WYBRANE STRATEGIE ZWALCZANIA BIOFILMÓW W ZAKAŻENIACH.
CZĘŚĆ I. POTENCJAŁ TERAPEUTYCZNY PEPTYDÓW
PRZECIWDROBNOUSTROJOWYCH
NEW STRATEGIES TO COMBAT BIOFILM-ASSOCIATED INFECTIONS. PART I. THE THERAPEUTIC
POTENTIAL OF ANTIMICROBIAL PEPTIDES
STRESZCZENIE: W pracy omówiono alternatywne sposoby zapobiegania i leczenia zakażeń z udziałem biofilmu drobnoustrojów. Infekcje tego typu mają charakter przewlekły, są opor-ne na terapię antybiotykami i działanie mechanizmów odpornościowych oraz wciąż stanowią przyczynę poważnych problemów medycznych. Dlatego też potrzebne są nowatorskie roz-wiązania, inne niż terapia konwencjonalna. W pracy przedstawiono aktualne trendy w bada-niach zmierzających do odkrycia i poznania alternatywnych (nietradycyjnych) opcji terapeu-tycznych. Zaprezentowany przegląd piśmiennictwa dowodzi, że dalsze badania w tym zakre-sie są uzasadnione – z jednej strony w celu pogłębienia wiedzy na temat mechanizmów po-wstawania biofilmu, a z drugiej w celu wykorzystania jej do opracowywania skutecznych me-tod leczenia i profilaktyki.
SŁOWA KLUCZOWE: biofilmy, lekooporność, peptydy przeciwdrobnoustrojowe
ABSTRACT: In this review we will discuss alternative approaches to prevent and treat biofilm--associated infections. Such an infections usually are chronic, are highly resistant to antibiotics and human immunity, being still a major cause of medical problems. As a result, novel thera-peutic solutions other than the conventional antibiotic therapies are in urgent need. In this re-view, it was described the recent research in discovery of alternative non-traditional appro-aches to prevent or treat biofilms. We intend to cover current advances in pharmaceutical ap-proaches to prevent medical device- and non-biomaterial – related infections caused by bio-films. This review proved that further studies are warranted to translate knowledge on the me-chanisms of biofilm formation into applicable therapeutic and preventive strategies.
KEY WORDS: antimicrobial peptides, biofilms, drug resistance
Pracownia Biologii Zakażeń Katedry Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Instytut Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii Wydziału Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytetu Łódzkiego } BARBARA RÓŻALSKA
Pracownia Biologii Zakażeń
Katedry Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Instytut Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii,
Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki, ul. Banacha 12/16, 91-237 Łódź, Tel.: (42) 635 4185, Fax: (42) 665 5818, e-mail: rozab@biol.uni.lodz.pl Wpłynęło: 07.08.2014 Zaakceptowano: 10.09.2014 DOI: dx.doi.org/10.15374/FZ2014044
WSTĘP
Od wielu lat poszukuje się odpowiedzi na pytanie dlacze-go zakażenia przebiegające z udziałem biofilmów są mało podatne na klasyczne postępowanie terapeutyczne. Mimo intensywnie prowadzonych badań nie ustalono jednoznacz-nej przyczyny tego zjawiska, pomimo iż zaproponowano szereg atrakcyjnych i prawdopodobnych hipotez wyjaśniają-cych. Nie ulega wątpliwości, iż najważniejszym składnikiem biofilmu o sugerowanej funkcji ochronnej jest zróżnicowa-ny pod względem składu i ilości zewnątrzkomórkowy po-limer (ang. extracellular polymeric substance – EPS). Zna-czenie ma także kumulacja i tworzenie wewnątrz biofilmu
gradientu stężeń enzymów inaktywujących dany antybio-tyk oraz fakt, iż biofilm stanowi idealne środowisko do wy-miany materiału genetycznego (w tym elementów warun-kujących cechę oporności). Inną przyczyną wysokiej opor-ności tego typu struktur może być heterogenność obszarów wewnątrz biofilmu, które różnią się pod względem ciśnie-nia osmotycznego, dostępu substancji odżywczych i gęsto-ści komórek. W populacji biofilmu pojawiają się często gru-py komórek wykazujące zmniejszone tempo wzrostu lub brak aktywności metabolicznej, a tym samym są mniej lub w ogóle niewrażliwe na działanie biocydów. Na uwagę za-sługuje także fakt wzmożonej ekspresji czynników mediu-jących odpowiedź stresową w biofilmie. Ponadto wydaje się,
że pompy efluksowe MDR (ang. multi-drug resistance) od-grywają znaczącą rolę w oporności całej populacji, zwłasz-cza że sugeruje się ich nadekspresję. Z kolei pewne gru-py komórek w strukturze biofilmu zwykle wykazują feno-typ oporny (komórki uparte – ang. persisters). Posiadane przez nie właściwości pozwalają im na przeżycie w warun-kach bójczego stężenia antybiotyków lub środków dezynfek-cyjnych oraz ponowne odtworzenie biofilmu po zakończe-niu cyklu terapeutycznego. Najbardziej prawdopodobne jest jednak łączne działanie tych mechanizmów, w kombinacji zależnej od rodzaju/gatunku drobnoustroju, morfologii bio-filmu warunkowanej czynnikami mikrośrodowiska i zasto-sowanej grupy terapeutycznej leku [1, 2].
TRENDY PROWADZONYCH BADAŃ NAD
ZWALCZANIEM BIOFILMÓW
Z powodu braku skuteczności dostępnej antybiotykote-rapii rozwijają się nowe kierunki badawcze dotyczące alter-natywnych sposobów zwalczania biofilmów, z których kil-ka pozostaje od kilku lat w centrum zainteresowania Auto-rów niniejszego opracowania. Badania te można podzielić na cztery główne nurty, obejmujące sposoby zwalczania bio-filmów na różnych etapach ich tworzenia i trwania:
t zapobieganie adhezji;
t zwalczanie „wczesnych” mikrokolonii i osłabianie konsolidującej się struktury;
t wymuszanie dyspersji;
t niszczenie dojrzałego biofilmu.
Należy jednak zaznaczyć, iż często te nurty badawcze wzajemnie się przenikają, gdyż wprowadzane modyfikacje i sposoby interwencji niejednokrotnie są oparte na więcej niż jednym mechanizmie działania [3–6]. Ogólny schemat strategii mających na celu zwalczanie biofilmów przedsta-wiono na Ryc. 1.
SPOSOBY OGRANICZANIA ADHEZJI
DROBNOUSTROJÓW
Przewodnią ideą pierwszego kierunku badań dotyczą-cych zwalczania biofilmów jest podejmowanie wszelkich działań limitujących adhezję bakterii i postępujące two-rzenie się zorganizowanych grup drobnoustrojów. Dotyczy to głównie (chociaż nie tylko) sektora biomateriałów wyko-rzystywanych w praktyce medycznej. Już wiele lat temu za-łożono dwa zasadnicze sposoby działania modyfikowanych biomateriałów, zapobiegające zakażeniom przez biobójczy kontakt adherujących drobnoustrojów (bezpośredni) z po-wierzchnią albo przez zapewnienie długotrwającej dyfuzji z niej produktu bójczego niedopuszczającego do adhezji. Sposoby modyfikacji cech danej powierzchni w celu uzy-skania antyadhezyjności obejmują opłaszczanie, chemiczne
wiązanie lub wprowadzanie do struktury polimeru róż-nych czynników: antybiotyków, peptydów biobójczych, jo-nów metali lub środków dezynfekcyjnych. Jest to wciąż dy-namicznie rozwijający się kierunek badań, a wiele ich rezul-tatów wdrożono już do praktyki medycznej. Są to rozwiąza-nia w głównej mierze dotyczące implantów z dziedziny or-topedii, kardiologii odtwórczej, stomatologii oraz terapeu-tycznego i diagnosterapeu-tycznego stosowania cewników naczy-niowych i urologicznych. Mimo dużego postępu technolo-gicznego w tym zakresie niekiedy obserwuje się brak dosta-tecznej skuteczności urządzeń medycznych o wykończeniu przeciwdrobnoustrojowym. Główną przyczyną takiego sta-nu jest naturalna lub nabyta oporność patogenów na zasto-sowane produkty bójcze, ich zbyt niskie stężenie osiągane w okolicy miejsca zakażenia i/lub zbyt szybka neutralizacja w kontakcie z tkankami/płynami ustrojowymi. W związku z tym do tego kierunku działań dołącza obecnie nurt badań nad opracowaniem bardziej swoistych dróg hamowania ad-hezji drobnoustrojów, poprzez np. wpływ niektórych związ-ków na ekspresję ich adhezyn [6, 7].
HAMOWANIE KOMUNIKACJI MIĘDZYKOMÓRKOWEJ
Innym podejściem, będącym wątkiem przewodnim dru-giego nurtu badań – zwalczania wczesnych mikrokolonii i osłabiania konsolidującej się struktury – jest opracowa-nie sposobów hamowania komunikacji międzykomórkowej drobnoustrojów. Wiadomo, że jeśli utworzona grupa komó-rek jest wystarczająco liczna, wyprodukowane przez nią czą-steczki sygnałowe (autoinduktory) osiągają stężenie progo-we, wystarczające do uruchomienia procesu quorum sen-sing (QS). Pozwala to im na zsynchronizowane pobudzenie ważnych dla drobnoustrojów szlaków metabolicznych oraz na nasilenie ekspresji licznych genów związanych z patogen-nością. Pod kontrolą systemu QS pozostaje również funk-cjonowanie genów regulujących powstawanie biofilmów i produkcję polimeru zewnątrzkomórkowego. Dlatego też próbę wygaszania/zakłócania komunikacji drobnoustrojów (ang. quorum sensing-quenching) uznano kilka lat temu za perspektywiczną strategię terapeutyczną [8–10]. Ten kie-runek dociekań naukowych jest równie zróżnicowany jak opisany wcześniej i obejmuje próby zapobiegania wydziela-nia autoinduktorów, ich chemicznej inaktywacji czy hamo-wania przesyłania/odbierania sygnału. W powyższych ce-lach wykorzystuje się naturalne (roślinne, zwierzęce) inhibi-tory cząstek QS i wzorowane na nich produkty syntetyczne. Przegląd bazy danych dowodzi istnienia ponad 1500 pro-duktów o potencjalnym zastosowaniu terapeutycznym [11]. Pierwszymi opisanymi preparatami tego typu były haloge-nowane furanony otrzymane z australijskiej czerwonej algi
Delisea pulchra. Podobne substancje odkryto u innych
ro-ślin morskich, np.: zielonej algi Ulva lactuca, słodkowod-nych glonów z rodziny zielenic (np. Chlamydomonas spp.
oraz Chlorella spp.) czy u niektórych grzybów pleśniowych (Penicilium spp.). Wiele roślin wyższych, grzybów oraz bak-terii jest bogatym źródłem zarówno analogów bakteryjnych autoinduktorów hamujących QS, jak i analogów o działa-niu stymulującym. Ostatnio produkcję inhibitorów quorum sensing zaobserwowano również w komórkach nabłonko-wych błon śluzonabłonko-wych i fagocytach człowieka, co implikuje ich możliwe wykorzystanie terapeutyczne [10].
SPOSOBY ERADYKACJI UTWORZONYCH BIOFILMÓW
– NOWE STRATEGIE DOSTARCZANIA LEKÓW
Trzeci oraz czwarty kierunek badań, obydwa obecnie naj-bardziej rozwojowe, opierają się na poszukiwaniu alternatyw dla tradycyjnego zwalczania (antybiotykoterapii) utrwalają-cych się lub już utrwalonych zakażeń, w których tle funk-cjonuje biofilm. W swoich założeniach działania te opiera-ją się na zastosowaniu nieantybiotykowych czynników bój-czych lub biostatycznych – naturalnych lub ich odpowiedni-ków syntetycznych. Głównym celem w tym zakresie są także poszukiwania synergistycznych połączeń tych preparatów z klasycznymi terapeutykami oraz nowoczesnych sposobów dostarczania klasycznych i alternatywnych leków do wnę-trza biomasy. W centrum zainteresowania tego nurtu znaj-duje się potencjalne zastosowanie zjawisk elektrochemicz-nych, akustycznych i fotodynamicznych wzmacniających działanie kombinacji danych produktów. Na uwagę zasłu-guje także coraz powszechniejsze wykorzystanie jako nośni-ków lenośni-ków nanobiomateriałów lipidowych (liposomy/nano-liposomy) lub polimerowych (dendrymery). To ostatnie po-dejście wydaje się najbardziej perspektywiczne, ponieważ zakłada połączenie leku z takim nośnikiem, który mógłby w sposób kontrolowany i ukierunkowany łatwiej penetro-wać strukturę biofilmu. Stosunkowo niedawnym odkryciem
w dziedzinie technologii liposomowych są liposomy (ang.) stealth, nazywane tak z racji zmniejszonej wykrywalności dla układu immunologicznego, a co za tym idzie – przedłu-żonego czasu krążenia. Aby uczynić je niewidzialnymi dla komórek immunokompetentnych, modyfikuje się ich po-wierzchnię (umieszczając reszty cukrowe – glikolipidy, gan-gliozydy) lub używa się glikolu polietylenowego, limitując opsonizację liposomów i ich wiązanie z białkami osocza. Li-posomy stealth mają więc – w porównaniu do zwykłych li-posomów – znaczące zalety, takie jak dostarczanie leków do miejsc docelowych w dużej ilości, uwalnianie prepara-tu (zależnie od potrzeb) szybkie lub powolne (które można kontrolować poprzez modyfikację właściwości błony) oraz dłuższy czas półtrwania. Innym rozwiązaniem jest zastoso-wanie w tym samym celu nanoliposomów, mających z uwa-gi na małe rozmiary przewagę nad ich klasyczną postacią je-śli chodzi o możliwość dotarcia do miejsc docelowych. Jak wspomniano wcześniej, w celu ukierunkowanego transpor-tu leków (transpor-tu do struktranspor-tury biofilmu) mogą być też zastosowa-ne dendrymery, których rozgałęziona trójwymiarowa budo-wa zapewnia nie tylko wydajne połączenie dużej liczby czą-steczek leku, lecz także nie ogranicza możliwości efektywnej penetracji miejsca docelowego działania [3, 6, 12–15].
Innymi nośnikami leku mogą być: wszczepialne poli-merowe mikrocząsteczki, rusztowania włókienkowe (dys-ki, pręci(dys-ki, pelety), micele, gąbki kolagenowe, żele termo- odwracalne itp. Wykonane są zwykle z kopolimerów lakty-du i glikolilakty-du, polilaktylakty-du, racemicznego polilaktylakty-du, po-limetylometakrylanu, fosforanu wapnia (hydroksyapaty-tu). Niektóre z tych nośników mogą być bardzo wydaj-ne w uwalnianiu wysokich stężeń antybiotyków (powyżej MIC), a na dodatek po pewnym czasie mogą być biodegra-dowalne (polilaktyd, racemiczny polilaktyd, hydroksyapa-tyt). Zastosowanie biodegradowalnych nośników sprawdza
sowanych interwencji. 1– 2. Chemiczne czynni-ki antyadhezyjne/hamowanie ekspresji adhe-zyn. 3. Czynniki biobójcze, inhibitory quorum sensing, hamowanie/degradacja EPS. 4. Degra-dacja EPS, czynniki biobójcze. 5. Czynniki bio-bójcze, dezintegracja struktury, neutralizacja produktów metabolizmu drobnoustrojów.
się już w praktyce, np. w zapobieganiu miejscowym zakaże-niom ortopedycznym. Podobne zastosowanie mają nośni-ki polilaktydowe, przeznaczone przykładowo do miejscowej (dokieszonkowej) prewencji/leczenia zakażeń tkanek przy-zębia (periodontitis) [7, 14].
Niewątpliwie ważne miejsce w aktualnie prowadzonych badaniach dotyczących nośników leków zajmuje analiza efektywności modyfikowania biomateriałów przez ich po-wlekanie materiałami mezoporowatymi. Są one często kla-syfikowane według rodzaju substancji wyjściowych (np. or-ganiczne lub nieor(np. or-ganiczne), dając w efekcie materiały dzie-lone na polimerowe, węglowe, glino-krzemianowe, tlen-ki czy materiały metaliczne. Dziętlen-ki postępom w opracowa-niu sposobów funkcjonalizacji materiałów mezoporowa-tych możliwa jest adsorpcja na nich różnych biomolekuł, co wzbudza zrozumiałe zainteresowanie różnych gałęzi far-macji i medycyny. Obecnie na szeroką skalę stosuje się me-zostrukturalne materiały porowate posiadające pory o sto-sunkowo wąskim rozkładzie średnic, mieszczących się w za-kresie wielkości od 2 do 50 nm. Najbardziej popularnymi materiałami mezoporowatymi są krzemionki typu MCM (ang. mobil composition of matter), zsyntezowane po raz pierwszy w 1992 roku przez naukowców firmy Mobil. No-śniki te otrzymuje się metodą zol-żel z użyciem surfaktan-ta albo kopolimeru blokowego tworzącego templat. Posia-dają one uporządkowaną, jednorodną strukturę o śred-nicy porów około 3 nm, dużą porowatość (objętość kana-łów około 1,0 cm3/g) oraz ogromne pole powierzchni
wła-ściwej (do około 1000 m2/g). Rozważa się ich
zastosowa-nie np. jako materiału do wytwarzania implantów kostnych, a nawet wykorzystanie jako inteligentnych nośników sub-stancji aktywnych do celów medycznych i kosmetycznych. Już pierwsze próby adsorbowania wewnątrz porów mody-fikowanych krzemionek cząsteczek biologicznie czynnych dały zaskakująco dobre rezultaty. Stwierdzono efekty tera-peutyczne zarówno w odniesieniu do leków przeciwzapal-nych, jak i przeciwdrobnoustrojowych. Zaletą ich zastoso-wania może być bardzo trwały efekt leczniczy tak zmody-fikowanej powierzchni, co więcej kontrolowany tempem uwalniania zdeponowanych leków [16, 17].
Z uwagi na wciąż rosnącą oporność drobnoustrojów w ogóle – a w biofilmie szczególnie – coraz częściej propo-nuje się, jak wspomniano wcześniej, testowanie skuteczno-ści terapeutycznej naturalnych produktów wchodzących m. in. w skład układu obronnego drobnoustrojów, roślin i zwie-rząt. Ich zaletą może być działanie niezależne od profilu le-kowrażliwości danego drobnoustroju, od spójności i zróż-nicowania struktury biofilmu i od sposobu aplikacji. Nie znaczy to, że produkty nieantybiotykowe mogą w pełni za-stąpić znane antybiotyki czy chemioterapeutyki, ale wyda-je się, że będą mogły z powodzeniem wzmacniać lub uzu-pełniać ich działanie. Jednym z bogatych źródeł aktywnych
czynników biobójczych wydają się być też same mikroorga-nizmy, z których wiele wykazuje zdolność swoistej elimina-cji komórek docelowych innych drobnoustrojów. Na szcze-gólną uwagę zasługuje rodzina hydrolaz ściany komórkowej bakterii, obejmująca grupę autolizyn bakteryjnych, wiroli-zyn bakteriofagów czy grupę lizozymów prokariotycznych lub eukariotycznych (bakteriocyny, kationowe i anionowe peptydy przeciwdrobnoustrojowe) [4, 5].
Niezwykle ciekawym podejściem do walki z biofilmami jest coraz częściej podnoszone w literaturze wykorzystywa-nie – jako narzędzi nowoczesnej fitoterapii – osiągnięć far-makognozji, farmakokinetyki i farmakodynamiki. Niewąt-pliwie bardzo obiecującą strategią zwalczania biofilmów jest także dynamicznie rozwijająca się dziedzina światłolecznic-twa – terapia fotodynamiczna (ang. photodynamic antimi-crobial chemotherapy – PACT), znana dotąd bardziej w po-mocniczej terapii nowotworów [6, 18]. Część powyższych zagadnień była tematem poprzednich opracowań Autorów, zostaną więc one pominięte w niniejszym przeglądzie [1, 3]. Poniżej w skrócie podjęto się próby zaprezentowania aktu-alnych danych dotyczących zalet i ograniczeń przeciwbiofil-mowego wykorzystania peptydów biobójczych.
PEPTYDY BIOBÓJCZE W ZWALCZANIU
BIOFILMÓW JAKO ALTERNATYWA DLA
CHEMIOTERAPEUTYKÓW
Mechanizmy odporności nieswoistej zwierząt i człowie-ka obejmują – obok barier fizycznych – także produkcję bardzo licznych przeciwdrobnoustrojowych białek i pepty-dów kationowych/anionowych (ang. antimicrobial peptides – AMP). Z uwagi na powszechność ich występowania i sku-teczność działania rozważanie ich użycia w pomocniczej te-rapii „trudnych” zakażeń jest jak najbardziej uzasadnione. Produkty te stanowią zróżnicowaną grupę cząsteczek, któ-re konstytutywnie lub w odpowiedzi na zakażenie są synte-tyzowane przez wiele typów komórek/tkanek zwierząt i ro-ślin. W organizmie człowieka ważnym źródłem AMP są nie tylko ziarnistości cytoplazmatyczne fagocytów i płytek krwi, lecz także komórki nabłonkowe o różnej lokalizacji tkanko-wej/narządowej. Istotnymi cechami takich peptydów jest zdolność do szybkiego zabijania komórek mikroorgani-zmów, często niska cytotoksyczność oraz aktywność prze-ciwko niektórym patogenom opornym na działanie kon-wencjonalnych antybiotyków. Zakres działania większości znanych AMP jest nieporównywalnie szerszy niż antybioty-ków – obejmuje bakterie, grzyby i pierwotniaki. Jest to nie-wątpliwa zaleta oczekująca na wykorzystanie, chociaż wiele peptydów biobójczych posiada już od dawna ustaloną pozy-cję terapeutyczną [19–22].
ANTYBIOFILMOWE DZIAŁANIE PEPTYDÓW
PRZECIWDROBNOUSTROJOWYCH,
OPORNOŚĆ NA ICH DZIAŁANIE
Budowa, klasyfikacja i przede wszystkim mechanizm działania peptydów biobójczych wobec komórek drobno-ustrojów pozostających w zawiesinie lub w postaci małych agregatów należą do wiedzy historycznej zawartej w licz-nych publikacjach przeglądowych. Według klasyfikacji Brodgena wyróżnia się pięć podgrup AMP:
t peptydy anionowe;
t peptydy kationowe o strukturze α-helisy;
t peptydy kationowe bogate w niektóre aminokwasy; t peptydy anionowe i kationowe zawierające reszty
cy-steinowe i mostki disulfidowe;
t peptydy anionowe i kationowe będące fragmentami większych białek [23].
U człowieka głównym typem peptydów biobójczych wy-stępujących w różnorodnych rodzajach komórek jest gru-pa licznych defensyn α, β (należących do grupy czwartej) oraz jedna katelicydyna. Jak wiadomo, mechanizmy dzia-łania AMP obejmują głównie uszkodzenie (destabilizację „płynności”) błony cytoplazmatycznej, zachodzące w róż-ny sposób, zależróż-ny od budowy peptydu i składu osłon ko-mórek docelowych (model „klepek beczki”, pierścieniowy, „dywanowy”, „nieuporządkowanych pierścieniowych po-rów”). Peptydy biobójcze mogą także, po przekroczeniu ba-riery błony cytoplazmatycznej, kumulować się w cytopla-zmie komórki i wywierać istotny wpływ na funkcjonowa-nie ważnych struktur wewnątrzkomórkowych, takich jak: rybosomy, mitochondria czy materiał genetyczny. Skutku-je to zaburzeniem przebiegu szlaków metabolicznych istot-nych dla funkcji życiowych komórki, obniżenia lub zaha-mowania produkcji czynników wirulencji i najczęściej pro-wadzi do jej śmierci [19, 21, 22, 24–26].
Stosunkowo dobrze poznaną i liczną podgrupę AMP (około 550 przedstawicieli), stanowią defensyny. Są to małe peptydy o strukturze β-harmonijki, zawierające zazwy-czaj sześć reszt cysteinowych połączonych trzema mostka-mi disiarczkowymostka-mi. Występują w komórkach żernych krę-gowców (szczególnie w ziarnistościach azurofilnych neu-trofilów), są aktywne wobec bakterii, grzybów i wirusów osłonkowych. Z kolei peptydami o właściwościach biobój-czych, które stały się w ostatnich latach przedmiotem naj-bardziej intensywnych badań pod kątem ich wykorzysta-nia terapeutycznego, są katelicydyny. Wykazują one szero-kie działanie wobec bakterii (zarówno Gram-ujemnych, jak i Gram-dodatnich), oddziałują synergistycznie przeciwbak-teryjnie z defensynami oraz są czynnikiem chemotaktycz-nym dla neutrofilów, monocytów i komórek T, a także mogą wiązać lipopolisacharyd. Są to cząsteczki mediujące również procesy zapalne, wywierające wpływ na proliferację komó-rek, uczestniczące w procesie gojenia się ran, angiogenezy
i uwalnianiu cytokin. U człowieka wykazano dotychczas obecność tylko jednej katelicydyny – hCAP 18, zdepono-wanej w ziarnistościach komórek nabłonkowych, tucz-nych, granulocytach, monocytach, limfocytach. Pod wpły-wem proteazy serynowej 3, z natywnej cząsteczki uwalnia-ny jest aktywuwalnia-ny peptyd – LL-37. Wzrost zainteresowania in-nym przeciwbakteryjin-nym peptydem kationowym – indoli-cydyną – jest uzasadniony jego nietypową (liniową) budową i składem oraz faktem, iż wykryto go również (stosunkowo niedawno) w komórkach człowieka. Jest to tylko 13-amino-kwasowy kationowy peptyd zawierający unikalną kompo-zycję aminokwasów, z których 39% stanowi tryptofan, 23% – prolina, zaś na końcu karboksylowym znajduje się gru-pa amidowa. Naturalna indolicydyna wykazuje działanie zarówno przeciwko bakteriom Gram-dodatnim, jak i Gra-m-ujemnym. Możliwe są jednak liczne modyfikacje w obrę-bie końca karboksylowego, powodujące zwiększenie zakresu jej działania. Uważa się, że zawartość pięciu reszt tryptofa-nu i aż trzech podjednostek proliny (wśród pozostałych pię-ciu aminokwasów budujących cząsteczkę) determinuje sil-nie hydrofobowy charakter peptydu oraz jego dodatni ładu-nek. Taki skład oraz plastyczność tego peptydu może mieć istotne znaczenie dla aktywności biologicznej, objawiającej się szerszym niż innych peptydów zakresem działania prze-ciwbakteryjnego. W centrum zainteresowania osób badają-cych możliwości zwalczania biofilmu są także inne peptydy kationowe – lizozym i laktoferyna. Ulegają one in vivo eks-presji w gruczołach podśluzówkowych, neutrofilach i ma-krofagach (tylko lizozym), gdzie mogą być przechowywane, a następnie wydzielane podczas reakcji zapalnej. Z tych dwu peptydów to laktoferyna jest bardziej „obiecującą” cząstecz-ką, rozważaną jako środek pomocniczy w eradykacji bio-filmu. Zasadniczy mechanizm działania tego białka polega na wiązaniu żelaza niezbędnego do wzrostu bakterii, co po-woduje blokowanie jego dostępności i tworzenie środowi-ska bakteriostatycznego. Jak wynika z wielu badań, laktofe-ryna może zwiększać też działanie przeciwbakteryjne lizo-zymu i niektórych antybiotyków oraz blokować aktywność katalityczną żelaza w tworzeniu wolnych rodników hydrok-sylowych [21, 22, 24–30].
Chociaż nabywanie przez drobnoustroje oporności na AMP jest zdecydowanie wolniejsze i rzadsze niż w od-niesieniu do antybiotyków, to i tak na tyle istotne, aby ten fakt uwzględnić w rozważaniach dotyczących ich potencjału terapeutycznego. Najlepiej poznana jest oporność na dzia-łanie defensyn, która np. u S. aureus polega na modyfikacji struktury ściany i błony komórkowej prowadzącej do zmia-ny powierzchniowego ładunku. Jest to efekt bezpośrednich zmian w strukturze kwasów tejchojowych poprzez dodanie D-alaniny (działanie białek Dlt) i N-acetyloglukozaminy. Podobny rezultat może zależeć od pojawienia się w błonie komórkowej Staphylococcus aureus dodatnio naładowanego „lizynowanego” fosfatydyloglicerolu (L-PG) jako produktu
syntazy lizynofosfatydylo-glicerolowej (MprF), kodowanej przez gen mprF. Dodatkowo produkowany przez S. aureus aktywator plazminogenu – stafylokinaza (SAK) – wykazuje zdolność wiązania ludzkich peptydów kationowych typu de-fensyn, np. HNPs (ang. human neutrophile peptides) i sty-mulacji ich wydzielania z neutrofilów. Tworzenie komplek-sów SAK/HNPs skutkuje utratą aktywności bójczej defen-syn, co zwiększa i tak dużą oporność gronkowców na dzia-łanie fagocytów [20, 31, 32]. Podobny mechanizm wystę-puje u Streptococcus grupy A, wzmacniany dodatkowo po-siadaniem białka M i uwalnianiem białka SIC (ang. comple-ment inhibitory protein). Bakterie Gram-ujemne w obronie przed działaniem defensyn są zdolne do modyfikacji składu i struktury błony zewnętrznej, głównie przez acylację lipi-du A LPS (Salmonella enterica, Legionella pneumophila,
Ha-emophilus influenzae). Możliwe jest także dołączanie
cząste-czek arabinozy do reszt forsforanowych w lipidzie A (S.
en-terica sv. Typhimurium, Proteus mirabilis), produkcja
spe-cyficznych białek błony zewnętrznej (adhezyna YadA
Yersi-nia enterocolitica) czy wytwarzanie otoczek (Klebsiella pneu-moniae). Inne mechanizmy oporności na defensyny, a także
na katelicydynę LL-37, obejmują działanie pomp wyrzuto-wych (efluksowyrzuto-wych) oraz wpływ na ekspresję genów kodu-jących syntezę AMP [23].
Oporność populacji biofilmu na działanie AMP jest – podobnie jak w przypadku klasycznych chemioterapeu-tyków – wieloczynnikowa. Zależy w dużym stopniu od ro-dzaju/gatunku drobnoustrojów składających się na bio-film, tj. od ich ewolucyjnie wykształconych lub nabytych właściwości w tym zakresie. Często mechanizmy oporno-ści na peptydy biobójcze w biofilmie są zbieżne z tymi, któ-re wykazują drobnoustroje planktonowe danego gatunku, choć wyrażone silniej (pompy efluksowe, produkcja prote-az, zmiany w strukturach osłon komórki dotyczące głównie ich ładunku). Podobnie też zaznacza się w przypadku bio-filmu korzystna dla drobnoustrojów rola wyprodukowane-go egzopolimeru, składającewyprodukowane-go się ze zwykle dodatnio na-ładowanych polisacharydów (chociaż np. alginian biofilmu
Pseudomonas aeruginosa ma ładunek ujemny), białek lub
ujemnie naładowanych cząsteczek e-DNA [33, 34].
Możliwości wykorzystania AMP w walce z tworzącym się lub już utworzonym biofilmem obejmują (przynajmniej w badaniach in vitro) wszystkie etapy jego powstawania: począwszy od zapobiegania adhezji, przez hamowanie for-mowania mikrokolonii i konsolidacji grup drobnoustrojów z udziałem EPS, po ingerencję w dojrzewanie biofilmu, sty-mulowanie jego sukcesywnej dyspersji, ale też neutralizację uwalnianych modulin/egzo- lub endotoksyn [20]. Strategie te przedstawiono chematycznie na Ryc. 2.
Spodziewane bardziej powszechne zastosowanie AMP w celu zwalczania biofilmów obarczone jest jednak pew-ną dozą ryzyka dotyczącego wzbudzenia efektów niepożą-danych, które ujawniają się (lub mogą ujawnić się) podczas
zastosowania ich w terapii in vivo. W tym zakresie należy rozpatrywać skutki wiązania się peptydów z płynami ustro-jowymi, ich cytotoksyczność, powodowanie lizy erytrocy-tów, oddziaływania często niekorzystnie modulujące „za-chowanie się” komórek immunokompetentnych czy wpływ peptydów biobójczych na ekspresję czynników wirulencji drobnoustroju docelowego. W badaniach Strempela i wsp. opisano oddziaływania typu (ang.) upregulation subletal-nych stężeń peptydu LL-37 i jego pochodsubletal-nych na ekspresję/ poziom produkcji czynników wirulencji P. aeruginosa [35].
STRATEGIE ZWIĘKSZANIA SKUTECZNOŚCI
PRZECIWDROBNOUSTROJOWEJ AMP
Powyższe, po części niezbyt optymistyczne, obserwa-cje skłaniają do poszukiwania dróg modyfikacji peptydów przeciwbakteryjnych poprawiających ich właściwości biolo-giczne i farmakolobiolo-giczne oraz bezpieczeństwo stosowania. Zmiany dotyczące składu, budowy i funkcji mają dostarczyć bardziej stabilnych, efektywnych i bezpiecznych peptydów. Kierunków modyfikacji – i tym samym klas badanych no-wych peptydów – jest co najmniej sześć:
t peptydy mimetyczne – syntetyczne cząsteczki (czę-sto o budowie niepeptydowej) naśladujące wzorce naturalne;
t peptydy hybrydowe złożone z fragmentów biolo-gicznie aktywnych dwu–trzech oryginalnych pep-tydów;
t peptydy kongenerowe – substancje chemiczne spo-krewnione ze względu na budowę, strukturę lub funkcje;
t cyklopeptydy;
t koniugaty peptydów z nośnikiem typu liposomy, mi-cele, przeciwciała, steroidy, kwasy tłuszczowe itp.; t peptydy immobilizowane w różnorodnych
materia-łach matrycowych [15, 36, 37].
Z uwagi na obszerność zagadnienia Autorzy jedynie go sygnalizują i polecają materiały źródłowe.
PODSUMOWANIE
Powyższy przegląd danych pochodzących z piśmiennic-twa służy uzasadnieniu faktu podejmowania szeroko zakro-jonych badań nad alternatywnymi sposobami zwalczania infekcji – szczególnie tych, u których podstaw patogenezy leży utworzenie biofilmu. Wiadomo, że wzrost drobnoustro-jów w postaci biofilmu prawie zawsze prowadzi do wyraźne-go zwiększenia oporności na zastosowane chemioterapeu-tyki. Wymusza to poszukiwanie nie tylko nowych skutecz-niejszych leków, lecz także sposobów zwiększania aktywno-ści znanych preparatów, w tym ich nowych formulacji. Pep-tydy bójcze omawiane szeroko w niniejszym opracowaniu
są uważane za szczególnie obiecujące środki terapeutycz-ne o potencjale przeciwbiofilmowym. Natywterapeutycz-ne AMP nie są pozbawione wad, takich jak: wiązanie ze składnikami pły-nów ustrojowych, cytotoksyczność, aktywność hemolitycz-na, podatność na proteolizę, możliwe generowanie oporno-ści drobnoustrojów. Chociaż ewolucyjnie rzecz ujmując roz-wój oporności na peptydy biobójcze jest zdecydowanie wol-niejszy niż na antybiotyki, to i tak niepokoi fakt koniecz-ności podejmowania coraz większych wysiłków w celu jego zniszczenia. Na tym polu, dzięki osiągnięciom technik che-micznych i dynamicznemu rozwojowi bioinformatyki, no-tuje się wyraźny postęp skutkujący przygotowaniem AMP o ulepszonych właściwościach biologicznych.
Powodzenie wdrożenia nowych strategii zwalczania wie-lolekoopornych patogenów tworzących biofilmy w przy-szłości będzie zależne w dużej mierze od optymalizacji wa-runków otrzymywania i modyfikacji preparatów terapeu-tycznych. Nie bez znaczenia będzie wypracowanie parame-trów dających podstawę do standaryzacji wyznaczników określających ich skuteczność wobec biofilmów. Działania służące zwalczaniu biofilmów będą także zależne od ujed-nolicenia modeli badawczych ex vivo, maksymalnie wiernie odtwarzających warunki fizjologiczne lub (najlepiej) odpo-wiednio dobranych modeli in vivo.
KONFLIKT INTERESÓW: nie zgłoszono.
DEKLARACJA PRZEJRZYSTOŚCI: Praca częściowo finansowana z projektu NCN Nr PRO-2013/09/N/NZ6/00826 (dla B.M.)
PIŚMIENNICTWO
1. Różalska B. Biofilmy drobnoustrojów i ich rola w zakażeniach. Sepsis 2008;1(2):49– 53.
2. Trafny EA. Zjadliwość biofilmu i możliwości jej ograniczania za pomocą środ-ków przeciwbakteryjnych. Sepsis 2009;2:183– 187.
3. Różalska B, Walencka E. Alternatywne do antybiotykoterapii sposoby erady-kacji biofilmów. Post Mikrobiol 2008;47(3):371– 378.
4. Parisien A, Allain B, Zhang J, Mandeville R, Lan CQ. Novel alternatives to anti-biotics: bacteriophages, bacterial cell wall hydrolases and antimicrobial pep-tides. J Appl Microbiol 2008;104(1):1– 13.
5. Kostakioti M, Hadjifrangiskou M, Hultgren SJ. Bacterial biofilms: develop-ment, dispersal, and therapeutic strategies in the dawn of the postantibiotic era. Cold Spring Harb Perspect Med 2013;3(4):a010306.
6. Taraszkiewicz A, Fila G, Grinholc M, Nakonieczna J. Innovative strategies to overcome biofilm resistance. Biomed Res Int 2013;2013:150653. 7. Chen M, Yu Q, Sun H. Novel strategies for the prevention and treatment of
biofilm related infections. Int J Mol Sci 2013;14(9):18488– 18501.
8. LaSarre B, Federle MJ. Exploiting quorum sensing to confuse bacterial patho-gens. Microbiol Mol Biol Rev 2013;77(1):73– 111.
9. Romero M, Acuña L, Otero A. Patents on quorum quenching: interfering with bacterial communication as a strategy to fight infections. Recent Pat Biotech-nol 2012;6(1):2– 12.
10. Bhardwaj AK, Vinothkumar K, Rajpara N. Bacterial quorum sensing inhibitors: attractive alternatives for control of infectious pathogens showing multiple drug resistance. Recent Pat Antiinfect Drug Discov 2013;8(1):68– 83. 11. freepatentsonline.com
12. Moghadas-Sharif N, Fazly Bazzaz BS, Khameneh B, Malaekeh-Nikouei B. The effect of nanoliposomal formulations on Staphylococcus epidermidis biofilm. Drug Dev Ind Pharm 2014 [Epub ahead of print].
13. Li C, Zhang X, Huang X, Wang X, Liao G, Chen Z. Preparation and characteri-zation of flexible nanoliposomes loaded with daptomycin, a novel antibiotic, for topical skin therapy. Intern J Nanomedicine 2013;8:1285– 1292. 14. Tamilvanan S, Venkateshan N, Ludwig A. The potential of lipid- and
polymer--based drug delivery carriers for eradicating biofilm consortia on device-rela-ted nosocomial infections. J Control Release 2008;128(1):2– 22.
15. Tavares LS, Silva CS, de Souza VC, de Silva VL, Diniz CG, Santoz MO. Strategies and molecular tools to fight antimicrobial resistance: resistome, transcripto-me, and antimicrobial peptides. Front Microbiol 2013;4:412.
mowego peptydów biobójczych. Górny panel – na etapie adhezji; dolny panel – na etapie tworzenia i dojrzewania biofilmu. Opracowano na podstawie [19], zmodyfikowano.
usa HC. Dexamethasone-loaded poly(ε-caprolactone)/silica nanoparticles composites prepared by supercritical CO2 foaming/mixing and deposition.
Int J Pharm 2013;456(2):269– 281.
17. Li Y, Shi J. Hollow-structured mesoporous materials: chemical synthesis, functionalization and applications. Adv Mater 2014;26(20):3176– 3205. 18. Rajesh S, Koshi E, Philip K, Mohan A. Antimicrobial photodynamic therapy: an
overview. J Indian Soc Periodontol 2011;15(4):323– 327.
19. Aoki W, Ueda M. Characterization of antimicrobial peptides toward the deve-lopment of novel antibiotics. Pharmaceuticals (Basel) 2013;6(8):1055– 1081. 20. Di Luca M, Maccari G, Nifosì R. Treatment of microbial biofilms in the
post--antibiotic era: prophylactic and therapeutic use of antimicrobial peptides and their design by bioinformatics tools. Pathog Dis 2014;70(3):257– 270. 21. Witkowska D, Bartyś A, Gamian A. Defensyny i katelicydyny jako naturalne
antybiotyki peptydowe. Postepy Hig Med Dosw 2008;62:694– 707. 22. Żyłowska M, Wyszyńska A, Jagusztyn-Krynicka EK. Defensyny – peptydy
o aktywności przeciwbakteryjnej. Post Mikrobiol 2011;50(3):223– 234. 23. Brogden KA. Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in
bacteria? Nat Rev Microbiol 2005;3(3):238– 250.
24. Guilhelmelli F, Vilela N, Albuquerque P, Derengowski Lda S, Silva-Pereira I, Kyaw CM. Antibiotic development challenges: the various mechanisms of action of antimicrobial peptides and of bacterial resistance. Front Microbiol 2013;4:353.
25. Bahar AA, Ren D. Antimicrobial peptides. Pharmaceuticals 2013;6(12):1543– 1575. 26. de la Fuente-Nũňez C, Reffuveille F, Haney EF, Straus SK, Hancock RE. Bro-ad-spectrum anti-biofilm peptide that targets a cellular stress response. PLoS Pathog 2014;10(5):e1004152.
27. Brancatisano FL, Maisetta G, Di Luca M et al. Inhibitory effect of the human li-ver-derived antimicrobial peptide hepcidin 20 on biofilms of polysaccharide intercellular adhesin (PIA)-positive and PIA-negative strains of
Staphylococ-cus epidermidis. Biofouling 2014;30(4):435– 446.
mechanism of a potential α-helical antimicrobial derived from cathelicidin PMAP-36. PLoS One 2014;9(1):e86364.
29. Duplantier AJ, van Hoek ML. The human cathelicidin antimicrobial peptide LL-37 as a potential treatment for polymicrobial infected wounds. Front Im-munol 2013;4:143.
30. Noore J, Noore A, Li B. Cationic antimicrobial peptide LL-37 is effective aga-inst both extra- and intracellular Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 2013;57(3):1283– 1290.
31. Kiedrowski MR, Horswill AR. New approaches for treating staphylococcal bio-film infections. Ann N Y Acad Sci 2011;1241:104– 121.
32. Lai Y, Villaruz AE, Li M, Cha DJ, Sturdevant DE, Otto M. The human anionic an-timicrobial peptide dermicidin induces proteolytic defence mechanisms in staphylococci. Mol Microbiol 2007;63(2):497– 506.
33. Lewenza S. Extracellular DNA-induced antimicrobial peptide resistance me-chanisms in Pseudomonas aeruginosa. Front Microbiol 2013;4:21. 34. Folkesson A, Haagensen JA, Zampaloni C, Sternberg C, Molin S. Biofilm
in-duced tolerance towards antimicrobial peptides. PLoS ONE 2008;3(4):e1891. 35. Strempel N, Neidig A, Nusser M et al. Human host defense peptide LL-37 sti-mulates virulence factor production and adaptive resistance in Pseudomonas
aeruginosa. PLoS One 2013;8(12):e82240.
36. Park SC, Park Y, Hahm KS. The role of antimicrobial peptides in preventing multidrug-resistant bacterial infections and biofilm formation. Int J Mol Sci 2011;12(9):5971– 5992.
37. Findlay B, Zhanel GG, Schweizer F. Cationic amphiphiles, a new generation of antimicrobials inspired by the natural antimicrobial peptide scaffold. Antimi-crob Agents Chemother 2010;54(10):4049– 4058.
