (8, 25).
Uzyskane wyniki wskazuj¹, ¿e mechanizm toksycz-nego dzia³ania kadmu na hepatocyty szczura wi¹¿e siê z indukcj¹ stresu oksydacyjnego, a w konsekwencji z os³abieniem systemu antyoksydacyjnego komórek. Wyrazem tego jest podwy¿szenie poziomu peroksy-dacji lipidów (TBARS) i wyrany wzrost stê¿enia zre-dukowanego glutationu (GSH) w hepatocytach eks-ponowanych przez 1 i 2 godziny na dzia³anie ró¿nych dawek chlorku kadmu w porównaniu z uk³adem kon-trolnym. Dla obu markerów stresu oksydacyjnego stwierdzono zale¿noæ czasdawkaefekt.
Podwy¿szony poziom peroksydacji lipidów w izo-lowanych hepatocytach eksponowanych na dzia³anie kadmu wskazuje, ¿e metal ten zwiêksza w komórkach iloæ RFT. Jest to mo¿liwe w wyniku uwolnienia przez kadm metali przejciowych z miejsc ich naturalnego wystêpowania w komórkach. Kadm, wi¹¿¹c siê z ce-ruloplazmin¹ lub ferrytyn¹ w w¹trobie, mo¿e wypie-raæ z nich jony ¿elaza i miedzi, które bior¹ udzia³ w po-wstawaniu najbardziej reaktywnego rodnika hydro-ksylowego w reakcji Fentona (5, 20, 27, 30). Wed³ug danych pimiennictwa, kadm mo¿e równie¿ uszkadzaæ mitochondria, co prowadzi do uwolnienia Fe+2 z
kom-pleksów enzymatycznych, wchodz¹cych w sk³ad ³añ-cucha oddechowego. Jeszcze inn¹ mo¿liwoci¹ wy-twarzania RFT w wyniku dzia³ania kadmu jest zaha-mowanie aktywnoci III kompleksu ³añcucha oddecho-wego (oksydoreduktaza cytochromu c), odpowiedzial-nego za transport elektronów z ubichnonu na cyto-chrom c (6, 31).
Wzrost stê¿enia GSH w hepatocytach eksponowa-nych przez 1 i 2 godziny na kadm w porównaniu z uk³a-dem kontrolnym równie¿ wskazuje na stres oksyda-cyjny. Fakt znacznego obni¿enia iloci GSH w hepa-tocytach eksponowanych przez 2 godziny na kadm w wysokim stê¿eniu w porównaniu od obserwowane-go po jednoobserwowane-godzinnej ekspozycji komórek na ten me-tal wiadczy o aktywnym udziale GSH w obronie ko-mórek przed dzia³aniem RFT.
Wykazanie w niniejszej pracy, ¿e kadm w wysokich stê¿eniach i przy d³ugim czasie ekspozycji mo¿e wtór-nie obni¿aæ stê¿ewtór-nie GSH w izolowanych hepatocy-tach szczura (co przyczynia siê do powstawania w nich nadmiaru RFT) jest zgodne z wynikami opublikowa-nym przez Pourahmad i OBrien (20).
Wiadomo, ¿e powstawanie du¿ych iloci RFT w he-patocytach prowadzi do zu¿ywania mechanizmów antyoksydacyjnych i wyczerpywania zdolnoci obron-nych komórek przed skutkami ich dzia³ania (14). He-patocyty maj¹ ograniczon¹ zdolnoæ do funkcjonowa-nia w warunkach stresu oksydacyjnego (21). Niewy-dolnoæ systemu antyoksydacyjnego zmniejsza
elimi-nacjê RFT z komórek w¹troby, co jeszcze bardziej nasila w nich uszkodzenia struktur komórkowych i pro-wadzi do utraty ich integralnoci.
Uzyskane wyniki jednoznacznie wykaza³y, ¿e nara-¿enie hepatocytów na kadm doprowadza do obni¿enia w nich potencja³u antyoksydacyjnego. Os³abienie an-tyoksydacyjnych mechanizmów obronnych w hepato-cytach manifestowa³o siê zmianami aktywnoci bada-nych enzymów antyoksydacyjbada-nych.
Wzrost aktywnoci SOD1 i SOD2 w hepatocytach obserwowany po jedno- i dwugodzinnym nara¿eniu komórek na kadm (zw³aszcza w wy¿szych dawkach) wskazuje na próbê adaptacji komórek w¹troby do funk-cjonowania w warunkach silnego stresu oksydacyjne-go. Wy¿sza aktywnoæ katalazy stwierdzona w hepa-tocytach nara¿onych przez 1 godzinê na dzia³anie kad-mu (w porównaniu z uk³adem kontrolnym) wiadczy, ¿e komórki broni¹ siê przed nadmiarem powsta³ego w wyniku dzia³ania SOD nadtlenku wodoru. Spadek aktywnoci tego enzymu w drugiej godzinie ekspozy-cji hepatocytów na kadm w najwy¿szym stosowanym w dowiadczeniu stê¿eniu (100 µM) sugeruje, ¿e ak-tywnoæ katalazy jest hamowana. Prawdopodobnie do-chodzi do wyparcia z grupy prostetycznej katalazy Fe++,
co manifestuje siê obni¿eniem aktywnoci enzymu (6). Dwugodzinne nara¿enie izolowanych hepatocytów na kadm w wysokim stê¿eniu powoduje nie tylko wtórny spadek stê¿enia GSH (w porównaniu do wartoci stwierdzanych po jednogodzinnej ekspozycji komó-rek na kadm), ale równie¿ obni¿enie aktywnoci en-zymów cyklu glutationowego GSHPx (ca³. GSHx i Se-GSHPx) i GST (tab. 1), które s¹ odpowiedzialne za unieczynnianie nadtlenku wodoru, nadtlenków or-ganicznych czy endo- i egzogennych zwi¹zków elek-trofilowych (12).
O stresie oksydacyjnym w hepatocytach poddanych dzia³aniu kadmu wiadczy równie¿ wzrost aktywno-ci GSHR enzymu odpowiedzialnego za odtwarzanie z GSSG zredukowanej formy glutationu (GSH).
W wietle uzyskanych wyników wydaje siê, ¿e me-chanizm toksycznego dzia³ania kadmu w hepatocytach zwi¹zany jest nie tylko z indukcj¹ peroksydacji lipi-dów, ale równie¿ ze zdolnoci¹ kadmu wi¹zania grup -SH obecnych w GSH i wypieraniem z centrum ak-tywnego lub z grupy prostetycznej Se czy Fe.
GSH pe³ni w hepatocytach rolê ochronn¹, poniewa¿ wi¹¿¹c kadm zmniejsza nara¿enie komórek na cyto-toksyczne dzia³anie tego metalu. Wiadomo, ¿e w wa-runkach fizjologicznych GSH dzia³a jako komórkowy bufor tiolowy, który bardzo skutecznie przeciwdzia³a efektom utleniania grup -SH. Zapobiega to utracie aktywnoci biologicznej wielu funkcjonalnych bia³ek komórkowych. Potwierdzeniem tego jest obni¿enie stê¿enia GSH i podobny charakter zmian aktywnoci katalazy i Se-GSHPx w hepatocytach nara¿onych przez 2 godziny na kadm w najwy¿szym stosowanym stê¿e-niu (200 µM). Kadm, wi¹¿¹c siê z GSH, obni¿a jego iloæ w hepatocytach, co upoledza w nich reakcje
ka-talizowane przez enzymy cyklu glutationowego redox, w których GSH uczestniczy jako kosubstrat. Zmniej-szenie stê¿enia GSH w komórkach prowadzi do per-oksydacji lipidów i bia³ek (12, 19, 24, 26).
Kadm, wypieraj¹c i zastêpuj¹c inne metale w meta-loenzymach, mo¿e wp³ywaæ na ich aktywnoæ, czego konsekwencj¹ mog¹ byæ zmiany w metabolizmie bia-³ek, kwasów nukleinowych, wêglowodanów i lipidów. Niezale¿nie od mechanizmu, w którym kadm bez-porednio lub bez-porednio indukuje stres oksydacyjny w hepatocytach, prowadzi to do zmian w strukturze wa¿nych biologicznie makrocz¹steczek (bia³kach, li-pidach, DNA i innych), a w efekcie do nieodwracal-nych uszkodzeñ i zaburzeñ ich biologicznieodwracal-nych funkcji. Peroksydacja lipidów powoduje nie tylko utratê inte-gralnoci b³on komórkowych hepatocytów, ale rów-nie¿ narusza gradient jonowy oraz modyfikuje dzia³a-nie wielu bia³ek b³onowych (np. enzymów, recepto-rów, kana³ów i innych) (2). Stres oksydacyjny induko-wany w hepatocytach przez kadm mo¿e siê nasilaæ w wyniku os³abienia zdolnoci redukcyjnych komó-rek na skutek hamowania przez ten metal aktywnoci enzymów antyoksydacyjnych. Hamuj¹c aktywnoæ wy-mienionych enzymów kadm mo¿e porednio uczest-niczyæ w oksydacyjnym uszkodzeniu bia³ek, lipidów czy DNA. Toksyczne dzia³anie kadmu mo¿e siê rów-nie¿ wi¹zaæ z zaburzeniem szlaków sygnalizacyjnych i indukcj¹ apoptozy w hepatocytach nara¿onych na kadm (22, 24). Zdolnoæ kadmu do indukcji stresu oksydacyjnego, który powoduje oksydacyjne uszko-dzenia DNA t³umaczy udzia³ tego metalu w powsta-waniu u ludzi nowotworów p³uc, prostaty, trzustki i in-nych (29, 30).
Podsumowanie
Uzyskane w badaniach wyniki wskazuj¹, ¿e toksycz-ne dzia³anie kadmu wynika z os³abienia mechanizmów antyoksydacyjnych w izolowanych hepatocytach szczura, czego konsekwencj¹ s¹ w nich zmiany stê¿e-nia GSH i podwy¿szony poziom peroksydacji lipidów mierzony iloci¹ TBARS. O wp³ywie kadmu na in-dukcjê stresu oksydacyjnego w komórkach wiadczy równie¿ wzrost aktywnoci izoenzymów SOD (SOD1 i SOD2), bior¹cych udzia³ w eliminacji anionoka ponadtlenkowego prekursora wszystkich rodni-ków tlenowych i ich reaktywnych pochodnych. Kadm powoduje spadek aktywnoci GSHPx i GST odpowie-dzialnych za unieczynnianie nadtlenku wodoru i nad-tlenków lipidowych oraz tworzenie S-koniugatów z en-dogennymi i egzogennymi zwi¹zkami elektrofilowy-mi, co prowadzi do ich inaktywacji i obni¿enia tok-sycznoci. Metal ten zwiêksza wyranie aktywnoæ GSHR enzymu, który odtwarza w komórkach z GSSG pulê zredukowanego GSH. Zmiany aktywno-ci enzymów antyoksydacyjnych i stê¿eñ TBARS i GSH w komórkach w¹troby szczura wywo³ane dzia³aniem kadmu in vitro zale¿¹ zarówno od jego stê¿enia, jak i od czasu ekspozycji komórek na dzia³anie tego metalu.
Zwiêkszenie poziomu peroksydacji lipidów oraz towarzysz¹ce im zmiany stê¿enia GSH i aktywnoci enzymów antyoksydacyjnych (szczególnie cyklu glu-tationowego) w izolowanych hepatocytach szczura wywo³ane dzia³aniem kadmu, wiadcz¹ o zaburzeniu w komórkach równowagi prooksydacyjno-antyoksy-dacyjnej.
Pimiennictwo
1.Anon.: International Agency for Research on Cancer (IARC): Beryllium, cad-mium, mercury, and exposure in the glass manufacturing industry. Mono-graphs on the Evaluation of the Carcinogenic Risks to Humans. IARC Scien-tific Publications, Lyon 1993, 58, 119-237.
2.Bartosz G.: Druga twarz tlenu. Wolne rodniki w przyrodzie. PWN, Warsza-wa 2004.
3.Beauchamp C., Fridovich I.: Superoxide dismutase: improved assays and an assay applicable to acrylamide gels. Anal. Biochem. 1971, 44, 276-287. 4.Bradford M.: A rapid and sensitive method for the quantitation of
micro-gram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. Anal. Biochem. 1976, 72, 248-254.
5.Brzóska M. M., Moniuszko-Jakoniuk J.: The influence of calcium content in the diet on accumulation and toxicity of cadmium in the organism. Arch. Toxicol. 1998, 72, 63-73.
6.Casalino E., Calzaretti G., Sblano C., Landriscina C.: Molecular inhibitory mechanism of antioxidant enzymes in rat liver and kidney by cadmium. Toxi-cology 2002, 179, 37-50.
7.Ellman G. L.: SH groups determination in biological fluids. Anal. Biochem. 1970, 46, 237-243.
8.Fariss M. W.: Cadmium toxicity: unique cytoprotective properties of alpha tocopheryl succinate in hepatocytes. Toxicology 1991, 69, 63-77. 9.Golberg D. M., Spooner R. J.: Glutathione reductase, [w:] Bregmayer H. V.:
Methods Enzymatic Analysis. Verlag Chemie, Weinheim 1983, 3, 258-265. 10.Goth L.: A simple method for determination of serum catalase activity and
revision of reference range. Clin. Chim. Acta 1999, 196, 143-151. 11.Habig W. H., Pabst M., Jacoby W.: Glutathione S-transferase, the first step in
mercapturic acid formation. J. Biol. Chem. 1974, 249, 7130-7139. 12.Hayes J. D., McLellan L. I.: Glutathione and glutathione-dependent
enzy-mes represent a coordinately regulated defence against oxidative stress. Free Radic. Res. 1999, 31, 273-300.
13.Järup L., Berglund M., Elinder C. G., Nordberg G.,Vahter M.: Health effects of cadmium exposure: a review of the literature and risk estimate. Scand. J. Work Environ. Health 1998, 24, 1-51.
14.Jurczuk M., Brzóska M. M., Moniuszko-Jakoniuk J., Ga³a¿yn-Sidorczuk M., Kulikowska-Karpiñska E.: Antioxidant enzymes activity and lipid peroxida-tion in liver and kidney of rats exposed to cadmium and ethanol. Food Chem. Toxicol. 2004, 42, 429-438.
15.Ko³acz R., Dobrzañski Z., Bodak E.: Biokumulacja Cd, Pb i Hg w tkankach zwierz¹t. Medycyna Wet. 1996, 52, 686-691.
16.Oberley L. W., Spitz D. R.: Assay of superoxide dismutase activity in tumor tissue. Methods Enzymol. 1984, 105, 457-464.
17.Ohkawa H., Ohishi N., Yagi K.: Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal. Biochem. 1979, 25, 192-205. 18.Paglia D., Valentine W.: Studies on the quantitative and qualitative
characte-rization of erythrocytes glutathione peroxidase. J. Lab. Clin. Med. 1967, 70, 158-168.
19.Pastore A., Fedrici E., Bertini F., Piemonte S.: Analysis of glutathione: im-plication in redox and detoxification. Clin. Chim. Acta 2003, 33, 19-39. 20.Pourahmad J., OBrien P. J.: A comparison of hepatocyte cytotoxic
mecha-nisms for Cu+2 and Cd+2. Toxicology 2000, 143, 263-273.
21.Pourahmad J., OBrien P. J., Jokar F., Daraei B.: Carcinogenic metal indu-ces reactive oxygen species formation in hepatocytes. Toxicol. Vitro 2003, 17, 803-810.
22.Robertson J. D., Orrenius S.: Molecular mechanisms of apoptosis induced by cytotoxic chemicals. Crit. Rev. Toxicol. 2000, 30, 609-627.
23.Sedlak J., Lindsay R. H.: Estimation of total, protein-bound, and nonprotein sulfhydryl groups in tissue with Ellmans reagent. Anal. Biochem. 1968, 25, 192-205.
24.Sen C. K.: Cellular thiols and redox-regulated signal transduction. Curr. Top. Cell Regul. 2000, 36, 1-30.
25.Shaikh Z. A., Vu T., Zaman K.: Oxidative stress as a mechanism of chronic cadmium-induced hepatotoxicity and renal toxicity and protection by anti-oxidants. Toxicol. Appl. Pharmacol. 1999, 154, 256-253.
26.Sies H.: Glutathione and its cellular functions. Free Radic. Biol. Med. 1999, 27, 916-921.
27.Stohs S. J., Bagchi D., Hassoun E., Bagchi M.: Oxidative mechanisms in the toxicity of chromium and cadmium ions. J. Environ. Pathol. Toxicol. Oncol. 2001, 20, 77-88.
28.Tennant R. J.: Evaluation of trypan blue techniques for determination of cell viability. Transplantation 1964, 2, 685-694.
29.Waalkes M. P.: Cadmium carcinogenesis. Mut. Res. 2003, 533, 107-120. 30.Waisberg M., Joseph P., Hale B., Beyersmann D.: Molecular and cellular
mechanisms of cadmium carcinogenesis. Toxicology 2003, 192, 95-117. 31.Wang Y., Fang J., Leonard S., Rao K. M. K.: Cadmium inhibits the electron
transfer chain and induces reactive oxygen species. Free Rad. Biol. Med. 2004, 11, 1434-1443.
32.Wendel A.: Glutathione peroxidase. Methods Enzymol. 1981, 77, 325-333.
Adres autora: dr hab. Hanna Czeczot, prof. WUM, ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa; e-mail: hanna.czeczot@wp.pl
