Nowe metody diagnostyczne do wykrywania fitopatogennych bakterii ziemniaka.

Ziemniak Polski 2010 nr 1

Ochrona

NOWE METODY DIAGNOSTYCZNE

NOWE METODY DIAGNOSTYCZNE

DO WYKRYWANIA FITOPATOGENNYCH

DO WYKRYWANIA FITOPATOGENNYCH

BAKTERII ZIEMNIAKA

BAKTERII ZIEMNIAKA

e-mail: wlodzimierz.przewodowski@tu.koszalin.pl

itopatogenne bakterie są jedną z przy-czyn strat ekonomicznych w produkcji ziemniaków. Ze względu na szeroki zakres wywoływanych przez nie symptomów chorobowych diagnostyka mikroorganizmów chorobotwórczych jest uciążliwa. Ponadto bakterie często występują w tkankach ziem-niaka w niskiej koncentracji, co znacznie utrudnia ich identyfikację.

F

Często jedynym sposobem ograniczenia występowania i eliminacji infekcji powodowa-nych przez bakterie chorobotwórcze ziem-niaka jest dobór właściwej metody diagno-stycznej. Powinna ona być odpowiednio czu-ła, szybka i wiarygodna. W celu zmniejsze-nia ryzyka rozprzestrzeniezmniejsze-nia się chorób wy-woływanych przez drobnoustroje ich obec-ność powinna być monitorowana na każdym z etapów produkcji i dystrybucji materiału ro-ślinnego.

Oto przegląd nowych oraz stosowanych dotychczas klasycznych metod wykrywania i identyfikacji bakteryjnych patogenów ziem-niaka.

Tradycyjne metody diagnostyczne

Tradycyjne metody identyfikacji bakterii opie-rają się na dobrze opracowanych, lecz nie-jednokrotnie czasochłonnych metodach mi-krobiologicznych. Wymagają one z reguły zastosowania odpowiedniego podłoża, opty-malnej temperatury, a następnie identyfikacji izolowanych drobnoustrojów na podstawie wyglądu kolonii oraz biochemicznej i fizjolo-gicznej charakterystyki ich właściwości.

W przypadku roślin wykazujących wyraź-ne symptomy choroby bakterie izoluje się na pożywkach selektywnych, natomiast do ruty-nowych hodowli czystych kultur bakterii sto-suje się mineralne podłoża wzrostowe. Do oceny zjadliwości wyizolowanych kultur bak-teryjnych stosuje się dodatkowo test biolo-giczny polegający na zakażaniu roślin wskaźnikowych, takich jak np. tytoń czy ba-kłażan.

Już pod koniec lat 70. ubiegłego stulecia w detekcji bakteryjnych patogenów ziemnia-ka zaczęto stosować testy serologiczne. Tego typu oznaczenia mimo stosunkowo szybko uzyskiwanych wyników nie znalazły zastosowania w rutynowej analizie dużej ilo-ści prób. Dopiero opracowanie immunoenzy-matycznej metody ELISA pozwoliło na zwiększenie przepustowości, czułości i auto-matyzację testów immunologicznych. Test o nazwie ELISA, oparty na wykorzystaniu przeciwciał rozpoznających specyficzne pa-togeny (wirusy i bakterie) oraz reakcji enzy-matycznej dającej barwny produkt mierzalny kolorymetrycznie, pomimo wymienionych za-let nie pozwala na bezpośrednią obserwację morfologii komórek bakteryjnych. Możliwość taką daje natomiast test pośredniej immuno-fluorescencji – IF (Slack i in. 1979; De Boer, Copeman 1980). Polega on na wybarwieniu za pomocą chemicznie przyłączonego barw-nika fluorescencyjnego. Barwnik pod wpły-wem światła UV świeci, co umożliwia obser-wację bakterii za pomocą mikroskopu fluore-scencyjnego.

Ziemniak Polski 2010 nr 1 Zastosowanie testów serologicznych w

kombinacji z innymi metodami korzystnie wpłynęło na zwiększenie czułości i specy-ficzności metod diagnostycznych. Przykła-dem może być test immunoenzymatyczno--filtracyjny (ELIFA) oparty na wykrywaniu bakterii związanych na filtrze przeciwciałami znakowanymi enzymem – peroksydazą. Obecność enzymu jest wykrywana w reakcji barwnej lub za pomocą chemiluminescencji.

Dla wzmocnienia uzyskanego sygnału w testach immunologicznych stosuje się połą-czenia metod wykorzystujących białko A, di-goksygeninę, układ biotyna-streptawidyna czy też układ kilku enzymów (peroksydaza, oksydaza glukozy, alkaliczna fosfataza).

Wraz z upowszechnieniem się molekular-nych technik diagnostyczmolekular-nych stosowano metody hybrydyzacji, czyli łączenia się jed-noniciowych cząstek kwasu nukleinowego (DNA lub RNA) w struktury dwuniciowe, z wykorzystaniem tzw. sond molekularnych będących znacznikami reakcji (Firrao 1990). W porównaniu z metodami serologicznymi hybrydyzacja DNA okazała się metodą mniej czułą, lecz bardziej specyficzną. Czułość molekularnych metod detekcji i identyfikacji bakterii znacznie zwiększono, namnażając fragmenty DNA techniką PCR, czyli łańcu-chową reakcją polimerazy (Schneider i in. 1993). Niestety, wadą klasycznej metody PCR jest możliwość wystąpienia fałszywie negatywnych wyników wskutek obecności w ekstraktach tkankowych substancji zakłóca-jących reakcję syntezy DNA. Trudność tę przełamano, stosując wstępne namnażanie drobnoustrojów na podłożach selektywnych, jak również wychwytywanie bakterii z eks-traktów na różnych nośnikach przy użyciu przeciwciał.

Nowe metody diagnostyczne

Dla polepszenia diagnostyki chorób ziemniaka poza metodami tradycyjnymi coraz częściej stosuje się nowoczesne, szybko rozwijające się techniki identyfikacji drobnoustrojów. Nowe protokoły są opracowywane i optymalizowane w przeciągu kilku miesięcy. Dodatkowo coraz powszechniej stosowana automatyzacja testów diagnostycznych przyczynia się do znacznego wzrostu wydajności i efektywności wykonywanych analiz.

Test o nazwie Multiplex PCR pozwala na jednoczesne wykrywanie odpowiednich frag-mentów DNA oraz namnożonego DNA rośli-ny gospodarza, co stanowi wewnętrzną kon-trolę poprawności przebiegu reakcji. Test Multiplex PCR-ELISA, dzięki połączeniu me-tod molekularnej i serologicznej, daje wyższą specyficzność w porównaniu z testami sero-logicznymi i jest czulszy od standardowego testu PCR (Mills, Russell 2003). W pierw-szym etapie testu namnaża się trzy specy-ficzne fragmenty DNA bakterii różnej wielko-ści, a następnie identyfikuje za pomocą testu ELISA. Test Multiplex PCR-ELISA poza wy-soką specyficznością pozwala wyeliminować reakcje fałszywie pozytywne.

W opracowanej przez Lee i innych (2001) metodzie „dig-labeled PCR” namnożony fragment DNA z przyłączoną digoksygeniną jest nanoszony na nylonową błonę i wykry-wany za pomocą reakcji immunoenzyma-tycznej. W odróżnieniu od techniki „dig- -labeled PCR” w metodzie PCR-ELOSA re-akcję immunoenzymatyczną przeprowadza się w mikropłytkach, stosując oprócz digo-k-sygeniny także biotynę, streptawidynę oraz koniugat przeciwciał z peroksydazą. Wynik reakcji odczytywany jest kolorymetrycznie. Technika ELOSA okazała się o 13% czulsza w stosunku do technik PCR z użyciem elek-troforezy i pozwala z jednakową czułością wykrywać szczepy bakterii zarówno pokry-tych śluzem, jak i szczepy pozbawione śluzu (Baer i in. 2001).

Ujemną stroną większości metod moleku-larnych jest brak możliwości odróżnienia bakterii żywych od martwych. Możliwość taką dają metody: fluorescencyjnej hybrydy-zacji in situ – FISH (Lee i in. 1997), techniki BIO-PCR z zastosowaniem pomiaru przyro-stu ilości produktu w czasie rzeczywistym – Real-Time PCR (Schaad i in. 1999) oraz me-toda namnażania kwasu nukleinowego w stałej temperaturze – NASBA (Van Beckho-ven i in. 2002).

W metodzie FISH odpowiedni sposób barwienia komórek bakteryjnych za pomocą dwóch barwników fluorescencyjnych pozwa-la różnicować komórki na martwe i żywe. Pierwszy z barwników połączony z przeciw-ciałem łączy się z powierzchnią komórek. Drugi, połączony z tzw. sondą, wnika do 2

Ziemniak Polski 2010 nr 1 wnętrza żywych komórek i łączy się z

bakte-ryjnym kwasem rybonukleinowym RNA. Technika Real-Time PCR jest jedną z naj-nowszych technik stosowanych coraz po-wszechniej do identyfikacji wielu bakteryj-nych patogenów roślin. Jej istotą jest na-m-nażanie materiału genetycznego w oparciu o klasyczną technikę PCR z zastosowaniem barwników fluorescencyjnych (np. TaqMan, Molecular Beacon, SYBR Green I itd.). Przy-rost produktów ocenia się ilościowo poprzez pomiar fluorescencji w czasie prowadzenia reakcji. Technika ta ma wiele zalet, ponie-waż pozwala na ilościowe oznaczanie bakte-rii i jest szybsza niż tradycyjny PCR. Wadą jest wysoki koszt urządzenia oraz odczynni-ków.

W metodzie TaqMan BIO-PCR w pierw-szym etapie namnaża się bakterie na pożyw-ce, a następnie prowadzi standardową reak-cję Real-Time PCR. Połączenie BIO- -PCR z systemem TaqMan pozwala na zwiększenie czułości testu nawet do 10 ko-mórek bakteryjnych w mieszaninie reakcyj-nej oraz osłabienie wpływu substancji zakłó-cających przebieg reakcji PCR (Schaad i in. 1999).

Rozwój nowych technologii, opracowanie nowych materiałów i znaczników spowodo-wało, że spośród metod immunologicznych coraz częściej doceniane ze względu na szybkość i specyficzność są testy typu Late-ral flow, nazywane również immunochroma-tograficznymi testami paskowymi (Verheijen i in. 1998, Wang i in. 2005). Są to testy stoso-wane do jakościowej lub półilościowej identy-fikacji patogenów bakteryjnych. W zależno-ści od konstrukcji testu pozwalają one na wy-krywanie jednej lub więcej bakterii wyizolo-wanej z ekstraktu na tym samym pasku.

Ekstrakt z tkanki ziemniaka nanosi się na końcówkę paska pokrytego przeciwciałami połączonymi ze znacznikiem pozwalającym zaobserwować barwną linię, świadczącą o obecności danego patogenu. W testach tych stosuje się najczęściej złoto koloidalne – je-den z najczulszych znaczników stosowanych w diagnostyce bakteriologicznej. Ze względu na czułość testu odpowiadającą czułości me-tod IF i ELISA oraz kilkuminutowy czas anali-zy testy tego typu są coraz chętniej stosowa-ne jako wstępstosowa-ne testy przesiewowe. Ich do-datkową zaletą jest łatwość użycia i

możli-wość stosowania poza laboratorium, np. w polu, przechowalni, bez konieczności stoso-wania dodatkowych urządzeń. Wadą jest na-tomiast relatywnie wysoki koszt pojedyncze-go testu w stosunku do innych testów labora-toryjnych.

W Pracowni Diagnostyki Molekularnej i Biochemii IHAR w Boninie opracowano nowy test filtracyjny typu Flow-Through do szybkiej i specyficznej identyfikacji czystych szcze-pów bakterii Cms (Przewodowski, Barnyk 2009). Do jego opracowania wykorzystano porowatą błonę filtracyjną zatrzymującą ko-mórki bakteryjne oraz złoto koloidalne jako znacznik. Cząsteczki złota koloidalnego po-łączone z przeciwciałami anty-Cms tworzą na ich powierzchni barwną otoczkę. Tak wy-barwione bakterie są następnie przepusz-czane przez błonę filtracyjną i obserwowane w postaci barwnych plam na powierzchni. Technika ta pozwala skoncentrować bakterie na małej powierzchni z dużej objętości eks-traktu. Test ten w odróżnieniu od testu typu Lateral flow umożliwia jednoczesną analizę wielu próbek przy minimalnym nakładzie kosztów, a obserwacja wybarwionych komó-rek bakteryjnych może być prowadzona przy użyciu klasycznego mikroskopu optycznego.

Efektem badań prowadzonych w Pracow-ni Diagnostyki Molekularnej i Biochemii ZNiOZ w Boninie jest również test immunofil-tracyjny będący połączeniem immunofiltracji oraz metody immunofluorescencji pośred-niej. Metodę opracowano, wykorzystując po-rowate błony filtracyjne, na które punktowo naniesiono przeciwciała skierowane na ko-mórki bakterii Cms (Przewodowski 2009). Filtracja ekstraktu z bulw ziemniaka przez taką błonę pozwala wyłapać komórki bakterii Cms przy jednoczesnym usunięciu innych bakterii. Wyłapane bakterie znakuje się na-stępnie za pomocą przeciwciał anty-Cms po-łączonych z barwnikiem fluorescencyjnym i obserwuje pod mikroskopem. Błonę z wyła-panymi komórkami bakterii można też umie-ścić na półselektywnej pożywce i w ten spo-sób uzyskać czyste szczepy bakterii Cms.

Literatura

1. Baer D., Mitzel E., Pasche J., Gudmestad N. 2001. PCR detection of Clavibacter michiganensis

subsp. sepedonicus – infected tuber samples in a plate capture assay. – Am. J. Potato Res. 78 (4): 269-277; 3

Ziemniak Polski 2010 nr 1

2. De Boer S. H., Copeman R. J. 1980. Bacterial ring

rot testing with the indirect fluorescent antibody stain-ing procedure. – Am. Potato J. 57: 457-465; 3. Firrao

G. 1990. Cloned diagnostic probe for Clavibacter

michiganensis subsp. sepedonicus. Bull. OEPP 20: 207- -213; 4. Lee I-M., Bartoszyk I. M., Gundersen R.

E., Mogen B., Davis R. E. 1997. Nested PCR for

Ul-trasensitive Detection of the Potato Ring Rot. Bacteri-um Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. – Appl. Environ. Microbiol. 7: 2625-2630; 5. Lee I.-M.,

Lukaesko L. A., Maroon C. J. M. 2001. Comparison

of dig-labeled PCR, nested PCR, and ELISA for the detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepe-donicus in field grown potatoes. – Plant Dis. 85: 261-266; 6. Mills D., Russell B. W. 2003. Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato Stems and Tubers by Multiplexed PCR-ELISA. – Am. J. Potato Res. 80: 223-234; 7. Przewodowski W. 2009. Szybki immunologiczny test do identyfikacji bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. [W:] Na-siennictwo i ochrona ziemniaka. Konf. nauk.-szkol. Darłówko, 21- -22.05.2009. IHAR ZNiOZ Bonin: 78; 8.

Przewodowski W., Barnyk A. 2009. Szybki test do

identyfikacji bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. – Prog. Plant Prot. 49 (2): 696-700; 9.

Schaad N. W., Berthier-Schaad Y., Sechler A., Knorr D. 1999. Detection of Clavibacter michiganensis

subsp. sepedonicus in potato tubers by BIO-PCR and an automated real-time fluorescence detection system. – Plant Dis. 83: 1095-1100; 10. Schneider B. J., Zhao

J. L., Orser C. S. 1993. FEMS Detection of

Clavibac-ter michiganensis subsp. sepedonicus by DNA ampli-fication. – Microbiol. Letters 109 (2-3): 207-212; 11.

Slack S. A., Sanford H. A., Manzer F. E. 1979. The

latex agglutination test as rapid serological assay for Corynabacterium sepedonicum. – Am. Potato J. 56: 441-446; 12. Wang S., Zhang C., Wang J.,

Zhang Y. 2005. Development of colloidal gold-based

flow-through and lateral-flow immunoassays for the rapid detection of the insecticide carbaryl. – Analytica Chimica Acta 546: 161-166; 13. Van Beckhoven J.

R., Stead D. E., Van der Wolf J. M. 2002. Detection of

Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus by AmpliDet RNA, a new technology based on real time monitoring of NASBA amplicons with a molecular beacon. – J. Appl. Microbiol. 93 (5): 840-849; 14.

Ver-heijen R., Stouten P., Cazemier G., Haasnoot W. 1998. Development of a one step strip test for the

de-tection of sulfadimidine residues. – Analyst 123: 2437-2441