Medycyna Wet. 2006, 62 (7) 811
Praca oryginalna Original paper
W zwalczaniu kokcydiozy zastosowanie znalaz³y rodki, których efektem ubocznym mo¿e byæ zmiana w przebiegu procesów trawiennych (10). Dostêpne dane z tego zakresu dotycz¹ g³ównie dowiadczeñ z u¿yciem kokcydiostatyków jonoforowych. rodkiem bardzo czêsto stosowanym w zwalczaniu kokcydiów u wielu gatunków zwierz¹t, w tym królików, jest wpro-wadzony do praktyki w 1986 roku toltrazuril, zwi¹zek z grupy triazinonów. Jego wysoka skutecznoæ zwi¹-zana jest z zaburzeniem oddychania komórkowego u paso¿ytów. Preparat wykazuje dzia³anie zarówno przeciwko formom wewn¹trz-, jak i zewn¹trzkomór-kowym paso¿yta. W dostêpnym pimiennictwie brak jest danych dotycz¹cych wp³ywu tej substancji na prze-bieg procesów zachodz¹cych w jelicie lepym królika.
Celem pracy by³o okrelenie wp³ywu toltrazurilu, na przebieg fermentacji treci jelita lepego in vitro, a przede wszystkim ocena kinetyki wytwarzania ga-zów ubocznych produktów fermentacji.
Materia³ i metody
Badania przeprowadzono na 24 królikach rasy kalifornij-skiej w wieku 12 tygodni, o masie od 1,8 do 2,2 kg. Zwierzê-ta karmiono ad libitum, zgodnie z obowi¹zuj¹cymi normami ¿ywieniowymi (12), standardow¹ mieszank¹ granulowan¹
FK/W (prod. Dolpasz S.A.). Jeden kilogram ww. mieszanki zawiera³ odpowiednio: bia³ka ogólnego 18,0%, t³uszczu su-rowego 3-7%, w³ókna susu-rowego 8%, popio³u susu-rowego 5-6%. Przez okres dowiadczenia króliki mia³y swobodny dostêp do wody. Treæ jelita lepego poddano fermentacji in vitro, postêpuj¹c wg metodyki opisanej we wczeniejszych pracach (8, 12, 13). Pobran¹ od ka¿dego królika treæ jelita lepego podzielono na dwie czêci po 20 ml. Pobran¹ treæ (20 ml) rozcieñczono 5-krotnie wod¹ destylowan¹ do 100 ml i wlano do p³uczki destylacyjnej. Do p³uczki dodawano równie¿ 50 ml buforu o pH 6,9, który w 1 dm3 zawiera³: NaHCO
3 9,60 g/dm3, KCl 0,60 g/dm3, CaCl 2 0,04 g/dm3, CaCl2 × 6 H2O 0,01 g/dm3, Na 2HPO4 × 12 H2O 9,15 g/dm3, NaCl 0,45 g/dm3, MgSO 4 × 7 H2O 0,11 g/dm3, ZnSO4 × H2O 0,06 g/dm3, NH
4HCO3 0,50 g/dm3. Ca³kowita objêtoæ
inkubacyjna treci w p³uczce po rozcieñczeniu wynosi³a 150 ml. Inkubacjê prowadzono ³ani wodnej o temp 39°C, w hermetycznie zamkniêtych p³uczkach o pojemnoci 300 ml, wykonanych wg projektu w³asnego (8, 12) w oparciu o tzw. model sztucznego ¿wacza. Do treci czêci z p³uczek (grupa dowiadczalna) dodano 0,15 ml toltrazurilu (Baycox 2,5% Bayer), uzyskuj¹c koñcowe stê¿enie toltrazurilu w p³uczce 25 ppm (poziom osi¹gany w treci jelita lepego przy stoso-waniu terapeutycznym preparatu u królików). W dowiadcze-niach kontrolnych badano fermentacjê bez dodatku toltrazu-rilu. W celu zapewnienia warunków beztlenowych atmosferê p³uczek wysycano przez 15 min. azotem. Warunki
beztleno-Wp³yw toltrazurilu na fermentacjê
w jelicie lepym królika
WOJCIECH ZAWADZKI, STANIS£AW GRACZYK*, ANDRZEJ PO£OZOWSKI**, ALBERT CZERSKI, MARCIN ZAWADZKI***
Katedra Fizjologii Zwierz¹t,
*Katedra Anatomii Patologicznej, Patofizjologii, Mikrobiologii i Weterynarii S¹dowej Zak³adu Patofizjologii, **Katedra Chorób Wewnêtrznych i Paso¿ytniczych z Klinik¹ Chorób Koni, Psów i Kotów,
***Katedra i Klinika Rozrodu, Chorób Prze¿uwaczy oraz Ochrony Zdrowia Zwierz¹t Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej AR, ul. Norwida 31, 50-375 Wroc³aw Zawadzki W., Graczyk S., Po³ozowski A., Czerski A., Zawadzki M.
Effect of toltrazuril on the ceacal fermentation in rabbits
Summary
The research was carried out on 24 Californian breed rabbits, aged 12 weeks, weighing between 1.8 and 2.2 kg, from which the caecum content were taken and placed in fermentation in vitro. 0.15 ml of toltrazuril was added to the content in the vessels (the experimental group), which resulted in the final concentration of 25 ppm of toltrazuril in the vessel. In the analyses of gases obtained during fermentation it was determined that CO2 had the most substantial percentage, above 70%, CH4 had a smaller percentage of 15% of the gases produced in the caecum content, while hydrogen and hydrogen sulphide had the least considerable portion of it. During the fermentation the amount of the gases produced changed and the zenith of fermentation took place between the second and fourth hour of incubation. The addition of toltrazuril to the caecum content of a rabbit leads to an increase in the value of CO2:CH4 not observed in the control experiments. The addition of toltrazuril causes the increase in the hydrogen level which may result from changes in either the composition or activity of bacteria releasing H2.
Medycyna Wet. 2006, 62 (7) 812
we inkubacji sprawdzano aparatem DO-5508 (Lutron Ko-rea). Ca³kowit¹ iloæ wytwarzanych gazów odczytywano na pod³¹czonych do p³uczek manometrach, stosuj¹c technikê opisan¹ przez Zawadzkiego i wsp. (14). Natomiast celem zwi¹zania CO2 uwalnianego w trakcie fermentacji do zbior-niczka centralnego jednej z p³uczek wprowadzono 10 ml 50% roztworu KOH. Bezwzglêdn¹ iloæ CO2 obliczano na podsta-wie ró¿nicy objêtoci zawartej w p³uczkach bez i z dodat-kiem KOH (12). Zawartoæ metanu okrelano za pomoc¹ apa-ratu typu Barbara-3 (15). Pozosta³e gazy powstaj¹ce podczas fermentacji treci jelita lepego (CO, H2, H2S oraz CxHy) czano aparatem Orsata oraz przenonym aparatem do ozna-czania CO2, CO, H2S i SO2, postêpuj¹c podobnie jak to opi-sano we wczeniejszych pracach (11, 12, 15). Oceny fermen-tacji na podstawie iloci produkowanych gazów dokonywa-no po 1, 2, 4 i 6 godzinach inkubacji.
Wyniki przedstawiono w postaci redniej arytmetycznej, odchylenia standardowego (SD) oraz redniego b³êdu red-niej (SDM). Uzyskane wyniki weryfikowano testem t-Stu-denta.
Wyniki i omówienie
Jelito lepe królika zasiedla celulolityczna i fibroli-tyczna flora bakteryjna, posiadaj¹ca zdolnoæ fermen-tacyjnego rozk³adu cukrów strukturalnych zawartych w treci pochodzenia rolinnego. Powstaj¹ metaboli-ty, które inkorporowane s¹ do komórek bakteryjnych oraz wch³aniaj¹ siê przez cianê jelit do krwiobiegu. Oprócz tego organizm, trawi¹c bia³ko bakteryjne, wtór-nie wykorzystuje substancje zawarte w paszy. G³ów-nymi produktami energetyczG³ów-nymi powstaj¹cymi pod-czas bakteryjnej fermentacji, a wykorzystywanymi przez zwierzêta s¹ lotne kwasy t³uszczowe (Volatile fatty acids VFA). W procesie fermentacji powstaj¹ równie¿ produkty uboczne, takie jak CO2, CH4 oraz w niewielkich ilociach H2 i inne gazy (2, 13, 14).
Pracê ukierunkowano na analizê gazów powstaj¹-cych podczas fermentacji treci jelita lepego króli-ków oraz na wp³yw toltrazurilu na procesy fermenta-cji. Sk³ad procentowy gazów otrzymywanych w pró-bach kontrolnych, jak i w própró-bach z dodatkiem toltra-zurilu przedstawiono w tabeli nr 1. Dane te potwier-dzaj¹ wczeniejsze obserwacje dotycz¹ce udzia³u pro-centowego poszczególnych gazów produkowanych podczas fermentacji treci jelita lepego królika (12, 13). Najwiêkszy, bo ponad 70% udzia³ posiada CO2.
Mniej, bo oko³o 15% produkowanych w treci jelita lepego gazów stanowi CH4, nieznaczn¹ czêæ stano-wi¹ wodór oraz inne gazy (tab. 1). Równoczenie wy-kazano, ¿e w trakcie fermentacji iloæ produkowanych gazów ulega zmianie, a szczyt fermentacji, okrelany na podstawie iloci gazów, przypada pomiêdzy drug¹ a czwart¹ godzin¹ inkubacji (tab. 1).
Oprócz oceny dynamiki wytwarzania gazów w tre-ci jelita lepego królika, celem omawianego dowiad-czenia by³o okrelenie wp³ywu na przebieg fermenta-cji jednego z kokcydiostatyków toltrazurilu. Jego skutecznoæ w stosunku do kokcydiów przewodu po-karmowego zosta³a potwierdzona w licznych pracach dowiadczalnych (1, 10). Natomiast jego wp³yw na florê bakteryjn¹ zasiedlaj¹c¹ przewód pokarmowy a tym samym przebieg fermentacji jest s³abo poznany. Proces fermentacji charakteryzuje kilka parametrów. Podstawowym parametrem, obok wydajnoci fermen-tacji i wspó³czynnika utylizacji VFA, jest stosunek CO2 : CH4. W tym kontekcie analiza zebranych na wykresie nr 1 wartoci wskanika CO2 : CH4 pozwala na stwierdzenie, ¿e dodanie do treci jelita lepego kró-lika toltrazurilu prowadzi do jego wzrostu. Spostrze-¿enie to wydaje siê interesuj¹ce, ukazuje bowiem dy-namikê oraz charakter zmian fermentacji zachodz¹-cych pod wp³ywem badanego kokcydiostatyku. Nie pozwala jednak na wyjanienie mechanizmu odpowie-dzialnego za opisane zmiany.. Mechanizmy, o których mowa, bardziej przybli¿a analiza dynamiki
wytwarza-y z a G ). z d o g ( ij c a b u k n i s a z C e n l o rt n o k a i n e z c d a i w o D Pododaniutolrtazurliu 0 1 2 4 6 0 1 2 4 6 O C 2 70,50 76,00 84,80* 85,50* 70,80 70,50 78,00* 86,20* 87,30** 74,55** H C 4 14,80 15,10 15,40* 11,50* *10,40* 14,80 14,30* 10,40* 10,05** 19,60** H2 10,60 **12,70** *113,90*** 11,60* 10,40 10,60 1*2,50** **14,30*** 1*5,15*** 0,90* H2S 10,60 10,70 11,00* 10,80* 10,50 10,60 0,80 10,85* 0,90* 0,80* Tab. 1. Procentowy sk³ad gazów wytwarzanych w jelicie lepym królików przed i po dodaniu toltrazurilu po 1, 2, 4 i 6 godzi-nach inkubacji in vitro
Objanienia: Wartoci skrajne: odchylenie standardowe (SD): 0,200-0,320; redni b³¹d redniej (SDM): 0,120-0,155; przedzia³ ufnoci (CI): 0,165-0,190; *** p £ 0,001; ** p £ 0,01; * p £ 0,05
Ryc. 1. Zmiany stosunku CO2 : CH4 w fermentowanych pró-bach treci jelita lepego królików
0 h 1 h 2 h 4 h 6 h kontrola toltrazuril 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 kontrola
toltrazuril Czas inkubacji
Stosunek
CO
:C
H
Medycyna Wet. 2006, 62 (7) 813
nia poszczególnych gazów. Przy opisanych, niewiel-kich zmianach w udziale procentowym CO2 oraz CH4, interesuj¹ca jest dynamika wytwarzania trzeciego z oznaczanych gazów, a mianowicie wodoru. W pró-bach kontrolnych, przy niskim poziomie wyjciowym tego gazu, jego wytwarzanie ju¿ po godzinie szybko wzrasta, osi¹gaj¹c najwiêksz¹ wartoæ po dwóch go-dzinach inkubacji, po czym tak¿e szybko spada, osi¹-gaj¹c w 6. godzinie poziom wyjciowy (tab. 1). Ina-czej przebiega wytwarzanie wodoru, podczas inkuba-cji treci jelita lepego królika z dodatkiem toltrazuri-lu. Po pocz¹tkowym niskim poziomie wytwarzania, zbli¿onym do kontroli, w drugiej godzinie inkubacji obserwuje siê ponad 10% wzrost, aby w czwartej go-dzinie osi¹gn¹æ poziom przewy¿szaj¹cy trzykrotnie wartoci grupy kontrolnej. W szóstej godzinie inku-bacji, przy nieznacznie wy¿szej wartoci w próbach dowiadczalnych, iloæ wodoru obni¿a siê prawie do poziomu wyjciowego (tab. 1). Odnotowane tak wy-rane ró¿nice w poziomie wodoru nie mog¹ byæ kwe-sti¹ przypadku. Z uwagi na to, ¿e w pracy nie anali-zowano lotnych kwasów t³uszczowych, interpretacja zmian oraz przypuszczalny ich mechanizm jest trud-ny do okrelenia. Odnosz¹c jednak wyniki te do su-gestii innych autorów (3, 5-7, 12), mo¿na twierdziæ, ¿e odnotowany w próbach dowiadczalnych wzrost po-ziomu wodoru wynika ze zmiany sk³adu czy te¿ ak-tywnoci mikroflory uczestnicz¹cej w uwalnianiu H2. Uwzglêdniaj¹c zmiany w populacji mikroorganizmów warto podkreliæ, ¿e produkcja metanu jest wy¿sza przy stosowaniu diet bogatych we w³ókno ni¿ diet o niskiej zawartoci w³ókna (2, 11, 15). Wynika to z faktu, ¿e degradacja w³ókna prowadzi do produkcji wodoru, z którego podczas redukcji CO2 powstaje metan (4). G³ówne gatunki bakterii celulolitycznych produkuj¹-cych wodór stanowi¹ R. flavefaciens i R. albus.
Opublikowano wiele prac dotycz¹cych antybakte-ryjnego dzia³ania i wp³ywu, zw³aszcza antybiotyków jonoforowych na metabolizm flory przewodu pokar-mowego zwierz¹t (1, 6, 10).
Marounek i wsp. (5, 6) wykazali, ¿e dodanie do tre-ci jelita lepego królika antybiotyków jonoforowych (salinomycny, monenzyny, lasalocidu, maduramycy-ny) znacznie wzmaga wytwarzanie metanu, przy ma-lej¹cej równoczenie produkcji octanów. Wszystkie u¿yte jonofory podnosi³y odzysk wodoru. Stymuluj¹-ce dzia³anie u¿ytych jonoforów autorzy ci t³umacz¹ efektem hamowania konkurencyjnych reakcji zu¿ycia wodoru, który jest wykorzystywany w metanogenezie. Powo³uj¹ siê przy tym na badania Bernariera i wsp. (cyt. za 5) z roku 1993, wskazuj¹ce na konkurencjê metanogenezy i acetogenezy o wodór. Niski poziom odzysku wodoru jako donora elektronów w procesie redukcji CO2 do octanów jest wg Demeyer (3) typo-wym zjawiskiem dla rodowiska koñcowych odcin-ków jelit u królika.
Badania metanogenezy w ¿waczu i jelicie grubym u ciel¹t wykaza³y, ¿e odzysk wodoru w trakcie
fermen-tacji w ¿waczu jest dodatnio skorelowany z wielko-ci¹ produkcji metanu, a metanogeneza by³a stymulo-wana obecnoci¹ w treci ¿wacza pierwotniaków (9). Równie¿ u królika w treci jelita lepego wystêpuj¹ pierwotniaki, które uzupe³niaj¹ dominuj¹ce populacje bakteryjne. W badaniach opartych na analizie kwasów nukleinowych wykazano jednak, ¿e w treci jelita le-pego królika iloæ eukariotycznego RNA jest niewiel-ka (poni¿ej 7% ca³ego RNA), ulegaj¹c wzrostowi po odsadzeniu. Wykazano przy tym, ¿e wiêkszoæ jelito-wego RNA jest pochodzenia rolinnego, a niewielka czêæ pochodzi z komórek w³asnych organizmu, po-zosta³a za to RNA takich organizmów, jak Saccharo-mycopsis guttulata oraz pierwotniaków z typu Cilio-phora (7).
Trudno jest jednoznacznie rozstrzygn¹æ, czy opisa-ne zmiany w produkcji gazów, jakie odnotowano w próbach zawieraj¹cych toltrazuril, s¹ rezultatem zniszczenia populacji pierwotniaków, czy te¿ ubocz-nym efektem jego oddzia³ywania na populacje bakte-ryjne wystêpuj¹ce w treci jelita lepego. Ewidentna jest jedynie zmieniona pod jego wp³ywem kinetyka procesów fermentacyjnych, o czym wiadcz¹ wyka-zane zmiany poziomu wytwarwyka-zanego wodoru.
Pimiennictwo
1.Balicka-Laurans A., Ramisz A., Niedwiadek S., Bielañski P.: Wp³yw preparatu Baycox na efekty produkcyjne i przebieg kokcydiozy u królików. Rocz. Nauk. Zoot. 1992, 19, 241-250.
2.Barej W.: Manipulowanie procesami trawiennymi u prze¿uwaczy. Medycyna Wet. 1990, 46, 466-469.
3.Demeyer D., De Graeve K., Durand M., Stevani J.: Acetate: a hydrogen sink in hindgut fermentation as opposed to rumen fermentation. Acta Vet. Scand. Suppl. 1989, 89, 68-75.
4.Jensen B. B.: Methanogenesis in monogastric animals 20. Envir. Monitoring Assess. 1996, 42, 99-112.
5.Marounek M., Fievez V., Mbanzamihigo L., Demeyer D., Maertens L.: Age and incubation time effects on in vitro caecal fermentation pattern in rabbits before and after weaning. Arch. Tierernahr. 1999, 52, 195-201.
6.Marounek M., Simunek J., Duskova D., Skrivanova V.: Effect of ionophores on in vitro caecal fermentation in rabbits. J. Agr. Sci. 1997, 128, 495-498. 7.Michalet-Doreau B., Fernandez I., Fonty G.: A comparison of enzymatic and
molecular approach to characterize the cellulolytic microbial ecosystems of the rumen and cecum. 2002, 80, 790-796
8.Po³ozowski A., Stefaniak T., Zawadzki W., Graczyk S.: Próba okrelenia profilu fermentacji w jelicie lepym kury, kozy i królika. Mat. X Kongresu PTNW, Wroc³aw 19-21 wrzenia 1996, t. I, s. 94.
9.Schonhusen U., Zitnan R., Kuhla S., Jentsch W., Derno M., Voigt J.: Effects of protozoa on methane production in rumen and hindgut of calves around time of weaning. Arch. Anim. Nutr. 2003, 57, 279-295.
10.Skrivanova V., Marounek M., Tumova E., Skrivan M., Pavlasek I.: The effect of antimicrobial feed additives and anticoccidics supplementation on nutrient digestibility, performance and health of broiler rabbits. Vet. Med. Czech. 1997, 42, 225-231.
11.Zawadzki W.: The influence of some nonconventional feeds additives on the course of rumen fermentation in sheep. Sci. Lett. (Wroc³aw, Agric. University). Dissertation 1993, 112, 5-76.
12.Zawadzki W., Po³ozowski A.: Model fermentacji w treci jelit lepych królików in vitro. Pattern conditions of caecal fermentation in rabbits in vitro. Sci. Lett. (Wroc³aw, Agric. University) 1997, 57, 105-113.
13.Zawadzki W., Po³ozowski A., Popiel J., Trochowska E.: Sk³ad gazów jelita lepego u konia, kozy i królika w badaniach in vitro. Sci. Lett. (Wroc³aw, Agric. University) 1999, 59, 85-92.
14.Zawadzki W., Zawadzki Z., Za³ucki G.: Wp³yw diet i pór roku na wytwarzanie in vitro metanu przez mieszan¹ florê bakteryjn¹ ¿wacza owiec. Medycyna Wet. 1982, 38, 63-65.
15.Zawadzki W., Zawadzki Z., Za³ucki G., Leroch Z.: Wytwarzanie metanu przez hodowle flory bakteryjnej ¿wacza ciel¹t. Medycyna Wet. 1984, 40, 60-62. Adres autora: prof. dr hab. Wojciech Zawadzki, ul. Norwida 31, 50-375 Wroc³aw
