Nukleotydy adenylowe płytek krwi ssaków i trombocytów ptaków

A C T A U N I V E R S I T A T I S L O D Z I E N S I S FOLIA BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA 6, 1988

B a rb a r a W ac h ow i c z

N U K L E O T Y D Y A D EN Y L O W E P Ł Y T E K KRW I S SA K Ó W I T R O M B O C Y T Ó W P TA K ÓW

W trombocytach ptasich, podobnie jak w płytkach krwi ssaków, nukle- otydy adenylowe są zlokalizowane w różnych przedziałach komórki. W

ce-3 lu określenia puli metabolicznej, trombocyty indyka inkubowano z H- '-adeniną. Całkowita radioaktywność w komórce po 1-godzinnej inkubacji przedstawiała poziom nukleotydów puli metabolicznej. Część nukleotydów adenylowych wchodzących w skład tej puli nie przechodzi do 50% etanolu (ok. 5 nmol/10 trombocytów) i stanowi frakcję związaną z F-aktyną.

WSTĘP

T r o m b o c y t y p t ak ó w p o d w z g l ą d e m b u do w y m o r f o l o g i c z n e j , ro zm i ar u or az n i e k t ó r y c h w ł a s n o ś c i są z bl i żo n e d o m e g a k a r i o c y t ó w k r ąż ą c y ch we kr wi s s a k ó w [5], n a t o m i a s t w a s p e kc i e p e łn i on e j fu nk cj i w y k a -zu ją p o d o b i e ń s t w o do k r w i n e k p ł y t k o w y c h s sa k ów [6, 7]. D an e d o t y -cz ą ce i lo ści n u k l e o t y d ó w a d e n y l o w y c h w t r o m b o c y t a c h pta sich, ich r o zm i e s z c z e n i a i roli w ak t yw a c j i są f r a g m e n t a ry c z n e [8, 9]. W c z e -ś n ie j sz e b ad a n i a wy k az ał y, że pu l a m e t a b o l i c z n a n u kl e o t y d ó w a d e -n y l o w y c h w t r o m bo c y t a c h i -nd y ka jest w i ą k s z a a n iż e li o dp o w i a d a ją c a jej p ul a w b e z j ą d r z a s t y c h p ł y t k a c h krw i s s a k ó w [8]. St an o wi on a aż 80% w s z y s t k i c h n u k l e o t y d ó w a d en y l o w y c h o b e c n y c h w tr o m b o cy t a c h

[

] •

MATERIAŁ I METODY

K r e w p o b i e r a n o b e z p o ś r e d n i o z ż ył y s kr z yd ło we j i nd yka d o p l a -s t y k o w y c h p r o b ó w e k z a w i e r a j ą c yc h 0,1 o bj ę t o śc i 3,8% c y t r y n ia n u

t ró j so d ow e go . O so c z e b o g a t o t r o m b o c y t a r n e o t r z y m y w a n o pr ze z w i r o -w a n i e p eł ne j 'kr-wi p rz ez 5 min, 50 x g, w t e m p e r a t u r z e p ok ojow ej

[7]. L i c z b ę k o m ó r e k l i cz o no w k om o r z e Burker a. I n k u b a c j a t r o m b o c y t ó w i nd y k a z 8 3H a d e n i n ą : * 1 m l o s o c z a z a -w i e r a j ą c e g o 2 x 1 0 8 t r o m b o c y t ó -w i n k u b o -w a n o z 10 u mo l 3H - a d e n i n y i 1 2 5 I - a ł b u m i n ą [7]. Po 60 m i n i nk u ba c j i (37 C) p ró b k i n an o sz o n o na 0,2 m l m i e s z a n i n y o l e j u s i l i k o n o w e g o (DC 550 : MS 200, 9 : 1 , v/v) i w i r o w a n o p r z y 12 000 x g. I lo ść o s oc z a z a t r z y m a ne g o pr ze z 125 k o m ó rk i w y l i c z a n o na p o d s t a w i e r a d i o a k t y w n o ś c i I w o s a dz i e t ro mb oc y tó w . Po u w z g l ę d n i e n i u tej w a r t o ś c i w y z n a c z a n o i loś ć a d e -n i -n y w ł ą c z o -n e j d o t r o m b o c y t ó w [7]. T r o m b o c y t y p o i nk u b a cj i z H - a d e n i n ą w i r o w a n o 15 min, 350 x g, n a s t ę p n i e p r z e m y w a n o d w u k r o t n i e z m o d y f i k o w a n y m b u f o r e m T y r o d a i 8 z a w i e s z a n o w t y m s a m y m b u f o r z e d o k o ń c o w e g o s t ę ż en i a 2 x 10 t r o m b o c y t ó w w 1 ml. Z a w i e s i n ę p r z e m y t y c h t r o m b o c y t ó w p o d d a w a n o e k s t r a k cj i 50% e ta n ol em . Z a w a r t oś ć w y e k s t r a h o w a n y c h n u k l e o t y d ó w o z n a c z a -no s p e kt r o f o t o m e t r y c z n i e . C a ł k o w i t ą z a w ar t o ś ć n u k l e o t y d ó w ad e ny l o- w y c h w t r o m b o c y t a c h i nd y ka p r z y j ę t ą za 100% o z n a c z a n o s p e k t r o f o t o -m e t r y c z n i e p o e k s t r a k c j i t r o -m b o c y t ó w k o n t r o l n y c h (bez i n ku ba cj i z 3H - ad e n i ną ) za p o m o c ą k w a s u n ad c hl o r o w e go . WYNIKI I DYSKUSJA C a ł k o w i t a z a w a rt o ś ć n u k l e o t y d ó w a d e n y l o w y c h w trombofcytach i n -d y k a w y n o s i 25 n m o l / 1 0 9 t r o m b o c y t ó w (tab. 1). P ul a m e t a b o l i c z n a s t an o wi ok. 20 n mol (ok. 80%). Po e k s t r a k c j i 50% e t a n o l e m do r o z -t wo r u p r z e c h o d z i ok. 20 n mo l n u k l e o -t y d ó w a d e n y l o w y c h (tab. 1). T a b e l a 1 Rozmieszczenie nukleotydów adenylowych w trombocytach indyka

po inkubacji z 3H-adeniną (n * 4)

Compartmentalization of adenine nucleotides in turkey thrombocytes after labeling w ith 3H-adenine (n “ A)

Całkowita zawartość Pula zmagazynowana Pula metaboliczna Frakcja etanolowa o

nmol/10 trombocytów

25,0 | 5,1 19,9 20,0

nu-k l e o t y d y a de n y lo w e są o be c ne w t r ze c h r ó żn y c h p r z e dz i a ł a c h k o m ó r -ki [1, 2, 3]. D wie t r ze c ie n u k l eo t y d ó w (A DP i ATP) z l o ka l i z o w a -n yc h w ziar-ni,stościach n ie u c z e s t n i c z y w p r o c e s a c h m etab olic znyc h. St an o wi tzw. p ul ą z ma g azy no wa ną , b a r d z o w o l n o w y m i e n i a n ą z nukle - o t yd a m i z n aj d u j ąc y mi si ą p o z a zi a rn i s t o śc i a m i [1].

N u k l e o t y d y o be c n e w c y t o pl a z m i e są g w a ł t ow n i e zn ak ow a ne po in k ub a cj i z r a d i o a k t y w n y m p r e k u r s o r e m (3H - a d e n i n a ) . Po 23 h i n -k u ba c ji r a d io a -k t y w n o ś ć p r e -k u r s o r a jest o be c n a ty l ko w c yt op l az m ie [2], d l a t e g o też o k r eś l e n i e r a d i o a k t y w ny c h n u k le o t y d ó w po tym cz a si e da j e o ce n ą w i e l k o ś c i p uli me ta b ol i cz n ej . Cz ąś ć pul i m e t a b o -licznej nie p r z ec h o d z i do 50% etan olu, kt ór y po w od u j e e ks t ra k c j ą n u k l e o t y d ó w p ul i zm a ga z yn o wa n ej i zna cznej cz ą ś c i p uli m et ab

o-H -a d e n in a * U C -a d e n in a

i

HCLCl

a)

b)

Rys. 1. Rozmieszczenie nukleotydów adenylowych: a) w trombocytach indyka, b) w płytkach człowieka (wg H o l m s e n a [3]) po inkubacji z radioaktywną

adeniną

Fig. 1. Compartraentalization of adenine nucleotides: a) in turkey thrombocytes, b) in human blood platelets (according to H o l m s e n [3]) after

li cznej. T a f r a k c ja n u k l e o t y d ó w a d e n y l o w y c h n i e r o z p u s z c z a l n a w 50% e t a n o l u s kł a d a się g ł ó w n i e z A DP z w i ą za n e g o z F - a k t y n ą [3]. Z n a k o w a n i e r a d i o a k t y w n e i z o t o p e m n u k l e o t y d ó w a d e n y l o w y c h “ko mórki je st m e t o d ą p o z w a l a j ą c ą o c e n i ć r o z m ie s z c z e n i e n u k l e o t y d ó w w k o -m ó r c e [1]. M e t o d ą tą z a s t o s o w a n o do o k r e ś l e n i a f r ak c ji n u k l e o t y -d ó w a -d e n y l o w y c h z w i ąz a n y c h z a k t y n ą t r o m b o c y t ó w indyka. J a k w y k a -zano, 50% e t a n o l p o z w a l a na e k s t r a k c j ą ok. 20 n mo l n u k l e o t y d ó w z 1 09 ko m óre k. M oż n a uw aż ać, że d o e t a n o l u p r z e c h o d z i p ul a z m a g a -z y n o w a n a (5,1 nmol ), a t ak ż e w i ę k s z o ś ć n u k l e o t y d ó w a k t y w n y c h m e -t a b o li c zn i e, -tj. ok. 14,9 n mo l (-tab. 1). Do 50 % e t a n o l u ni e p r z e -c h od z i 5 n mo l n u k l e o t y d ó w w c h o d z ą c y c h w s kł a d p ul i meta bolicznej. N u k l e o t y d y te s t a n o w i ą f r a k c j ą A DP z w i ą za n ą z b i a ł k i e m kurczliwym, F- a kt yn ą. W p o r ó w n a n i u z p ł y t k a m i kr wi cz ło wi e ka , kt ó r e z a w i e r a -ją ok. 0,3 um ol f r ak c ji n u k l e o t y d o we j (ADP) zw ią za ne j z a kt y ną (3), w t r o m b o c y t a c h p t a k ó w ta p u l a n u k l e o t y d o w a jest w i ę k s z a i w y n o s i ok. 0 , 5 n mo l w p r z e l i c z a n i u na 1 0 1 1 k o m ó r e k (rys. 1).

LITERATURA

[ 1] D a n i e l J. L., M o l i s h i R., H o l r a s e n H. (1980), Biochim. Biophys. Acta, 6 3 2 . 444-451.

[ 2] H o 1 m s e n H . , D a y H. J., S t o r m E. (1969), Bio-chim. Biophya. Acta, 1 8 6. 254-263.

[ 3 ] H o 1 m s e n H. (1981), Vox Sang., suppl. 1, 40, 1-7.

[ 4 ] F r e n c h P., W a c h o w i c z B. (1974), Haemostasis, 3, 271-281. [ 5 ] T a b a » s o 1 i M. (1980), Blood, 55, 537-545. [ 6] W a c h o w i c z B.. K r a j e w s k i T. (1979), Thrombos. Haemostas., 42, 1289-1295. [ 7 ] W a c h o w i c z B . (1982), Haemostasis, 11,, 139-148. [ 8] W a c h o w i c z B . , (1984), Celi Biochem. Funct., 2, 167-170.

[ 9 ] W e s e m a n n W., v o n P u s c h I., P a u l N. (1979), Eur. J. Cell. Biol., 19, 26-34.

Zakład Biochemii Ogólnej Instytut Biochemii Uniwersytet Łódzki

Barbara Wachowicz

ADENINE NUCLEOTIDES IN MAMMALIAN PLATELETS AND AVIAN THROMBOCYTES

In avian thtorabocytes, like in mammalian blood plateleta the adenine n u -cleotides are present in three distinguishable compartments. For studies of adenine nucleotide metabolic pool the turkey thrombocytes were prelabeled with

3 '

H-adenine. The level of metabolic nucleotides was follewed by measuring their total radioactivity. Part of the metabolic adenine nucleotide pool was not extracted by 50% ethanol. This ethanol-insoluble fraction (about 5 nmol/

g