Medycyna Wet. 2008, 64 (11) 1280
Artyku³ przegl¹dowy Review
Reakcja PCR z analiz¹ przyrostu iloci produktu w cza-sie rzeczywistym (real-time PCR) opiera siê na konwen-cjonalnej reakcji ³añcuchowej polimerazy, opracowanej w 1983 r. przez Kary Mullisa i wspó³pracowników z kali-fornijskiej firmy Cetus, polegaj¹cej na wielokrotnym po-wielaniu materia³u genetycznego. Dziêki zastosowaniu wyznakowanych fluorescencyjnie starterów, sond mole-kularnych lub barwników wbudowuj¹cych siê pomiêdzy zasady nukleinowe DNA (interkaluj¹cych), które w obec-noci amplikonu fluoryzuj¹, mo¿liwa jest detekcja oraz monitorowanie przyrostu produktu w ka¿dym cyklu re-akcji. Zbêdnym staje siê elektroforetyczny rozdzia³ w ¿elu agarozowym produktu w obecnoci bromku etydyny, tak jak w tradycyjnej reakcji PCR, co skraca ca³kowity czas badania oraz zmniejsza ryzyko kontaminacji. Mo¿liwoæ monitorowania przyrostu produktu w ka¿dym cyklu real time PCR zwiêksza dok³adnoæ badania oraz pozwala na okrelenie wyjciowej iloci materia³u genetycznego u¿y-tego do reakcji.
Ze wzglêdu na rodzaj detekcji produktu PCR wyró¿nia siê metody swoiste i nieswoiste real time PCR. Metoda swoista polega na zastosowaniu fluorescencyjnie wyzna-kowanych sond b¹d starterów komplementarnych do matrycy. Wród sond wyró¿nia siê sondy liniowe (linear oligo probes), nukleolityczne (TaqMan), sondy o kszta³-cie szpilki do w³osów (Molecular Beacons) i samoiden-tyfikuj¹ce siê amplikony (10, 14). Ka¿da z sond wyzna-kowana jest fluoroforem. Do najpowszechniej stosowa-nych barwników zalicza siê: FAM (carboxyfluorescein), TET (6-carboxy-2,4,7,7-tetrachlorofluorescein), JOE (6-carboxy-4,5-dichloro-2,7-dimethoxyfluorescein), HEX (6-carboxy-2,4,4,7,7-hexachlorofluorescein),
fluoresceinê lub rodaminê, które po przy³¹czeniu do am-plikonu, wzbudzone odpowiedni¹ d³ugoci¹ wiat³a, fluo-ryzuj¹. Wielkoæ fluorescencji mierzona jest w ka¿dym cyklu reakcji i wzrasta wraz z iloci¹ produktu.
Metoda nieswoista real time PCR nie zale¿y od matry-cy DNA i polega na zastosowaniu barwnika, który ma zdolnoæ przy³¹czania siê do dwuniciowej cz¹steczki DNA (dsDNA). Do barwników interkaluj¹cych zalicza siê m.in. bromek etydyny, SYBR green1 oraz barwniki kwasów nukleinowych oparte na cyjaninie: BEBO, YOYO-1 oraz TOTO-1 (16). Sporód wymienionych barwników naj-powszechniej stosowanym jest SYBR green1. Podczas reakcji detekcja produktu amplifikacji mo¿liwa jest dziê-ki wzrostowi fluorescencji spowodowanej po³¹czeniem barwnika z dsDNA. Im wiêcej produktu amplifikacji po-wstaje podczas reakcji, tym silniejszy otrzymujemy syg-na³. Mankamentem nieswoistej metody real time PCR jest powstawanie produktów niespecyficznych, np. dimerów primerów. SYBR green1 w rzeczywistoci przy³¹cza siê do ka¿dej dwuniciowej cz¹steczki DNA, ³¹cznie z nie-specyficznymi produktami reakcji PCR i dimerami utwo-rzonymi przez startery, dlatego po ka¿dym badaniu nale-¿y przeprowadziæ analizê krzywej topnienia produktu, która pozwala wyeliminowaæ produkty niespecyficzne.
Ilociowy real time PCR
Metoda real time PCR jest metod¹ jakociowo-ilocio-w¹. Pozwala nie tylko na wykrycie badanego genu, ale równie¿ na jego ilociowe oznaczenie. Aby okreliæ do-k³adn¹ liczbê kopii genu w badanej próbce w czasie ka¿-dego eksperymentu konieczne jest wykrelenie krzywej standardowej, utworzonej przez amplifikacje próbek
Zastosowanie real time PCR z uwzglêdnieniem
przydatnoci w diagnostyce wcieklizny
ANNA OR£OWSKA, MARCIN SMRECZAK, PAWE£ TRÊBAS, JAN F. ¯MUDZIÑSKI Zak³ad Wirusologii Pañstwowego Instytutu Weterynaryjnego Pañstwowego Instytutu Badawczego,
Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy
Or³owska A., Smreczak M., Trêbas P., ¯mudziñski J. F.
Application of real time PCR including rabies diagnostics
Summary
In recent years a considerable improvement has been reported in the field of molecular biology. New molecular methods have replaced classic diagnostic techniques. Apart from pathogen detection, they also allow pathogen quantification in a relatively short time. For instance, real time PCR, thanks to using DNA-binding fluorophores or labelled oligonucleotide probes, allows the detection of virus and monitoring of each cycle of reaction. The use of complementary probes makes this method sensitive and specific. Real time PCR is widely applied, especially in microbiological and virological laboratories, also for rabies diagnostics. Additionally, it is an excellent tool in bio-medical and molecular research. For example, it is used for relative and absolute quantification of gene expression and the identification of mutations that might be a key issue in some diseases. Recently, real time PCR seems to become a standard technique in many diagnostic laboratories.
Medycyna Wet. 2008, 64 (11) 1281 o znanej liczbie kopii oznaczanego genu. Iloæ produktu
PCR wzrasta dwukrotnie z ka¿dym cyklem reakcji a¿ do momentu osi¹gniêcia fazy plateau, która spowodowana jest brakiem polimerazy, starterów czy hamuj¹cym dzia-³aniem inhibitorów. W celu okrelenia pocz¹tkowej licz-by kopii genu wyznacza siê wartoæ progow¹ fluorescen-cji CT, której poziom ustala siê zazwyczaj niewiele ponad poziom t³a. Im wiêcej kopii genu zawarte jest w badanej próbie, tym mniej cykli potrzeba, aby przekroczyæ war-toæ CT. Pierwszy cykl reakcji PCR, który przekroczy wartoæ progow¹ CT, okrela siê jako pocz¹tkow¹ liczbê kopii genu w materiale badanym. Liczbê kopii oznacza-nego genu okrela siê poprzez podstawienie uzyskanej wartoci CT do krzywej kalibracyjnej otrzymanej z po-miaru wskaników CT dla próbek o znanej zawartoci oznaczanego genu w trakcie tego samego eksperymentu.
Zastosowanie real time PCR
Real time PCR dziêki wysokiej czu³oci oraz specy-ficznoci zyska³ ostatnio du¿¹ popularnoæ w badaniach biomedycznych. Stosowany jest w diagnostyce moleku-larnej do wykrywania ró¿nych patogenów, w tym: wiru-sów, bakterii i grzybów (2, 5, 15). Metoda ta umo¿liwia ilociowe oznaczenie nawet niewielkiej liczby specyficz-nych sekwencji nukleotydowych. Wed³ug daspecyficz-nych pimien-nictwa, czu³oæ metody pozwala na wykrycie poni¿ej piê-ciu kopii genu w komórce, przez co mo¿e byæ stosowana do analizy ladowych iloci próbek, takich jak materia³ z biopsji czy niewielkie skrawki uzyskane metod¹ lasero-w¹ (LCM, laser capture microdissection) (16). Real time PCR stosowany jest równie¿ do pomiaru ilociowego kopii genu, transgenu (11) czy genomów wirusowych i bakte-ryjnych (8) oraz poziomu ekspresji RNA w komórkach i tkankach (6, 12, 18).
Ilociowe badanie kopii genu b¹d transgenu
Badanie liczby kopii genu b¹d transgenu mo¿liwe jest dziêki ilociowym oznaczeniom w real time RCR. Licz-ba kopii genu w Licz-badanej próbce wyliczana jest z krzywej standardowej wykrelonej dla oznaczanego genu w trak-cie eksperymentu. Real time PCR zosta³ zastosowany m.in. do badania próbek ¿ywnoci na obecnoæ genetycz-nie modyfikowanych organizmów (GMO) wyra¿anych zazwyczaj jako odsetek materia³u genetycznie zmodyfi-kowanego w stosunku do ca³kowitej iloci materia³u (11). Szczególnie przydatne przy identyfikacji genów jest zastosowanie multiplex real time PCR, pozwalaj¹cego na równoczesn¹ amplifikacjê i wykrycie kilku regionów ge-nomu przy u¿yciu ró¿nych par starterów oraz komplemen-tarnych sond, z których ka¿da wyznakowana jest innym fluoroforem. Ma to swoj¹ zaletê szczególnie przy ró¿ni-cowaniu amplikonów, poniewa¿ umo¿liwia jednoczesne wykrycie kilku genów, a tym samym skraca ca³kowity czas reakcji i zmniejsza iloæ u¿ywanych odczynników. Nie-stety, metoda ta wymaga przygotowania standardów o zna-nej zawartoci kopii genu dla ka¿dego z badanych genów.
Badanie poziomu ekspresji genu
Badanie poziomu ekspresji genu mo¿e mieæ charakter wzglêdny (relative) b¹d bezwzglêdny (absolute). Pierw-szym krokiem badania poziomu ekspresji jest izolacja RNA. W nastêpnym etapie RNA przepisywane jest na
cDNA, które w dalszej kolejnoci u¿ywane jest w reakcji real time PCR. Wzglêdne badanie ekspresji genu polega na porównaniu poziomu ekspresji badanego genu z po-ziomem genu referencyjnego (kontrol¹ wewnêtrzn¹), któ-rego ekspresja, przyjmuje siê, ¿e jest na sta³ym poziomie i pozostaje niezmieniona. Najczêciej stosowanymi kon-trolami wewnêtrznymi s¹ geny dla: cyklofiliny, â-aktyny, podjednostki 18S rRNA, receptora transferynowego oraz dehydrogenazy trójfosforanu aldehydu glicerynowego (GAPDH) (16). Poniewa¿ iloæ genu referencyjnego nie jest znana, dziêki tej metodzie mo¿liwe jest jedynie wzglêdne okrelenie zarówno poziomu, jak i zmian eks-presji badanego genu. Badania takie zastosowano m.in. do okrelenia ekspresji czynników wzrostu neuroleukiny (NLK) oraz dwóch izoform homologa fibroblastycznego czynnika wzrostowego FHF 1a i 1b w neuronach i astro-cytach myszy po zaka¿eniu wirusem wcieklizny (12). Podobnie Wang i wsp. (18), stosuj¹c GAPDH jako kon-trolê wewnêtrzn¹, zbadali profil ekspresji genów zaanga-¿owanych w odpowied immunologiczn¹, w szczegól-noci interferonu á/â oraz chemokin zapalnych u myszy po zaka¿eniu wirusem wcieklizny.
Bezwzglêdne okrelenie poziomu ekspresji genu po-zwala na dok³adne okrelenie liczby kopii badanego genu i mo¿liwe jest dziêki porównaniu poziomu ekspresji ba-danego genu (wyra¿onego jako CT) z krzyw¹ standardo-w¹ utworzon¹ przez amplifikacjê próbek o znanej iloci badanego genu. Niestety, metoda ta jest bardziej praco-ch³onna, poniewa¿ dla ka¿dego badanego genu wymaga sporz¹dzenia standardu o znanej liczbie kopii. Stosowa-na jest szeroko w badaniach biomedycznych, m.in. zosta-³a zastosowana do badania poziomu ekspresji bia³ka prio-nowego (PrP) w ró¿nych czêciach mózgowia owiec cho-rych na trzêsawkê (6).
Okrelanie liczby cz¹stek wirusów lub bakterii
Jak wczeniej wspomniano, real time PCR pozwala wykryæ specyficzne sekwencje nukleotydowe w miesza-ninie reakcyjnej, dziêki czemu umo¿liwia identyfikacjê oraz ilociowe oznaczenie sekwencji patogenu b¹d in-nych unikalin-nych sekwencji w materiale badanym. W mi-krobiologii real time PCR stosowany jest m.in. do po-miaru liczby cz¹stek wirusów, bakterii b¹d grzybów w materia³ach klinicznych. Poniewa¿ koncentracja wiru-sów wywo³uj¹cych chorobê oraz intensywnoæ objawów klinicznych s¹ bezporednio ze sob¹ skorelowane, meto-da ta jest idealnym narzêdziem do monitorowania prze-biegu choroby i postêpów leczenia u pacjentów. Okrele-nie wyjciowego poziomu wiremii lub bakteriemii jest wskazaniem koniecznym do rozpoczêcia w³aciwego le-czenia. Z kolei szybka i w³aciwa identyfikacja bakterii pozwala na dobranie odpowiedniego antybiotyku w le-czeniu choroby, przez co zapobiega stosowaniu antybio-tyków o szerokim spektrum dzia³ania, które w d³u¿szej perspektywie mog¹ doprowadziæ do antybiotykoopor-noci. Real time PCR zosta³ zastosowany do wykrywania m.in. Mycobacterium tuberculosis, Legionella pneumo-phila oraz Listeria monocytogenes (1, 4, 9).
Identyfikacja mutacji
Real time PCR jest idealnym testem do wykrywania i analizy mutacji, w tym polimorfizmu pojedynczego
nu-Medycyna Wet. 2008, 64 (11) 1282
kleotydu (SNP, single nucleotide polymorphism) zastê-puj¹c czêsto sekwencjonowanie czy analizê polimorfizmu fragmentów restrykcyjnych (RFLP). Identyfikacja muta-cji nastêpuje poprzez analizê krzywej topnienia produktu amplifikacji wykrelanej w trakcie ka¿dego eksperymen-tu. Stosowana jest m.in. w genotypowaniu oraz w anali-zie dyskryminacji alleli. Dziêki analianali-zie mutacji punkto-wych mo¿liwe jest równie¿ wykrycie opornoci na anty-biotyki u bakterii. Badania takie przeprowadzono m.in. na Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Helicobacter pylori, Enterococcus faecalis i Enterococ-cus faecium (16).
Zastosowanie real time PCR
w diagnostyce wcieklizny
Wirus wcieklizny jest wirusem RNA. Nale¿y do ro-dziny Rhabdoviridae i rodzaju Lyssavirus, w obrêbie któ-rego wyró¿nia siê 7 genotypów. S¹ to: klasyczny wirus wcieklizny (genotyp 1), wirus Lagos (genotyp 2), Mo-kola (genotyp 3), Duvenhage (genotyp 4), European Bat Lyssavirus typ 1 EBLV 1 (genotyp 5) i typ 2 EBLV 2 (genotyp 6) oraz Australian Bat Lyssavirus ABLV (ge-notyp 7).
Diagnostyka wirusa wcieklizny oprócz tradycyjnej metody izolacji wirusa na myszkach b¹d w hodowlach komórkowych oraz odczynu immunofluorescencji bez-poredniej obejmuje równie¿ molekularne metody wykry-wania wirusa. Wród tych wyró¿nia siê reakcjê RT-PCR oraz PCR w czasie rzeczywistym (real time PCR). Do wykrywania wirusa wcieklizny real time PCR zastoso-wali m.in. Hughes i wsp. (7) u zaka¿onych skunksów nie-toperzowym wariantem wirusa oraz Shankar i wsp. (13). Shankar i wsp. za pomoc¹ technologii TaqMan real time PCR wykryli wirusa u zaka¿onych nietoperzy. Materia³ do izolacji RNA stanowi³y: tkanka mózgowa, linianki oraz wymazy z gard³a nietoperzy. Jako matrycê do prze-prowadzenia reakcji real time PCR wykorzystali cDNA. Uzyskane wyniki porównali z wynikami otrzymanymi w klasycznej reakcji PCR. W przypadku mózgowia, miej-sca namna¿ania wirusa, czu³oæ reakcji real time PCR uzyskali na poziomie klasycznej reakcji PCR. Wyniki ujemne uzyskali za dla RNA izolowanego ze linianek oraz wymazów z gard³a. W celu zwiêkszenia czu³oci reakcji dla tych próbek autorzy jako matrycê do prze-prowadzenia reakcji real time PCR zastosowali produkt reakcji PCR, dziêki czemu równie¿ w liniankach oraz wymazach z gard³a wykryli wirus wcieklizny.
Mnogoæ grup genowych w obrêbie rodzaju Lyssavi-rus pozwala zastosowaæ technikê real time PCR nie tylko do wykrywania wirusa, ale równie¿ do jego genotypowa-nia. Stosuj¹c odpowiednie pary starterów oraz komple-mentarnych do matrycy sond mo¿liwe jest ró¿nicowanie genotypów w trakcie jednej reakcji. Badania takie prze-prowadzili m.in. Wakeley i wsp. (17). Technikê real time PCR z zastosowaniem sond TaqMan wykorzystali do de-tekcji i ró¿nicowania Lyssavirusów na poszczególne ge-notypy: 1, 5 oraz 6. W swoich badaniach zastosowali parê uniwersalnych starterów, umo¿liwiaj¹cych amplifikacjê fragmentu genu nukleoproteiny wszystkich trzech geno-typów wirusa wcieklizny oraz trzy sondy TaqMan, ka¿-da komplementarna, odpowiednio, do genotypu 1, 5 i 6. Sondy wyznakowane by³y ró¿nymi fluoroforami, co
umo¿-liwi³o wykrycie wszystkich trzech genotypów w przebie-gu tej samej reakcji. Dodatkowo autorzy zastosowali kon-trolê wewnêtrzn¹, gen koduj¹cy â-aktynê, która sygnali-zowa³a o prawid³owoci przebiegu procesu amplifikacji. Wydajnoæ procesu amplifikacji by³a wysoka i wynosi³a 92,1%, 98,8% i 99%, odpowiednio, dla genotypów 1, 5 oraz 6. Czu³oæ metody siêga³a 1 pg RNA wziêtego do reakcji.
Podobne badania przeprowadzili Black i wsp. (3). Tech-nologiê TaqMan zastosowali do wykrywania oraz ró¿ni-cowania szeciu genotypów wirusa wcieklizny. Dodat-kowo okrelili czu³oæ metody. Wykrywalnoæ wirusa wcieklizny uzyskali na poziomie 0,02 TCID50/ml, przez co dowiedli, ¿e real time PCR jest doskona³ym testem do detekcji i ró¿nicowania genotypów wirusa wcieklizny. Badania Black i wsp. potwierdzi³y, i¿ real time PCR jest metod¹ szybk¹, czu³¹ i nie wymaga rozdzia³u produktów amplifikacji, co zmniejsza ryzyko kontaminacji. Jest wiêc odpowiednim testem biologii molekularnej w diagnosty-ce wcieklizny.
Pimiennictwo
1.Ballard A. L., Fry N. K., Chan L., Surman S. B., Lee J. V., Harrison T. G., Tow-ner K. J.: Detection of Legionella pneumophila using a real-time PCR hybridiza-tion assay. J. Clin. Microbiol. 2000, 38, 4215-4218.
2.Bell C. A., Uhl J. R., Hadfield T. L., David J. C., Meyer R. F., Smith T. F., Cocke-rill F. R. 3rd.: Detection of Bacillus anthracis DNA by LightCycler PCR. J. Clin. Microbiol. 2002, 40, 2897-2902.
3.Black E. M., Lowings J. P., Smith J., Heaton P. R., McElhinney L. M.: A rapid RT-PCR method to differentiate six established genotypes of rabies and rabies--related viruses using TaqManTM technology. J. Virol. Methods 2002, 105, 25-35.
4.Celary T. J., Roudel G., Casillas O., Miller N.: Rapid and specific detection of Mycobacterium tuberculosis by Rusing the Smart Cycer instrument and a specific fluorogenic probe. J. Clin. Microbiol. 2003, 41, 4783-4786.
5.Chen W., He B., Li C., Zhang X., Wu W., Yin X., Fan B., Fan X., Wang J.: Real-time RT-PCR for H5N1 avian influenza A virus detection. J. Med. Microbiol. 2007, 56, 603-607.
6.Han C. X., Liu H. X., Zhao D. M.: The quantification of prion gene expression in sheep using real-time RT-PCR. Virus Genes 2006, 33, 359-364.
7.Hughes G. J., Smith J. S., Hanlon C. A., Rupprecht C. E.: Evaluation of TaqMan PCR assay to detect rabies virus RNA: Influence of sequence variation and appli-cation to quantifiappli-cation of viral load. J. Clin. Microbiol. 2004, 42, 299-306. 8.Komurian-Pradel F., Paranhos-Baccala G, Sodoyer M., Chevallier P.,
Mand-rand B., Lotteau V., Andree P.: Quantitation of HCV RNA using real-time PCR and fluorimetry. J. Virol. Methods 2001, 95, 111-119.
9.Lunge V. R., Miller B. J., Livak K. J., Batt C. A.: Factors affecting the performance of 5 nuclease PCR assays for Listeria monocytogenes detection. J. Microbiol. Methods 2002, 51, 361-368.
10.Mackay I. M., Arden K. E., Nitsche A.: Real Time PCR in virology. Nucleic Acids Res. 2002, 30, 1292-1305.
11.Peano C., Samson M. C., Palmieri L., Gulli M., Marmiroli N.: Qualitative and quantitative evaluation of the genomic DNA extracted from GMO and non-GMO foodstuffs with four different extraction methods. J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 6962-6968.
12.Prosniak M., Zborek A., Scott G. S., Roy A., Phares T. W., Koprowski H., Hooper D. C.: Differential expression of growth factors at the cellular level in virus-infected brain. Proc. Natl. Acid Sci. USA 2003, 100, 6765-6770. 13.Shankar V., Bowen R. A., Davis A. D., Rupprecht C. E., Oshea T. J.: Rabies in
a captive colony of big brown bats (Eptesicus fuscus). J. Wildl. Dis. 2004, 40, 403-413.
14.Stadejek T.: Postêp w rozwoju techniki cyklicznej polimeryzacji in vitro Real--Time PCR. Medycyna Wet. 2006, 62, 390-394.
15.Stadejek T., Podgórska K., Pejsak Z.: Zastosowanie Real Time PCR do wykrywa-nia zaka¿eñ pestiwirusowych. Medycyna Wet. 2006, 62, 165-169.
16.Valasek M. A., Repa J. J.: The power of real-time PCR. Adv. Physiol. Educ. 2005, 29, 151-159.
17.Wakeley P. R., Johnson N., McElhinney L. M., Marston D., Sawyer J., Fooks A. R.: Development of a Real-Time, TaqMan Reverse Transcription-PCR Assay for De-tection and Differentiation of Lyssavirus Genotypes 1, 5 and 6. J. Clin. Microbiol. 2005, 43, 2786-2792.
18.Wang Z. W., Sarmento L., Wang Y., Li X. Q., Dhingra V., Tseggai T., Jiang B., Fu Z. F.: Attenuated rabies virus activates, while pathogenic rabies virus evades, the host innate immune responses in the central nervous system. J. Virol. 2005, 79, 12554-12565.
Adres autora: mgr in¿. Anna Or³owska, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy; e-mail: anna.wozniak@piwet.pulawy.pl
