Celina Pieszko, Jakub Jeżycki
ZAWARTOŚĆ GARBNIKÓW I POLIFENOLI W NALEWKACH OWOCOWYCH* Katedra Chemii Nieorganicznej, Analitycznej i Elektrochemii
Politechniki Śląskiej w Gliwicach Kierownik dr hab. inż. W. Simka – prof. Pol. Śl.
Zastosowano metody spektrofotometrii UV-VIS do oznaczania kwasu ga-lusowego, garbników skondensowanych oraz całkowitej zawartości polifenoli w 17 próbkach nalewek domowej roboty, różniących się składem, zawartością alkoholu lub dodatkami. Analizę próbek na zawartość garbników hydrolizują-cych przeprowadzono z wykorzystaniem reakcji pomiędzy rodaminą a hydrok-sylowymi grupami kwasu galusowego w środowisku alkalicznym. Natomiast analizę próbek na zawartość garbników skondensowanych przeprowadzono z wykorzystaniem reakcji pomiędzy waniliną a katechiną w środowisku kwa-śnym. Odczynnik Folina-Ciocalteu zastosowano do oznaczania całkowitej za-wartość polifenoli w przeliczeniu na kwas galusowy. Badania potwierdziły, bardzo dużą, bo nawet 30 krotną, różnicę pomiędzy największą a najmniejszą zawartością garbników w badanych próbkach nalewek.
Hasła kluczowe: garbniki hydrolizujące i skondensowane, polifenole, spektrofoto-metria, nalewki owocowe.
Key wodrs: hydrolysable and condensed tannins, polyphenols, spectrophotometry, fruit liqueurs.
Nalewki – alkoholowe wyciągi z owoców, korzeni, kwiatów lub ziół, prze-ważnie o 40% zawartości alkoholu. Wytwarzane są w procesie maceracji czyli zalania składników alkoholem. Mogą być słodzone cukrem, syropem czy miodem. Wytwarza się je z różnych gatunków owoców, np. z gruszki, aronii, malin, jeżyn czy mandarynek, jak również z głogu, pokrzywy, kwiatów słonecznika, kmin-ku czy też bazylii i szałwii (1, 2). Ważną rolę w nalewkach odgrywają garbniki (czasami można się też spotkać z nazwą taniny) głównie ze względu na swoje właściwości prozdrowotne – mają niezwykle silne właściwości antybakteryjne, antywirusowe i antyoksydacyjne (3, 4). Garbniki w nalewkach przechodzą do trunku z owoców (lub innych składników) użytych w procesie ich powstawania. Ich ilość zależna jest od wielu czynników jak np. rodzaju i ilości składników, czasu leżakowania, ilości i rodzaju alkoholu użytego w procesie czy też od obecności dodatków.
* Materiał badań przedstawiono na Ogólnopolskim Sympozjum: Nauka i przemysł – metody spek-troskopowe w praktyce, nowe wyzwania i możliwości, Lublin, 21–23.06.2017.
Celem pracy było zastosowanie szybkiej metody analitycznej do określenia i po-równania zawartości garbników przyswajalnych przez organizm, a występujących w nalewkach owocowych.
MATERIAŁ I METODY
Materiałem do badań było 17 próbek nalewek domowej roboty, różniących się składem, zawartością alkoholu czy też dodatkami (tab. I). Próbki przechowywano szczelnie zamknięte w temperaturze pokojowej, bez dostępu światła, a do analizy pobrano 1–2 cm3 i postępowano zgodnie z procedurami zastosowanymi przy każ-dej z metod oznaczania. Prezentowane badania obejmowały zastosowanie metody spektrofotometrii UV-VIS do oznaczania kwasu galusowego, garbników skon-densowanych oraz całkowitej zawartości polifenoli. Analizę próbek na zawartość garbników hydrolizujących przeprowadzono z wykorzystaniem reakcji pomiędzy rodaminą a hydroksylowymi grupami kwasu galusowego w środowisku alkalicz-nym. Powstały barwny związek reakcji ma intensywną czerwoną barwę, a jego absorbancję mierzono przy długości fali λ=520 nm (5). Natomiast analizę próbek na zawartość garbników skondensowanych przeprowadzono z wykorzystaniem reakcji pomiędzy waniliną a katechiną w środowisku kwaśnym. Absorbancję powstałego czerwonego produktu reakcji mierzono przy długości fali λ=500 nm (6). Odczyn-nik Folina-Ciocalteu zastosowano do oznaczania całkowitej zawartość polifenoli w przeliczeniu na kwas galusowy przy długości fali λ=758 nm (ciemnoniebieska barwa, w zakresie długości fali 700–800 nm) (7). W trakcie badań używano spek-trofotometr UV-VIS HP-8452A fi rmy Hewlett-Packard z matrycą DAD, a wyniki pomiarów odczytywano z krzywych wzorcowych. Obliczenia statystyczne (dla n=9) dokonano w oparciu o program EXCEL, przyjmując przedział ufności na poziomie 95%.
T a b e l a I. Nalewki użyte do badań T a b l e I. The fruit liqueurs used to study
Lp. Główny składnik nalewki Skrót Lp. Główny składnik nalewki Skrót
1 Miód MI 10 Jeżyny JE
2 Płatki dębu DB 11 Żubrowa trawa ZT
3 Śliwki SL 12 Pigwy PI
4 Pomarańcze PO 13 Czerwone porzeczki RP
5 Wiśnie W1 14 Czarne porzeczki BP
6 Wiśnie W2 15 Bez BZ
7 Wiśnie W3 16 Aronia AR
8 Maliny M1 17 Jagody JA
WYNIKI I ICH OMÓWIENIE
Całkowita zawartość polifenoli w przeliczeniu na kwas galusowy (y = 0,0787 x + 0,0301, r2 = 0,9992; LOD = 0,04 μg/cm3, LOQ = 0,13 μg/cm3) była różna w ba-danych próbkach, wahała się w szerokim zakresie od 0,14 do 3,68 mg na cm3 nalewki. Odzysk na poziomie 86–93%. Różnica pomiędzy największą a najmniej-szą zawartością była aż 27-krotna (tab. II). Ponadto, nalewki nawet z tego same-go składnika (wiśni) potrafi ły znacząco różnić się zawartością polifenoli, ma to związek z różnym składem i sposobem przygotowywania. Jak się spodziewano, im ciemniejszą barwę miała nalewka, tym większą posiadała zawartość polifenoli. I tak najmniejszą zawartość stwierdzono w jasnych nalewkach z żubrowej trawy, z miodu, pigwy, płatków dębu, czerwonej porzeczki, śliwki czy pomarańczy a naj-większą w ciemnych nalewkach z wiśni, malin, aronii, jagód czy jeżyn.
T a b e l a II. Zawartość badanych związków
T a b l e II. The results of determination of test compounds
Próbka
Zawartość badanych związków mg/mL ± PU polifenoli CV % garbników skondensowanych CV % garbników hydrolizujących CV % MI 315 ± 29 14,3 43,22 ± 0,28 1,0 18,83 ± 0,31 2,6 DB 440 ± 23 7,9 16,47 ± 0,08 0,7 38,75 ± 0,24 1,0 SL 665 ± 23 5,3 93,56 ± 0,65 1,1 10,46 ± 0,16 2,3 PO 573 ± 56 14,8 176,73 ± 0,88 0,8 10,71 ± 0,09 1,4 W1 1428 ± 82 8,8 362,03 ± 3,54 1,5 21,42 ± 0,23 1,6 W2 1044 ± 64 9,4 410,13 ± 2,47 0,9 20,17 ± 0,26 1,3 W3 2318 ± 148 9,8 352,81 ± 1,89 0,8 – – M1 1511 ± 74 7,5 441,05 ± 2,15 0,8 42,91 ± 0,25 0,9 M2 1239 ± 33 4,1 400,47 ± 2,59 0,9 25,42 ± 0,31 1,9 JE 3677 ± 271 11,3 555,87 ± 3,37 0,9 80,51 ± 0,38 0,7 ZT 135 ± 10 11,9 35,59 ± 0,18 0,8 – – PI 346 ± 25 11,3 128,05 ± 1,04 1,2 – – RP 561 ± 28 7,7 179,96 ± 0,73 0,6 48,41 ± 0,33 1,1 BP 1607 ± 82 7,8 247,45 ± 1,29 0,8 58,48 ± 0,29 0,8 BZ 1383 ± 74 8,2 174,12 ± 1,15 1,0 – – AR 2853 ± 214 11,5 489,83 ± 2,41 0,8 – – JA 2303 ± 189 12,6 579,19 ± 4,34 1,2 140,14 ± 0,63 0,7
PU – przedział ufności dla n=9
Oznaczanie garbników hydrolizujących spowodowało wiele problemów. Na po-czątku przygotowano próbki wg opisanej w literaturze procedury przygotowania próbek wina (8). Niestety w wielu przypadkach otrzymana absorbancja była bar-dzo niska lub widmo absorpcyjne wyraźnie pokazywało, że nie jest to maksimum
otrzymanego barwnego związku. Pobranie do oznaczeń bardziej stężonych pró-bek również nie sprawdziło się, ze względu na własny, intensywny kolor nalewek. W tym wypadku postanowiono zastosować metodę dodatku wzorca. Do próbek, przed dodaniem rodaminy, wprowadzono 4 cm3 roztworu wzorcowego kwasu ga-lusowego o stężeniu 5 μg/cm3.
Po zastosowaniu tej procedury w większości przypadków (11 na 17) zaobser-wowano zwiększenie absorbancji barwnego związku, powstającego w reakcji roz-tworu wzorca z rodaminą w porównaniu z absorbancją tego produktu w próbce nalewki z dodatkiem tego samego wzorca o tym samym stężeniu (ryc. 1). Świadczy to o ogromnym wpływie matrycy w tym zakresie.
Ryc. 1. Widma absorpcyjne wzorca kwasu galusowego o stężeniu 5 μg/cm3 oraz 3 wybranych nalewek
z dodatkiem wzorca kwasu galusowego o stężeniu 5 μg/cm3 po reakcji z rodaminą.
Fig. 1. Absorption spectra of gallic acid standard at the concentration of 5 μg/cm3 and absorption spectra
of 3 selected tinctures with the addition of 5 μg/cm3 gallic acid standard after reaction with rhodamine. Po zapoznaniu się z dostępną literaturą i innymi pracami dotyczącymi ozna-czania garbników natrafi ono na podobny problem podczas oznaozna-czania miodów pitnych (9). Rozwiązaniem tej sytuacji miała być ekstrakcja rozpuszczalnikiem. Jako rozpuszczalnika ekstrakcyjnego użyto octan etylu. Próbkę nalewki ekstraho-wano trzema porcjami octanu etylu. Rozdzielono warstwę wodną od organicznej i odparowano octan etylu. Suchą pozostałość rozpuszczono w wodzie destylowanej w kolbie miarowej poj. 10 cm3. Następnie pobrano do analizy 4 cm3 tak przygo-towanej próbki.
Po zastosowaniu ekstrakcji w 12 przypadkach uzyskano poprawną zależność: większa absorbancja barwnego produktu reakcji próbki z dodatkiem wzorca kwasu
galusowego niż produktu reakcji samego wzorca z rodaminą (ryc. 2). Zakres widm od 360 do 640 nm został wybrany celowo, żeby najlepiej uwidocznić mierzone pasmo absorpcyjne. Dla tych przypadków obliczono zawartość garbników hydroli-zujących przeliczonych na kwas galusowy (y = 0,1116 x – 0,0456, r2 = 0,9949; LOD = 0,09 μg/cm3, LOQ = 0,25 μg/cm3) w próbkach nalewek (tab. II). W pozostałych 5 przypadkach uzyskane absorbancje z dodatkiem wzorca były mniejsze niż sa-mego wzorca. Świadczy to znowu o wpływie matrycy na zawartość garbników. Na podobny przypadek natrafi ono w pracy zajmującej się badaniem garbników w piwie (10).
Ryc. 2. Próbki nalewek po ekstrakcji z dodatkiem wzorca 5 μg/cm3 kwasu galusowego oraz próbka wzorca
5 μg/cm3 kwasu galusowego w reakcji z rodaminą.
Fig. 2. The samples of tinctures after extraction with addition of gallic acid standard at the concentration of 5 μg/cm3 and the sample of 5 μg/cm3 gallic acid standard in the reaction of rhodamine.
Zawartość garbników hydrolizujących w próbkach nalewek wahała się w gra-nicach 10,46–140,14 μg/cm3. Odzysk na poziomie 76–82%. Po raz kolejny moż-na zaobserwować bardzo dużą różnicę w zawartościach garbników w jagodówce i śliwówce.
Jako, że garbniki skondensowane mają wiele różnych skomplikowanych form, najczęściej przeprowadza się ich kwaśną hydrolizę w celu rozbicia ich na podsta-wowe jednostki (katechinę lub epikatechinę), a następnie oznacza zawartość tych związków. W przebadanych próbkach, z wykorzystaniem katechiny jako wzorca (y = 1,9364 x + 0,0871, r2 = 0,9912; LOD = 0,03 μg/cm3, LOQ = 0,10 μg/cm3), za-wartość garbników skondensowanych wahała się w granicach 16,47–579,19 μg/cm3 (tab. II). Odzysk procedury 73–79%. Różnica pomiędzy zawartością największą garbników w jagodówe a najmniejszą w dębówce była aż 35-krotna.
C. P i e s z k o, J. J e ż y c k i
CONTENT OF TANNINS AND POLIPHENOLS IN ALCOHOL INFUSION FRUIT S u m m a r y
UV-VIS spectrophotometry was used to determine gallic acid, tannin, and total polyphenol content in 17 samples of home-made tinctures of different composition, alcohol, and additives content.
The content of hydrolysed tannins was determined after reaction with rhodanine in an alkaline medium, whereas the condensed tannis by reaction with vanillin in an acidic medium.
The Folina-Ciocalteu reagent was used for the determination of the total polyphenol content. The concentration of hydrolyzed tannins in the tincture samples was in range of 10 to 140 μg/mL and the condensed tannins in the range of 16–580 μg/mL. The highest difference in the concentration of hydro-lyzed tannins was observed between berry and plum tinctures. The highest concentration of condensed tannins was determined in (mallow – berry?) tinctures and the lowest in oak liquor. The total polyphenol content varied in the samples tested, ranged from 0.14 to 3.68 mg/mL of tincture.
PIŚMIENNICTWO
1. Wrońska A.: 11 domowych nalewek. Kuchnia-magazyn dla smakoszy, 2016; 5: 1-12. – 2. Klesyk Ł.: Testujemy nalewki z kwiatów. Kuchnia-magazyn dla smakoszy, 2015; 6: 4-8. – 3. Szajdek A., Borowska J.: Właściwości przeciwutleniające żywności pochodzenia roślinnego. ŻYWN-Nauk. Technol. Ja, 2004; 4(41): 5-28. – 4. Paszkiewicz M., Budzyńska A., Różalska B., Sadowska B.: Immunomodulacyjna rola polifenoli roślinnych. Postepy Hig. Med. Dośw., 2012; 66: 637-646. – 5. Muelller-Harvey I.: Analysis of hydrolysable tannins. Anim. Feed Sc. Technol., 2001; 91: 3-20. – 6. Krawczyk P., Drużyńska B.: Porównanie oznaczania zawartości katechin w liściach zielonej i czarnej herbaty metodą wanilinową i metodą HPLC. ŻYWN-Nauk. Technol. Ja., 2007; 5(54): 260-266. – 7. Hagerman A.: The Tannin Hand-book. 1998, 2002, 2011. – 8. Pieszko C., Ogrodowczyk E.: Zawartość garbników i polifenoli w winach. Bromat. Chem. Toksykol., 2010; 43(4): 509-514. – 9. Pieszko C., Grabowska J., Jurek N.: Oznaczanie polifenoli i wybranych pierwiastków w kawie, herbacie i miodach. Bromat. Chem. Toksykol., 2015; 48(4): 653-659. – 10. Pieszko C., Kurek T.: Wpływ procesów przetwórczych na zawartość polifenoli w piwach. Bromat.Chem. Toksykol., 2011; 44(2): 199-203.
