Artyku³ przegl¹dowy Review
Cytometria przep³ywowa jest metod¹ pozwalaj¹c¹ na wieloparametrow¹ ocenê populacji komórek uk³a-du immunologicznego. Jej zalet¹ jest mo¿liwoæ pro-wadzenia badañ z wykorzystaniem niewielkich pró-bek materia³u oraz mo¿liwoæ jednoczesnego identy-fikowania cytoplazmatycznych i powierzchniowych antygenów komórkowych. Za pomoc¹ tej metody mo¿-liwe jest okrelenie m.in.: wielkoci komórek, mole-kularnej z³o¿onoci ich budowy, zawartoci kwasów nukleinowych oraz ekspresji okrelonych bia³ek po-wierzchniowych i wewn¹trzkomórkowych (9). Cyto-metria przep³ywowa sta³a siê równie¿ przydatna do analizy komórek immunologicznych wystêpuj¹cych w mleku pochodz¹cym od ró¿nych gatunków zwie-rz¹t. Dziêki analizie cytometrycznej poszczególnych populacji leukocytów w mleku sta³o siê mo¿liwe do-k³adniejsze poznanie mechanizmów odpornoci prze-ciwzakanej gruczo³u mlekowego (16). Badania te przyczyniaj¹ siê równie¿ do lepszego zrozumienia roli zjawisk immunologicznych zachodz¹cych w gruczole mlekowym w przebiegu niektórych chorób, zw³asz-cza wystêpuj¹cego powszechnie u krów zapalenia wymienia (14, 18).
Sk³ad i charakterystyka populacji leukocytów mleka i wydzieliny gruczo³u mlekowego krów, kóz i owiec
w okresie laktacji i zasuszenia
Krowy. W sk³ad mleka pochodz¹cego od zdrowych krów wchodz¹ limfocyty (10-24%), neutrofile (PMN polymorphonuclear cells, 3-26%), komórki nab³on-kowe oraz stanowi¹ce najliczniejsz¹ populacjê makro-fagi (35-79%) (24). Sk³ad procentowy poszczególnych subpopulacji leukocytów w mleku krów w okresie lak-tacji oraz w wydzielinie gruczo³u mlekowego w cza-sie zasuszenia jest odmienny (2). Ponadto w ró¿nych okresach laktacji odsetek poszczególnych populacji leukocytów ulega istotnym zmianom (23). U krów w okresie laktacji w gruczole mlekowym spada ogól-na liczba limfocytów, ale odsetek komórek T, szcze-gólnie w pónej laktacji, wzrasta a¿ do 62%, podczas gdy w okresie zasuszenia i oko³oporodowym kszta³-tuje siê on w granicach 16-33% (2, 13). Sporód lim-focytów T wzrasta g³ównie odsetek limlim-focytów supre-sorowych posiadaj¹cych cz¹steczkê powierzchniow¹ CD8+ oraz receptor áâ, natomiast stosunek limfocy-tów TCD4+/TCD8+ jest mniejszy od 1. W odró¿nie-niu od komórek TCD8+ krwi obwodowej wiêkszoæ
Metoda cytometrii przep³ywowej w ocenie
zdrowotnoci gruczo³u mlekowego prze¿uwaczy
URSZULA LISIECKA, KRZYSZTOF KOSTRO, PAWE£ WOJTASZCZYK, ANDRZEJ ¯MUDAKatedra Epizootiologii i Klinika Chorób Zakanych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej UP, ul. G³êboka 30, 20-612 Lublin
Lisiecka U., Kostro K., Wojtaszczyk P., ¯muda A.
Flow cytometry method in the evaluation of the health status of mammary glands in ruminants
Summary
One of the practical applications of flow cytometry is the possibility of the analysis of leukocyte populations which participate in immunological phenomena in ruminant mammary glands. By use of the flow cytometry method the investigations can be conducted in a quick, precise and highly repeatable manner. Not only the quantitative assessment of immune cells present in milk is possible, but also the assessment of their qualitative variety and particular subpopulation affiliations. The differences in specific subpopulations content which are present in mammary glands in distinct physiological conditions (lactation and dry period) enable a quick and precise evaluation of immunological status and the recognition of mechanisms which take part in the immune resistance of the gland. With flow cytometry analysis of leukocyte surface antigens, apoptosis and phagocytosis, it is possible to understand the function of immune cells and immunological phenomena in mammary glands in conditions of health and disease. Flow cytometry could be successfully applied for moni-toring the intensity of inflammation processes during the course of mastitis and causal and symptomatic therapy effectiveness assessment. Thus it creates new possibilities for developing more efficient treatment and prevention strategies for mastitis, which is of great significance in the dairy industry because of the possibility of preventing economic losses and increasing the safety of dairy products of animal origin.
limfocytów TCD8+ obecnych w mleku wykazuje eks-presjê specyficznej cz¹steczki aktywacji ACT2 okre-lanej równie¿ jako G26, pAT744 i CLL4, która jest obecna tak¿e na ródnab³onkowych limfocytach jeli-towych (IEL), nale¿y do rodziny chemokin i prawdo-podobnie bierze udzia³ w mechanizmach odpornoci wrodzonej. Cz¹steczka ta ulega ekspresji pod wp³y-wem aktywacji przez fitohemaglutyninê, endotoksy-ny bakteryjne i Staphylococcus aureus (1, 12).
Kolejne typy limfocytów T, wystêpuj¹ce w mniej-szej liczbie w okresie laktacji, to komórki T pomocni-cze z receptorem áâ i antygenem CD4+ i komórki T z receptorem powierzchniowym ãä (16). Przyczyna wystêpowania takiej proporcji poszczególnych subpo-pulacji limfocytów T w gruczole mlekowym nie jest dok³adnie poznana. Limfocyty o fenotypie CD8+ mog¹ pe³niæ funkcjê cytotoksyczn¹ lub supresorow¹. Uwa-¿a siê, ¿e zwiêkszona liczba komórek cytotoksycznych CD8+, które usuwaj¹ miêdzy innymi stare lub uszko-dzone komórki wydzielnicze, zmniejsza podatnoæ gruczo³u mlekowego na infekcje spowodowane obec-noci¹ tych komórek. Z kolei komórki supresorowe CD8+ moduluj¹ odpowied proliferacyjn¹ limfocytów o fenotypie CD4+. Zdolnoci immunoregulacyjne lim-focytów CD8+ zmieniaj¹ siê w zale¿noci od okresu laktacji. Analizuj¹c bydlêce limfocyty CD8+ metod¹ cytometrii przep³ywowej stwierdzono, ¿e komórki te bezporednio po porodzie wykazuj¹ wy¿szy poziom aktywacji oraz wiêksz¹ ekspresjê ³añcucha â i mRNA dla interleukiny-4, której obecnoæ w mleku jest cha-rakterystyczna dla komórek supresorowych. Natomiast komórki CD8+ izolowane od krów w rodkowym okre-sie laktacji wykazywa³y aktywnoæ cytotoksyczn¹ oraz ekspresjê mRNA dla IFN-ã.
Z kolei w okresie zasuszenia dominuj¹c¹ subpopu-lacjê stanowi¹ limfocyty TCD4+, za stosunek TCD4+/ TCD8+ istotnie wzrasta i wynosi rednio 4,4 ± 2,2 (1). Komórki o fenotypie CD4+ bior¹ udzia³ w aktywa-cji limfocytów B, limfocytów T, makrofagów oraz in-nych komórek uczestnicz¹cych w odpowiedzi immu-nologicznej. Stosunek limfocytów CD4 : CD8 w tkance i w wydzielinach gruczo³u mlekowego wynosi poni-¿ej 1, w przeciwieñstwie do krwi, w której stosunek ten jest powy¿ej 1 (20).
W tkance gruczo³u mlekowego prze¿uwaczy oraz w jego wydzielinach wystêpuje relatywnie wiêksza liczba limfocytów posiadaj¹cych receptor powierzch-niowy ãä ni¿ we krwi. Funkcj¹ ich jest prawdopodob-nie ochrona powierzchni nab³onkowych, a tak¿e nisz-czenie wadliwych lub uszkodzonych komórek ka gruczo³u mlekowego. Po osi¹gniêciu strefy nab³on-kowej limfocyty te wykazuj¹ niewielki stopieñ migra-cji. Prawdopodobnie porednicz¹ one w procesach cytotoksycznoci z udzia³em cz¹stek MHC, a tak¿e wp³ywaj¹ na aktywnoæ komórek NK. Wykazano, ¿e liczba limfocytów ãä spada w tkance gruczo³u w okre-sach zwiêkszonej podatnoci na choroby, co sugeruje, ¿e mog¹ one pe³niæ zasadnicz¹ rolê w odpornoci
prze-ciwzakanej gruczo³u mlekowego, a w szczególnoci przed infekcjami bakteryjnymi wywo³uj¹cymi masti-tis (20). Limfocyty T w mleku krowim, podobnie jak w mleku ludzkim, posiadaj¹ tak¿e fenotyp komórek pamiêci immunologicznej (16). Natomiast limfocyty B wystêpuj¹ w mleku krowim w niewielkiej liczbie, a ich odsetek pozostaje doæ sta³y w poszczególnych stadiach laktacji. Komórki B prezentuj¹ antygen lim-focytom Th, pod wp³ywem IL-2 przekszta³caj¹ siê w komórki plazmatyczne wytwarzaj¹ce przeciwcia³a oraz maj¹ zdolnoæ do przekszta³cania siê w komórki pamiêci (16).
Kozy. Mleko zdrowych kóz zawiera zwykle wiêcej komórek somatycznych ni¿ mleko krowie, jednak¿e nale¿y podkreliæ, i¿ zawy¿ona liczba komórek soma-tycznych w mleku kóz stwierdzona metod¹ cytometrii przep³ywowej mo¿e byæ spowodowana obecnoci¹ fragmentów komórek wydzielniczych (apokrynowych) gruczo³u mlekowego, które wielkoci¹ s¹ zbli¿one do komórek somatycznych i mog¹ zawieraæ j¹dra komór-kowe. Ich liczba w mleku kóz jest wysoka i wynosi rednio 150 × 103/ml; dla porównania: u owiec jest
10-krotnie ni¿sza i wynosi 15 × 103/ml. W mleku
zdro-wych kóz dominuj¹cym typem komórek s¹ neutrofile, których odsetek wynosi 50-70% wszystkich leukocy-tów mleka, w odró¿nieniu od krów i owiec, u których g³ówn¹ populacjê stanowi¹ makrofagi. U kóz w okre-sie pónej laktacji neutrofile mog¹ stanowiæ nawet 74-80% ogólnej populacji leukocytów i cechuj¹ siê istotnym wzrostem aktywnoci chemotaktycznej w po-równaniu do pocz¹tkowych etapów laktacji. Prawdo-podobnie przyczyn¹ tego jest szybsza migracja neu-trofilów z krwi obwodowej do mleka oraz istnienie odmiennych mechanizmów odpornoci przeciwzaka-nej gruczo³u mlekowego kóz (3). Wysoki odsetek neu-trofilów powoduje, ¿e kozy w porównaniu do innych prze¿uwaczy s¹ bardziej odporne na zapalenie wymie-nia, poniewa¿ komórki PMN stanowi¹ pierwsz¹ liniê obrony przeciwzakanej (8, 22). Po migracji i osi¹g-niêciu wiat³a gruczo³u mlekowego neutrofile kóz maj¹ bardziej pofa³dowan¹ powierzchniê i zawieraj¹ j¹dra o wiêkszej liczbie segmentów w porównaniu do neutrofilów krwi obwodowej. Oko³o 30% z nich ule-ga programowanej mierci w procesie apoptozy b¹d nekrozie. Dla porównania: odsetek neutrofilów krwi obwodowej bêd¹cych w ró¿nych stadiach apoptozy lub nekrozy wynosi zaledwie 8%. Ponadto wytwarzanie rodników ponadtlenkowych w aktywowanych neutro-filach gruczo³u mlekowego rozpoczyna siê wczeniej i trwa krócej, a intensywnoæ ich produkcji jest s³ab-sza w porównaniu z aktywnoci¹ komórek PMN krwi obwodowej (22).
Limfocyty wystêpuj¹ce w mleku kóz ró¿ni¹ siê fenotypowo od limfocytów wystêpuj¹cych we krwi obwodowej kóz i znaczna czêæ z nich przypomina fenotypem komórki pamiêci. Stanowi¹ one oko³o 11 ± 2% ogólnej puli leukocytów. Sk³ad procentowy poszczególnych subpopulacji limfocytów w mleku
kozim w trakcie laktacji ulega istotnym zmianom. Wród populacji limfocytów T wystêpuj¹cych w mle-ku kóz we wczesnych etapach laktacji komórki o fe-notypie CD8+ mog¹ stanowiæ oko³o 61%, natomiast limfocyty CD4+ 17% i oko³o 20% limfocytów T po-siada cz¹steczki zgodnoci tkankowej MHC klasy II. Stosunek limfocytów CD4/CD8 jest odwrócony w po-równaniu do wystêpuj¹cego w krwi obwodowej, mniej limfocytów posiada receptor CD45R oraz L-selekty-nê na swojej powierzchni (7). Odsetek limfocytów B identyfikowany cytometrycznie na podstawie obecno-ci na powierzchni cz¹steczki CD19 wzrasta do 7. dnia laktacji, a nastêpnie od 21. dnia laktacji utrzymuje siê na poziomie 21,5-23,5%. Liczba komórek WC1-N2+, które nie s¹ ani komórkami T, ani B, wzrasta w mleku od 3,33 ± 1,53% w pierwszym dniu laktacji do 25,33 ± 10,81% w 63. dniu laktacji (23). Populacja mono-cytów i makrofagów w mleku kóz stanowi rednio 8,0 ± 2,0% (7).
Owce. Mleko zdrowych owiec zawiera te same po-pulacje leukocytów, co mleko krów, z tym, ¿e domi-nuj¹c¹ populacjê stanowi¹ makrofagi, jednak¿e dane pimiennictwa odnonie do sk³adu subpopulacji leu-kocytów w mleku owiec wskazuj¹, i¿ nie zosta³ on dotychczas precyzyjnie okrelony. Wed³ug Bergonier i wsp. (3), w mleku owiec pochodz¹cym ze zdrowego gruczo³u mlekowego komórki nab³onkowe stanowi¹ poni¿ej 3% ogólnej liczby komórek, neutrofile 10-35%, makrofagi 45-85%, a limfocyty 10-17%. Odsetek wy-mienionych populacji komórek, z wyj¹tkiem okresu siarowego, pozostaje na wzglêdnie sta³ym poziomie przez ca³y okres laktacji. Z kolei, wed³ug danych opi-sanych przez Peersson-Waller i Colditz (14), u owiec w okresie laktacji odsetek neutrofilów wynosi 35,7 ± 13,6, monocytów/makrofagów 23,0 ± 9,2 i limfocy-tów 41,2 ± 11,1. Natomiast sk³ad procentowy tych populacji komórek w wydzielinie gruczo³u mlekowe-go owiec w okresie zasuszenia jest odmienny i kszta³-tuje siê nastêpuj¹co: neutrofile 2,2 ± 2,4, monocyty/ makrofagi 45,7 ± 12,3 i limfocyty 52,0 ± 13,6. Ró¿ni-ce te w du¿ym stopniu determinuj¹ mniejsz¹ podat-noæ gruczo³u mlekowego owiec na infekcje w okre-sie zasuszenia (14).
Sk³ad i charakterystyka populacji leukocytów wydzieliny gruczo³u mlekowego krów
w okresie mastitis
Badania populacji leukocytów w przebiegu masti-tis prowadzone by³y do tej pory g³ównie u byd³a, ze wzglêdu na powszechnoæ wystêpowania choroby, dostêpnoæ materia³u oraz hodowlê tych zwierz¹t pro-wadzon¹ w szerokiej skali na ca³ym wiecie. Ca³ko-wita liczba komórek somatycznych w mleku zdrowych krów jest stosunkowo niska i wynosi oko³o 50 000 komórek/ml. Istotny wzrost liczby komórek jest za-zwyczaj zwi¹zany z zaka¿eniem gruczo³u mlekowe-go, niekiedy przy braku klinicznych objawów zapal-nych (16, 24). We wczesnej fazie rozwoju mastitis,
niezale¿nie od rodzaju zaka¿aj¹cego drobnoustroju, dominuj¹cymi komórkami w tkance gruczo³u mleko-wego i jego wydzielinie s¹ neutrofile, które mog¹ sta-nowiæ powy¿ej 90% ogólnej puli leukocytów. W od-powiedzi na szereg mediatorów zapalnych, takich jak cytokiny, sk³adniki dope³niacza czy prostaglandyny, neutrofile migruj¹ do wiat³a gruczo³u mlekowego, gdzie fagocytuj¹, a nastêpnie przy u¿yciu mechaniz-mów zale¿nych i niezale¿nych od tlenu zabijaj¹ pato-geny. Ponadto s¹ one ród³em defensyn antybioty-ków peptydowych o dzia³aniu przeciwbakteryjnym (20), jednak¿e na skutek nekrozy tych komórek do-chodzi do uwolnienia ich toksycznej zawartoci (m.in. enzymów proteolitycznych) do przestrzeni miêdzyko-mórkowej, co prowadzi do uszkodzeñ delikatnej tkanki wycielaj¹cej przewody wyprowadzaj¹ce gruczo³u mlekowego oraz spadku liczby komórek wydziel-niczych (18). W celu zapobiegniêcia temu neutrofile ulegaj¹ apoptozie, a nastêpnie s¹ fagocytowane przez makrofagi, dziêki czemu nie dochodzi do lokalnej destrukcji tkanek i co prowadzi do zmniejszenia na-tê¿enia miejscowych procesów zapalnych. Niektóre patogeny maj¹ zdolnoæ modulacji procesu apoptozy neutrofilów, co u³atwia progresjê choroby oraz przy-czynia siê do rozwoju zapalenia przewlek³ego. W zro-zumieniu patogenezy mastitis wywo³anego przez kon-kretny drobnoustrój mo¿e byæ wiêc pomocne okrele-nie posiadania przez ten patogen zdolnoci indukcji wzmo¿onej apoptozy neutrofilów (18). Monitorowa-nie kszta³towania siê odsetka neutrofilów w wydzie-linie zapalnej gruczo³u mlekowego mo¿e stanowiæ wa¿ny wskanik prognostyczny odnonie do przebie-gu i zejcia mastitis oraz skutecznoci zastosowanej terapii przyczynowej. Wykazano (15), ¿e jeli w wy-dzielinie zapalnej gruczo³u mlekowego krów utrzy-muje siê wysoka liczba neutrofilów, wówczas lecze-nie mastitis jest zazwyczaj lecze-nieskuteczne. Wydzielina zapalna gruczo³u mlekowego krów z kliniczn¹ posta-ci¹ mastitis, ca³kowicie oporn¹ na antybiotykoterapiê, zawiera³a wiele ¿ywych oraz uszkodzonych komórek PMN, natomiast brak by³o w jej sk³adzie innych ko-mórek immunologicznych. W przypadku efektywnego leczenia po pocz¹tkowej dominacji odsetka neutro-filów obserwowano ich stopniowy zanik, a nastêpnie pojawienie siê limfocytów oraz sukcesywny wzrost liczby monocytów i makrofagów.
Natomiast w dalszym przebiegu mastitis obecnoæ poszczególnych populacji leukocytów determinuje rodzaj zaka¿aj¹cego drobnoustroju. W przewlek³ych stanach zapalnych gruczo³u mlekowego byd³a wy-wo³anych przez Staphylococcus aureus g³ównym typem komórek infiltruj¹cych gruczo³ pozostaj¹ na-dal neutrofile, a ich odsetek kszta³tuje siê w granicach 55-96% ogólnej liczby leukocytów (16, 24). Z kolei w zapaleniu wymienia, którego czynnikiem etiologicz-nym jest E. coli, po pocz¹tkowym obfitym nagroma-dzeniu neutrofilów dominuj¹ komórki jednoj¹drzaste (16).
W chronicznym zapaleniu wymienia u byd³a wy-wo³anym przez S. aureus istotnym zmianom ulega sk³ad subpopulacji limfocytów. Wzrost odsetka lim-focytów B posiadaj¹cych antygen powierzchniowy CD21 wiadczy o udziale humoralnej odpowiedzi immunologicznej w mechanizmach odpornoci prze-ciwzakanej gruczo³u mlekowego. Ponadto wzrasta liczba limfocytów T o fenotypie CD8+, które w chro-nicznym zapaleniu gruczo³u mlekowego odgrywaj¹ prawdopodobnie wiêksz¹ rolê ni¿ limfocyty TCD4+. Ich liczba wzrasta oko³o 1,83-krotnie w porównaniu z oko³o 1,38-krotnym wzrostem liczebnoci subpopu-lacji limfocytów T o fenotypie CD4+. Mimo ¿e liczba limfocytów TCD4+ wzrasta, liczba receptorów CD4 przypadaj¹cych na pojedyncz¹ komórkê ulega znacz¹-cej redukcji. Kolejn¹ charakterystyczn¹ cech¹ zapale-nia wymiezapale-nia powodowanego przez S. aureus jest wzrost odsetka limfocytów posiadaj¹cych antygen zgodnoci tkankowej MHC klasy II odpowiedzialny za prezentacjê antygenów drobnoustrojów limfocytom T. W przebiegu mastitis w porównaniu ze zdrowym gruczo³em mlekowym liczba limfocytów posiadaj¹-cych cz¹steczki MHC II mo¿e wzrosn¹æ ponad trzy-krotnie. Cz¹steczki MHC klasy II wystêpuj¹ g³ównie na powierzchni makrofagów, limfocytów B i komó-rek dendrytycznych, jednak¿e wyniki badañ Riollet i wsp. (16) wskazuj¹, ¿e bydlêce aktywowane limfo-cyty T, szczególnie w zainfekowanym gruczole mle-kowym, wykazuj¹ tak¿e na powierzchni ekspresjê MHC klasy II, co wiadczy, ¿e uczestnicz¹ w prezen-tacji antygenów drobnoustrojów. W trakcie chronicz-nej infekcji S. aureus zwiêkszona ekspresja dotyczy tak¿e cz¹steczek CD2 obecnych na powierzchni lim-focytów T i komórek NK oraz cz¹steczek CD45 na powierzchni wszystkich leukocytów. Ponadto obser-wuje siê zwiêkszony odsetek neutrofilów posiada-j¹cych cz¹steczkê adhezyjn¹ CD18, z tym, ¿e liczba cz¹steczek CD18 na pojedynczej komórce ulega istot-nemu zmniejszeniu w porównaniu do osobników zdro-wych. Spadek liczby tych receptorów na pojedynczym neutrofilu jest m.in. skutkiem wydzielania przez gru-czo³ substancji przeciwzapalnych np. glikokortyko-idów (16). W wyniku zaka¿enia gruczo³u mlekowego krów bakteriami Streptococcus uberis obserwuje siê istotny wzrost lokalnej produkcji cytokin pozapalnych, takich jak TNFá i IL-1, które moduluj¹ natê¿enie reakcji zapalnej w miejscu infekcji bakteryjnej oraz s¹ czynnikiem chemotaktycznym dla zaktywowanych komórek PMN i makrofagów.
Sposób pobrania i przygotowania próbek mleka oraz wydzieliny gruczo³u mlekowego
do analizy cytometrycznej
Mleko dziêki p³ynnej konsystencji oraz swoim w³a-ciwociom stanowi dogodny materia³ do badañ cyto-metrycznych. Do analizy cytometrycznej leukocytów gruczo³u mlekowego oprócz mleka w okresie laktacji przydatne s¹ równie¿ pop³uczyny z gruczo³u
mleko-wego oraz wydzielina pobierana w okresie zasuszenia lub wydzielina zapalna pobierana w czasie wystêpo-wania mastitis. Ogólny schemat przygotowystêpo-wania prób-ki mleka do badañ przedstawia siê nastêpuj¹co: jest ono pobierane podczas porannego udoju, aseptycznie, ze wszystkich czterech æwiartek gruczo³u mlekowego do sch³odzonych wczeniej, sterylnych probówek. W przypadku, gdy badania tego wymagaj¹, probówki, do których pobierane jest mleko, mog¹ zawieraæ anty-biotyk, np. gentamycynê (17). Pobrane próbki mleka transportuje siê w lodzie (14, 23) lub w temperaturze nie wy¿szej ni¿ 4°C i po dostarczeniu do laboratorium powinny byæ one poddane analizie cytometrycznej w czasie nie przekraczaj¹cym 3 godzin od momentu pobrania (9, 17). Próbki mleka rozcieñcza siê w sto-sunku 1 : 1 buforem (PBS, 10% kwany cytrynian dekstrozy (ACD) i 20 mM EDTA), a nastêpnie ca³oæ wiruje przy 350 × g w temperaturze 15°C przez 45 min. (18). Supernatant wraz z warstw¹ t³uszczow¹ zo-staje usuniêty, a zawiesinê komórek pozosta³¹ na dnie probówki przemywa siê trzykrotnie buforem i ka¿do-razowo poddaje wirowaniu przez 10 min. w tempe-raturze pokojowej przy 110 × g (17). Po ostatnim wirowaniu komórki zawieszane s¹ w buforze PBS (9, 14, 23) lub p³ynie do analizy cytometrycznej FACS sheath fluid (15), lub buforze PBS zawieraj¹cym 10% kwany cytrynian dekstrozy (ACD) i 10 mM EDTA (13, 14). Oprócz opisanej metody izolacji ogólnej puli leukocytów z mleka istniej¹ równie¿ metody umo¿-liwiaj¹ce izolacjê poszczególnych ich subpopulacji (13).
Poza okresem laktacji do badañ cytometrycznych u¿ywane s¹ pop³uczyny gruczo³u mlekowego. W tym celu dokonuje siê infuzji sterylnego roztworu soli fizjologicznej po 20 ml do ka¿dej æwiartki (14), a na-stêpnie pobrane pop³uczyny poddaje siê wirowaniu przy 200 × g, w temperaturze 4°C przez 5 minut. Po-zosta³e na dnie probówki komórki zawiesza siê w bu-forze PBS i poddaje siê analizie cytometrycznej iden-tycznie, jak w przypadku leukocytów mleka (17). Przed pomiarem cytometrycznym zarówno komórki mleka, jak i pop³uczyn o stê¿eniu 1-2 × 106/ml inkubuje siê
z odpowiednimi przeciwcia³ami znakowanymi barw-nikami fluorescencyjnymi (8, 9).
Badanie leukocytów w mleku jest mo¿liwe dziêki wydzielaniu grup komórek przy pomocy programu komputerowego tak zwane ustalanie okna, bram-kowanie. Badanie leukocytów polega najczêciej na oznaczaniu ich immunofenotypu, zestawu antygenów ró¿nicowania (CD Cluster Designation, Cluster Differentiation), który jest charakterystyczny dla da-nej populacji komórek. Przy zastosowaniu odpowied-nich przeciwcia³ mo¿na oceniæ zarówno ekspresjê okrelonej cz¹steczki CD na powierzchni ró¿nego typu komórek, jak i ekspresjê ró¿nych antygenów na ko-mórkach jednego typu (10). W obrazie cytometrycz-nym komórek mleka bramka dla monocytów/makro-fagów oraz bramka limfocytów niekiedy czêciowo
nak³adaj¹ siê na siebie, co utrudnia odró¿nienie tych populacji komórek. W tym celu u¿ywa siê przeciw-cia³a monoklonalnego przeciwko cz¹steczce CD14 wystêpuj¹cej tylko na powierzchni monocytów i ma-krofagów, aby w ten sposób wykluczyæ je z analizy limfocytów. W celu dok³adniejszej identyfikacji po-pulacji limfocytów mo¿na zastosowaæ dodatkowe znakowanie przeciwcia³ami specyficznymi dla limfo-cytów o fenotypie CD3+/CD11b lub dla komórek fagocytarnych o fenotypie CD3/CD11b+ (16, 18). Podobnie jak w standardowych badaniach komórek krwi, tak i w badaniu mleka w celu eliminacji auto-fluorescencji stosuje siê kontrolê negatywn¹ (16). Po-niewa¿ mleko mo¿e zawieraæ wiele martwych komó-rek, nale¿y sprawdziæ, czy nie formuj¹ one odrêbnej populacji (8). W tym celu bezporednio przed analiz¹ cytometryczn¹ nale¿y dodaæ do probówek z komórka-mi odpowiedni¹ iloæ jodku propidyny jako komórka- miarodaj-nego wskanika przerwania ci¹g³oci b³ony komórko-wej na skutek uszkodzenia lub mierci komórki (16).
Wykorzystanie metody cytometrii przep³ywowej w ocenie aktywnoci fagocytarnej i bójczej oraz procesów apoptozy i nekrozy leukocytów
gruczo³u mlekowego
Metoda cytometrii przep³ywowej umo¿liwia wczes-n¹ diagnostykê mastitis, nawet przed ujawnieniem siê objawów klinicznych, oraz monitorowanie jego prze-biegu (8, 15, 19). Jest ona szczególnie przydatna w przypadku subklinicznych postaci mastitis, gdy nie dochodzi do zwiêkszenia ogólnej liczby komórek so-matycznych w mleku, a tylko wzrost liczby neutro-filów wiadczy o tocz¹cym siê procesie zapalnym w obrêbie wymienia (15). Oszacowanie sk³adu pro-centowego ¿ywych komórek immunologicznych mle-ka umo¿liwia ocenê natê¿enia procesów zapalnych oraz skutecznoæ zastosowanej antybiotykoterapii (5, 8). Poza badaniem antygenów powierzchniowych leukocytów wystêpuj¹cych w mleku lub wydzielinie mo¿na metod¹ cytometrii przep³ywowej analizowaæ aktywnoæ fagocytarn¹ i bójcz¹ oraz procesy apopto-zy i nekroapopto-zy tych komórek.
Do oceny aktywnoci fagocytarnej u¿ywa siê cz¹s-tek, które s¹ fagocytowane przez komórki ¿erne. S¹ one znakowane barwnikami fluorescencyjnymi (izo-tiocyjanian fluoresceiny FITC, oran¿ akrydyny). W celu okrelenia dok³adnego odsetka komórek fago-cytuj¹cych oraz ich aktywnoci fagocytarnej stosuje siê komercyjny test (Phagotest, Orpegen, Niemcy). Jest to szybki test, który pozwala okreliæ aktywnoæ fagocytarn¹ w niewielkiej objêtoci mleka. G³ównym sk³adnikiem Phagotestu s¹ bakterie E. coli znakowa-ne FITC, opsonizowaznakowa-ne przeciwcia³ami i sk³adowy-mi dope³niacza pulowanej surowicy (26). Natosk³adowy-miast w oparciu o ocenê metabolizmu tlenowego komórki mo¿na wykazaæ, czy materia³ poch³oniêty przez neu-trofile zosta³ zdegradowany. W laboratoriach stosuje siê wystandaryzowany Bursttest (Orpegen), w
któ-rym stymulatorem wybuchu tlenowego jest aktywator N-formylometionyloleucynofenyloalanina (FMLP) oraz opsonizowane komórki E. coli. Aktywnoæ enzy-matyczn¹ mo¿na okreliæ dziêki detekcji intensyw-noci fluorescencji powsta³ej rodaminy 123. Badanie reaktywnych pochodnych tlenu (ROS) umo¿liwia wy-krycie zaburzeñ czynnoci neutrofilów w przebiegu mastitis (10, 26).
Badania wykaza³y, ¿e nawet w zdrowym gruczole mlekowym krów obecne s¹ fagocyty o ró¿nej aktyw-noci fagocytarnej. Zaburzenia prawid³owego proce-su fagocytozy przez komórki ¿erne s¹ odzwierciedle-niem stanu fizjologicznego gruczo³u, za monitorowa-nie zmian zachodz¹cych w aktywnoci fagocytów jest przydatnym wskanikiem oceny zdrowotnoci wymie-nia (18). Podczas laktacji zarówno w mleku krowim, jak i owczym sukcesywnie wzrasta odsetek makrofa-gów oraz komórek PMN, co wiadczy o zwiêkszonej w tym okresie roli fagocytozy jako g³ównego komór-kowego mechanizmu odpornoci nieswoistej gruczo-³u mlekowego (13, 14). Zmianom mo¿e ulegaæ nie tyl-ko liczba tyl-komórek poszczególnych populacji fagocy-tów, ale tak¿e ich stan czynnociowy. W warunkach in vitro wykazano, ¿e makrofagi izolowane z mleka kro-wiego w okresie laktacji nie maj¹ zdolnoci do zabija-nia wewn¹trzkomórkowego Streptococcus uberis, za w okresie pozalaktacyjnym posiadaj¹ tê zdolnoæ, co mo¿e wiadczyæ o zwiêkszonej wra¿liwoci gruczo³u mlekowego na infekcje w okresie laktacji (6).
Makrofagi pe³ni¹ wa¿n¹ rolê w lokalnej odpornoci przeciwzakanej gruczo³u mlekowego oraz uczestni-cz¹ w przebudowie tkanek podczas procesu jego in-wolucji po zakoñczonej laktacji (6). Posiadaj¹ zdol-noæ poch³aniania bakterii, fragmentów martwych komórek oraz nagromadzonych sk³adników mleka. Dziêki obecnoci powierzchniowych cz¹steczek MHC klasy II odgrywaj¹ tak¿e istotn¹ rolê w prezentacji antygenów oraz uczestnicz¹ aktywnie w fazie efekto-rowej odpowiedzi immunologicznej. Zdolnoæ makro-fagów do fagocytozy wzrasta w obecnoci przeciw-cia³ opsonizuj¹cych specyficzne patogeny. Ze wzglê-du na przypadkow¹ fagocytozê t³uszczu, kazeiny oraz innych sk³adników wystêpuj¹cych w mleku aktywnoæ fagocytarna i bakteriobójcza makrofagów gruczo³u mlekowego jest mniej efektywna w porównaniu do leukocytów krwi obwodowej. Aktywnoæ fagocytar-na i bakteriobójcza tych komórek jest istotnie obni-¿ona w okresie oko³oporodowym (20).
Apoptoza jest czynnym procesem, który przyczy-nia siê do regulacji liczby komórek w organizmie. Zachwianie równowagi miêdzy proliferacj¹ komórek a ich mierci¹ prowadzi do powstania licznych cho-rób. W leukocytach apoptotycznych mleka nastêpuj¹ zmiany sk³adu fosfolipidów w b³onie zewnêtrznej komórki pojawia siê tam, przeniesiona z czêci we-wnêtrznej b³ony, fosfatydyloseryna. Do jej wykrycia stosuje siê aneksynê V zwi¹zan¹ chemicznie z barw-nikiem fluorescencyjnym (najczêciej FITC).
Równo-czenie wybarwia siê komórki jodkiem propidyny, któ-ry pozwala oceniæ integralnoæ b³ony komórkowej. Nastêpnie bada siê fluorescencjê za pomoc¹ cyto-metru. Komórki ¿ywe nie barwi¹ siê ¿adnym odczyn-nikiem, komórki nekrotyczne barwi¹ siê jodkiem pro-pidyny, a komórki apoptotyczne barwi¹ siê w ró¿nym stopniu aneksyn¹ V. Komórki barwi¹ce siê jedno-czenie aneksyn¹ V i jodkiem propidyny znajduj¹ siê w pónym stadium apoptozy (5, 11, 19, 25).
Apoptozê leukocytów mleka mo¿na tak¿e badaæ, wykrywaj¹c pêkniêcia ³añcucha DNA w komórkach apoptotycznych. W tym celu stosuje siê trifosforan deoksyurydyny (dUTP) lub bromodeoksyurydyny (Br-dUTP) sprzê¿ony z fluorescein¹ lub digoksygeni-n¹, który przy u¿yciu enzymów, takich jak terminalna transferaza czy polimeraza DNA, jest wbudowywany w miejscach pêkniêæ ³añcucha DNA. Fluorescencja Br-dUTP po³¹czonego z kwasem nukleinowym jest nastêpnie mierzona cytometrycznie. Jest ona propor-cjonalna do liczby pêkniêæ ³añcucha DNA. Ten spo-sób badania apoptozy zwany jest metod¹ TUNEL (25). Za pomoc¹ cytometrii przep³ywowej mo¿liwe jest badanie aktywacji kaspaz (proteinaz cysteinowych) enzymów, które s¹ obecne w leukocytach apoptotycz-nych mleka. Najczêciej wykrywa siê kaspazê 3, sto-suj¹c komercyjne zestawy odczynników (kity), które zawieraj¹ substraty fluorescencyjne, rozszczepiane przez kaspazê.
W mleku znajduje siê du¿o wiêcej komórek PMN w stadium apoptozy ni¿ we krwi obwodowej. Mo¿li-we jest, ¿e sama migracja komórek PMN do wnêtrza gruczo³u mlekowego indukuje proces apoptozy tych komórek (24). Proces apoptozy neutrofilów w masti-tis jest niezwykle istotny, gdy¿ ogranicza on miejsco-we uszkodzenie tkanek, hamuje dalszy rozwój proce-sów zapalnych oraz migracjê zapalnych komórek, co w efekcie prowadzi do os³abienia zapalnej odpowie-dzi immunologicznej (19).
Metoda cytometrii przep³ywowej mo¿e tak¿e zna-leæ zastosowanie w szybkiej i precyzyjnej ocenie re-akcji alergicznych przebiegaj¹cych w gruczole mle-kowym wywo³anych przez ró¿ne czynniki. Odpowied komórkowa i humoralna na antygeny paso¿ytów ma przebieg podobny do zapalenia na tle alergicznym. Bischof i Meeusen (4) wstrzykiwali larwy nicieni Hae-monchus contortus do wnêtrza wymienia zdrowych, dojrza³ych owiec poza okresem laktacji, a nastêpnie prowadzili infuzjê roztworu soli PFS (pyrogen-free saline) i pozyskiwali wydzielinê z gruczo³u mlekowe-go metod¹ udoju rêcznemlekowe-go. Otrzymane w ten sposób komórki zapalne analizowano w okresie 10-96 godzin po pobraniu. W wyniku reakcji alergicznej nast¹pi³a masowa migracja leukocytów do wnêtrza gruczo³u mlekowego. W pierwszej fazie, po 10 godzinach od iniekcji wykrywano du¿¹ liczbê neutrofilów, natomiast w nastêpnym etapie populacja neutrofilów zmniejszy-³a siê znacz¹co na korzyæ eozynofilów i limfocytów. Po 48 godzinach od infuzji eozynofile stanowi³y od
40% do 65% ogólnej populacji leukocytów. Badanie zmian ekspresji markerów powierzchniowych i adhe-zyjnych leukocytów zaanga¿owanych w procesy aler-giczne zachodz¹ce w gruczole mlekowym pozwala zarówno na g³êbsze poznanie i zrozumienie mecha-nizmów immunologicznych odpowiedzialnych za po-wstanie i przebieg reakcji alergicznej, jak i umo¿liwia opracowanie skuteczniejszej terapii przyczynowej.
Cytometria przep³ywowa jako prosta i niezawodna metoda powinna przyczyniæ siê do przyspieszenia prac nad opracowaniem skutecznej szczepionki przeciwko zapaleniu wymienia krów, czego przyk³adem s¹ ba-dania prowadzone przez Leitner i wsp. (9) nad szcze-pionk¹ zawieraj¹c¹ trzy wyselekcjonowane szczepy Staphylococcus aureus pochodz¹ce od krów z masti-tis. Bli¿sze poznanie mechanizmów odpornoci prze-ciwzakanej gruczo³u mlekowego stwarza nowe mo¿-liwoci do opracowania nowych strategii leczenia i za-pobiegania mastitis, co zmniejsza straty ekonomiczne oraz ma ogromne znaczenie w przemyle mleczarskim w zakresie bezpieczeñstwa produktów nabia³owych pochodzenia zwierzêcego (16).
Pimiennictwo
1.Asai K., Kai K., Rikiishi H., Sugawara S., Maruyama Y., Yamaguchi T., Ohta M., Kumagai K.: Variation in CD4+T and CD8+T lymphocyte sub-populations in bovine mammary gland secretions during lactating and non--lactating periods. Vet. Immunol. Immunopathol. 1998, 65, 51-61. 2.Asai K., Komine Y., Kozutsumi T., Yamaguchi T., Komine K., Kumagai K.:
Predominant subpopulations of T lymphocytes in the mammary gland secre-tions during lactation and intraepithelial T lymphocytes in the intestine of dairy cows. Vet. Immunol. Immunopathol. 2000, 73, 233-240.
3.Bergonier D., DeCremoux R., Rupp R., Lagriffoul G., Berthelot X.: Mastitis of dairy small ruminants. Vet. Res. 2003, 34, 689-716.
4.Bischof R. J., Meeusen E. N. T.: Cellular kinetics of an allergic-type response in a sheep mammary gland model of inflammation. Clin. Exp. Allergy 2002, 32, 619-626.
5.Boutet P., Boulanger D., Gillet L., Vanderplasschen A., Closset R., Bureau F., Lekeux P.: Delayed neutrophil apoptosis in bovine subclinical mastitis. J. Dairy Sci. 2004, 87, 4104-4114.
6.Denis M., Parlane N. A., Lacy-Hulbert S. J., Summers E. L., Buddle B. M., Wedlock D. N.: Bactericidal activity of macrophages against Streptococcus uberis is different in mammary gland secretions of lactating and drying off cows. Vet. Immunol. Immunopathol. 2006, 114, 111-120.
7.Guiguen F., Greenland T., Pardo E., Panaye G., Mornex J. F.: Flow cyto-metric analysis of goat milk lymphocytes: subpopulations and adhesion molecule expression. Vet. Immunol. Immunopathol. 1996, 53, 173-178. 8.Koess C., Hamann J.: Detection of mastitis in the bovine mammary gland by
flow cytometry at early stages. J. Dairy Res. 2008, 75, 225-232.
9.Leitner G., Eligulashvily R., Krifucks O., Perl S., Saran A.: Immune cell differentiation in mammary gland tissues and milk of cows chronically infected with Staphylococcus aureus. J. Vet. Med. 2003, 50, 45-52. 10.Owens M. A., Loken M. R.: Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory
Practice. Quality assurance for quantitative immunophenotyping. Wiley-Liss, Inc., New York 1995.
11.Paape M. J., Bannerman D. D., Zhao X., Lee J. W.: The bovine neutrophil: structure and function in blood and milk. Vet. Res. 2003, 34, 597-627. 12.Park Y. H., Fox L. K., Hamilton M. J., Davis W. C.: Bovine mononuclear
leukocyte subpopulations in peripheral blood and mammary gland secretions during lactation. J. Dairy Sci. 1992, 75, 998-1006.
13.Park Y. H., Joo Y. S., Park J. Y., Moon J. S., Kim S. H., Kwon N. H., Ahn J. S., Davis W. C., Davies Ch. J.: Characerization of lymphocyte subpopulations and major histocompatibility complex haplotypes of mastitis-resistant and susceptible cows. J. Vet. Sci. 2004, 5, 29-39.
14.Peerson-Waller K., Colditz I. G.: Expression of surface antigens on blood and mammary leukocytes in lactating and dry ewes. Vet. Immunol. Immuno-pathol. 1998, 62, 273-278.
15.Redelmann D., Butler S., Robison J., Garner D.: Identification of inflamma-tory cells in bovine milk by flow cytometry. Cytometry 1988, 9, 4632-468. 16.Riollet P., Rainard P., Poutrel B.: Cell subpopulations and cytokine
expres-sion in cow milk in response to chronic Staphylococcus aureus mastitis. J. Dairy Sci. 2001, 84, 1077-1084.
17.Rivas A. L., Quimby F. W., Coksaygan O., Olmstead L., Lein D. H.: Longitu-dinal evaluation of CD4+ and CD8+ peripheral blood and mammary gland lymphocytes in cows experimentally inoculated with Staphylococcus aureus. Can. J. Vet. Res. 2000, 64, 232-237.
18.Rivas A. L., Tadevosyan R., Gorewit R. C., Anderson K. L., Lyman R., Gonzalez R. N.: Relationships between the phagocytic ability of milk macro-phages and polymorphonuclear cells and somatic cell counts in uninfected cows. Can. J. Vet. Res. 2006, 70, 68-74.
19.Sladek Z., Rysanek D., Ryznarova H., Faldyna M.: The role of neutrophil apoptosis during experimentally induced Streptococcus uberis mastitis. Veterinarni Medicina Praha 2006, 9, 437-447.
20.Sordillo L. M., Shafer-Weaver K., DeRosa D.: Immunobiology of the mam-mary gland. J. Dairy Sci. 1997, 80, 1851-1865.
21.Smith E., Burvenich Ch., Guitry A. J., Heyneman R., Massart-Leen A.: Diapedesis across mammary epithelium reduces phagocytic and oxidative burst of bovine neutrophils. Vet. Immunol. Immunopathol. 1999, 68, 169--176.
22.Tian S. Z., Chang Ch. J., Chiang Ch. Ch., Peh H. Ch., Huang M. Ch., Lee J. W., Zhao X.: Comparison of morphology, viability and function between blood and milk neutrophils from peak lactating goats. Can. J. Vet. Res. 2005, 69, 39-45.
23.Winnicka A., Kluciñski W., Hoser G., Sikora J., Kawiak J.: Flow cytometry analysis of milk and peripheral blood cells from goats during lactation. J. Vet. Med. 1999, 46, 459-464.
24.Van Oostveldt K., Vangroenweghe F., Dosogne H., Burvenich Ch.: Apo-ptosis and necrosis of blood and milk polymorphonuclear leukocytes in early and midlactating healthy cows. Vet. Res. 2001, 32, 617-622.
25.Vermes I., Haanen C., Steffens-Nakken H., Reutelingsperger C.: A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expres-sion on early apoptotic cells using fluorescein labelled annexin V. J. Immu-nol. Methods 1995, 184, 39-51.
26.Zeman K.: Wykorzystanie cytometrii przep³ywowej do badañ granulocytów obojêtnoch³onnych. Mat. I Konf. Szkolen. Przeciwcia³a monoklonalne w immunologii i diagnostyce. Pu³awy, 5-7 czerwca 1995, s. 99-117. Adres autora: mgr Urszula Lisiecka, ul. Krasiñskiego 12/100, 20-709 Lublin; e-mail: urszula.lisiecka@up.lublin.pl
