Medycyna Wet. 2007, 63 (10) 1251
Praca oryginalna Original paper
Badania wskaników immunologicznych u królików eksperymentalnie zaka¿anych i szczepionych ró¿ny-mi szczeparó¿ny-mi (francuskiró¿ny-mi, polskiró¿ny-mi, czeskiró¿ny-mi, chiñ-skimi i hiszpañskim) wirusa RHD, wykaza³y wywo-³ywanie przez nie odmiennej reakcji immunologicz-nej (3, 6, 7, 10, 12-19). Nale¿y podkreliæ, ¿e oprócz znanych szczepów wirusa RHD, które posiadaj¹ zdol-noci hemaglutynacyjne krwinek czerwonych, stwier-dzono cztery szczepy hiszpañski Asturias (9), an-gielski Rainham (2), niemiecki Frankfurt (11) i polski BLA (8), które nie wykazuj¹ tej cechy (w³aciwoci), co wskazuje na wystêpowanie w grupie tego wirusa szczepów o odmiennym serotypie.
Materia³ i metody
Celem badañ by³o okrelenie zmian w obrêbie wybra-nych wskaników odpornoci naturalnej oraz nabytej, u królików eksperymentalnie zaka¿onych dwoma szczepa-mi RHDV, o odszczepa-miennych w³aciwociach hemaglutyna-cyjnych.
Badania przeprowadzono w dwóch seriach na 60 króli-kach oznaczonych wed³ug norm krajowych jako zwierzêta konwencjonalne, bêd¹ce pod sta³ym nadzorem weteryna-ryjno-zoohigienicznym (1). Pierwsza grupa zwierz¹t (20 sztuk) zosta³a zaka¿ona domiêniowo 1 ml
rozpuszczone-go w ja³owej wodzie destylowanej liofilizatu hemagluty-nogennego szczepu czeskiego CAMP V-351, natomiast druga grupa zwierz¹t (20 sztuk) otrzyma³a analogiczn¹ dro-g¹ niehemaglutynogenny szczep polski BLA wirusa RHD. Szczep CAMP V-351 wirusa RHD pochodzi³ z Banku Mikroorganizmów Instytutu Weterynaryjnego w Brnie (Czechy), natomiast szczep BLA wirusa RHD z kolekcji Zak³adu Pryszczycy w Zduñskiej Woli Pañstwowego Instytutu Weterynaryjnego w Pu³awach i oba pochodzi³y od pad³ych naturalnie królików (12). Wirusy u¿yte do za-ka¿enia zwierz¹t to 20% homogenizaty w¹troby królików zaka¿onych eksperymentalnie, poddane oczyszczeniu i wi-rowaniu oraz liofilizacji wed³ug procedury podanej wcze-niej (12). Miano wirusów okrelano testem hemaglutyna-cji HA i wynosi³o ono w przypadku szczepu czeskiego CAMP V-351 10240. Ka¿dej grupie zwierz¹t zaka¿onych odpowiada³a grupa zwierz¹t kontrolnych w iloci 10 sztuk, którym podano domiêniowo ja³ow¹ wodê destylowan¹ w iloci analogicznej jak u zwierz¹t zaka¿onych, to jest 1 ml. Krew do badañ pobierano z ¿y³y brze¿nej ucha królika w godzinie 0, czyli przed podaniem antygenu wirusowe-go oraz w 4, 8, 12, 24, 36, 48, 52, 56 i 60 h po zaka¿eniu. Badania prowadzono do pojawienia siê pierwszych obja-wów klinicznych charakterystycznych dla pomoru króli-ków. Indeks poch³aniania (IP) i procent komórek poch³a-niaj¹cych (%kp) (PMN) okrelano metod¹ £adosza w
mo-Wskaniki odpornoci u królików eksperymentalnie
zaka¿onych szczepami wirusa RHD o odmiennych
w³aciwociach hemaglutynacyjnych
BEATA TOKARZ-DEPTU£A, PAULINA NIEDWIEDZKA, BEATA HUKOWSKA-SZEMATOWICZ, WIES£AW DEPTU£A
Katedra Mikrobiologii i Immunologii Wydzia³u Nauk Przyrodniczych USz, ul. Felczaka 3c, 71-412 Szczecin
Tokarz-Deptu³a B., Niedwiedzka P., Hukowska-Szematowicz B., Deptu³a W.
Indices of immunity in rabbits experimentally infected with strains of RHD virus differing in haemagglutination properties
Summary
The aim of the study was to monitor alterations in selected indices of innate immunity (the phagocytic index and percent of phagocytes) and acquired immunity (numbers of lymphocytes T and their Th and Tc/Ts subpopulations) in 60 rabbits experimentally infected with haemagglutinogenic Czech strain CAMP V-351 and non-haemagglutinating Polish BLA. The haemagglutinogenic Czech strain CAMP V-351 is active only in select indices of innate immunity, whereas non-haemagglutinating Polish strain BLA is reactive in the parameters of acquired immunity. Therefore, the obtained results permit the conclusion that the examined strains are not only serologically different but they also induce distinct patterns of immune responses, which provides evidence of immunotypes among this virus.
Medycyna Wet. 2007, 63 (10) 1252
dyfikacji Deptu³y i Zemana (12), natomiast liczbê limfo-cytów T i ich subpopulacji oznaczano na cytometrze prze-p³ywowym Fascscan Calibur company, firmy Becton Dickinson z zastosowaniem przeciwcia³ monoklonalnych (mouse anti-rabbit) firmy Serotec dla identyfikacji CD5+ (limfocyt T), CD4+ (limfocyt Th) oraz CD8+ (limfocyt Tc/ Ts) (4).
Wyniki poddano analizie statystycznej testem t-Studen-ta wg programu St-Studen-tatistica wersja 6.0 przy p = 0,05 i przed-stawiono w tab. 1 i 2 w postaci wartoci rednich (x) i od-chylenia standardowego (SD ±).
Wyniki i omówienie
Wyniki statystycznie istotne z zakresu indeksu po-ch³aniania (IP) uzyskane przy hemaglutynogennym szczepie czeskim CAMP V-351 wirusa RHD mani-festuj¹ siê wzrostem przypadaj¹cym jedynie na 52 h obserwacji oraz spadkiem wystêpuj¹cym w 4 i 8 h po zaka¿eniu, za w przypadku procentu komórek poch³a-niaj¹cych (%kp) zarejestrowano tylko jego wzrost w 60 h (tab. 2). W przypadku niehemaglutynogenne-go szczepu polskieniehemaglutynogenne-go BLA nie wykazano zmian
sta-tystycznie istotnych we wskanikach odpornoci na-turalnej, to jest w wartociach IP i %kp (tab. 1). Nato-miast we wskanikach odpornoci nabytej, jak procent limfocytów T, Th i Tc/Ts, w przypadku hemagluty-nogennego szczepu CAMP V-351 wirusa RHD nie stwierdzono zmian statystycznie istotnych (tab. 2), za parametry te przy niehemaglutynogennym szczepie BLA tego wirusa dawa³y zmiany statystycznie istotne i charakteryzowa³y siê wzrostem procentu limfocytów T i Th w 12, 36, 52, 56 h oraz limfocytów Tc/Ts w 12, 24, 36, 48, 52, 56, 60 h (tab. 1).
Uzyskane rezultaty badañ w zakresie indeksu po-ch³aniania (IP) i procentu komórek poch³aniaj¹cych (%kp) przy hemaglutynogennym szczepie czeskim CAMP V-351 i niehemaglutynogennym szczepie BLA mo¿na porównaæ do wyników uzyskanych jedynie przy szczepach hemaglutynogennych, to jest piêciu szcze-pach polskich (Kr-1, MA£, PD, KGM, SGM), dwóch szczepach francuskich (Fr-1, Fr-2) i trzech szczepach czeskich (CAMP V-561, CAMP V-562, CAMP V-558) (3, 7, 12-19). Nale¿y w tym miejscu zwróciæ uwagê na fakt, ¿e wczeniej przebadane szczepy
wi-Tab. 1. Wybrane wskaniki odpornoci naturalnej i nabytej u królików eksperymentalnie zaka¿onych szczepem polskim BLA
y rt e m a r a p e n a d a B h c y n l ó g e z c z s o p w w ó rt e m a r a p i c o tr a W 0 4 8 12 24 36 Z K Z K Z K Z K Z K Z K 0 2 = n n=10 n=20 n=10 n=20 n=10 n=20 n=10 n=20 n=10 n=19 n=10 a k s W inik i c o n r o p d o j e n l a r u t a n a i n a i n a ³ h c o p s k e d n i ). b .l ( 102,,7660 114,,2330 103,,9080 113,,0530 113,,0790 113,,0800 103,,8380 103,,9270 113,,0700 103,,9190 113,,0200 103,,9280 k e r ó m o k % ) p k % ( h c y c ¹ j a i n a ³ h c o p 73,064 74,052 84,934 85,934 95,094 85,932 105,602 74,386 75,949 85,020 85,637 94,093 a k s W inik i c o n r o p d o j e t y b a n + 5 D C T y t y c o f m il ) % ( 489,,3212 5101,,3011 569,,1475 547,,2540 579,,6318 478,,9620 606,,0402* 438,,4065 593,,4320 1514,,7583 537,,2601* 402,,1740 + 4 D C h T y t y c o f m il ) % ( 369,,3566 356,,4690 448,,6073 431,,9360 453,,9278 421,,0755 446,,3202* 355,,8675 582,8,921 1402,,4773 441,,2106* 372,,2985 + 8 D C s T / c T y t y c o f m il ) % ( 250,,2431 149,,1440 133,,5655 113,,1224 132,,3247 92,,1521 148,,1576* 91,,6351 344,,6182* 134,,1323 342,,8769* 92,,7261
Objanienia: Z zwierzêta zaka¿one; K zwierzêta kontrolne; n liczba zwierz¹t; * ró¿nica statystycznie istotna przy p = 0,05
Objanienia: jak w tab. 1.
Tab. 2. Wybrane wskaniki odpornoci naturalnej i nabytej u królików eksperymentalnie zaka¿onych szczepem czeskim
y rt e m a r a p e n a d a B h c y n l ó g e z c z s o p w w ó rt e m a r a p i c o tr a W 0 4 8 12 24 36 Z K Z K Z K Z K Z K Z K 0 2 = n n=10 n=20 n=10 n=20 n=10 n=20 n=10 n=20 n=10 n=19 n=10 a k s W inik i c o n r o p d o j e n l a r u t a n a i n a i n a ³ h c o p s k e d n i ). b .l ( 61,,47 61,,02 51,,39 71,,53* 51,,62 61,,72* 71,,08 60,,48 71,,94 82,,36 17,,92 81,,27 k e r ó m o k % ) p k % ( h c y c ¹ j a i n a ³ h c o p 6113,,92 666,,10 6112,,91 1595,,63 6100,,32 6144,,04 1631,,21 6138,,98 1652,,39 781,,66 1722,,40 7101,,20 a k s W inik i c o n r o p d o j e t y b a n + 5 D C T y t y c o f m il ) % ( 651,,56 668,,56 580,,57 569,,41 4180,,92 579,,02 574,,82 578,,68 672,,96 659,,31 697,,64 6114,,80 + 4 D C h T y t y c o f m il ) % ( 473,,56 414,,83 395,,55 1316,,69 375,,79 365,,95 385,,68 494,,55 483,,62 473,,68 4173,,23 396,,62 + 8 D C s T / c T y t y c o f m il ) % ( 291,,22 2142,,91 159,,94 136,,46 154,,00 134,,92 156,,30 135,,19 252,,67 251,,65 243,,87 240,,54
Medycyna Wet. 2007, 63 (10) 1253
rusa RHD wykazywa³y zró¿nicowan¹ reakcjê uk³adu immunologicznego tak w zakresie parametrów odpor-noci naturalnej (m.in. proces fagocytozy), jak i naby-tej (liczba limfocytów T, B i ich subpopulacji) (15-17, 19). Oceniaj¹c wyniki z zakresu IP przy hemagluty-nogennym szczepie CAMP V-351 manifestuj¹ce siê krótkotrwa³ym wzrostem w 52 h po zaka¿eniu, nale¿y stwierdziæ, ¿e podobne rezultaty zarejestrowano przy szczepie polskim Kr-1 (48 h) (3) i czeskim CAMP V-562 (60 h) (7). Zmiany równie¿ w postaci wzrostu IP, ale d³u¿ej trwaj¹ce rejestrowano przy polskim szcze-pie MA£ wirusa RHD (4, 48 h) (18), szczeszcze-pie PD (8, 52, 56, 60 h) (19), szczepie francuskim Fr-2 (8, 24 h) (18) oraz czeskim szczepie CAMP V-558 wirusa RHD (12, 24 h) (7). Natomiast uzyskany w badaniach w³as-nych przy szczepie czeskim CAMP V-351, spadek wartoci IP przypadaj¹cy na 4 i 8 h dowiadczenia, znajduje potwierdzenie w wynikach uzyskanych przy szczepie polskim PD, gdzie zarejestrowano spadek w 4, 8 h (19) oraz w 56 h przy szczepie francuskim Fr-2 (18). Oceniaj¹c wyniki uzyskane w zakresie %kp przy badanym obecnie hemaglutynogennym szczepie
czeskim CAMP V-351 wirusa RHD, przy którym zarejestrowano jedynie wzrost tego parametru w 60 h dowiadczenia, nale¿y zauwa¿yæ, ¿e zbli¿one by³y one do wyników uzyskanych przy szczepie polskim KGM (36 h), SGM (36 h) oraz MA£ (4, 60 h) (18), a tak¿e przy szczepie czeskim CAMP V-561 (24 h), CAMP V-562 (48 h) i CAMP V-558 (48 h) tego wirusa (7).
Natomiast analizuj¹c wyniki IP uzyskane przy nie-hemaglutynogennym szczepie BLA wirusa RHD, przy którym nie stwierdzono zmian statystycznie istotnych w badanym parametrze, trzeba stwierdziæ, ¿e identyczny obraz rejestrowano przy hemagluty-nogennym szczepie polskim KGM, SGM i francu-skim Fr-1 (18) oraz czefrancu-skim CAMP V-561 (7). Po-nadto brak w obecnych badaniach zmian w war-tociach %kp uzyskany przy szczepie BLA, zgodny jest z wynikiem otrzymanym przy hemaglutynogen-nych szczepach polskich Kr-1 (3) i PD (19) wirusa RHD oraz przy szczepach francuskich Fr-1 i Fr-2 (18). Analizuj¹c wyniki badañ uzyskane w zakresie od-pornoci nabytej mierzonej liczb¹ limfocytów T, Th oraz Tc/Ts, uzyskane przy hemaglutynogennym szczepie CAMP V-351 i niehemaglutynogennym BLA wirusa RHD, mo¿na porównaæ do wyników uzyskanych przy hemaglutynogennym szczepie pol-skim Kr-1 (14), szczepie francupol-skim Fr-2 (15) oraz trzech szczepach czeskich CAMP V-561, CAMP V-562 i CAMP V-558 (7). Brak istotnych zmian w wartociach limfocytów T, Th i Tc/Ts przy obec-nie badanym, hemaglutynogennym szczepie czeskim CAMP V-351 jest zgodny z rezultatami uzyskany-mi przy szczepie czeskim CAMP V-558 (7). Ponad-to przy szczepie czeskim CAMP V-562 uzyskano brak zmian w procencie limfocytów Tc/Ts (7), za przy szczepie francuskim Fr-2 zarejestrowano brak zmian w procencie limfocytów Th i Tc/Ts (14). Stwier-dzony przy niehemaglutynogennym szczepie BLA wzrost procentu limfocytów T i Th (12, 36, 52, 56 h) oraz limfocytów Tc/Ts (12, 24, 36, 48, 52, 56, 60 h), jest zgodny z rezultatami otrzymanymi przy hemaglu-tynogennym szczepie francuskim Fr-2, gdzie tak¿e za-rejestrowano d³ugotrwa³y wzrost limfocytów T (12, 36, 52, 56, 60 h), Th (12, 24, 36, 52, 56, 60 h) i Tc/Ts (8, 12, 36, 56 h) (14). Podobny obraz uzyskano przy hemaglutynogennym szczepie polskim Kr-1 (14), przy którym wzrost dotyczy³ limfocytów T (8, 36, 56 h), Th (36, 48, 52 h) i Tc/Ts (8, 48, 52 h). Zmiany krócej trwaj¹ce, a tak¿e charakteryzuj¹ce siê wzrostem licz-by limfocytów T, Th i Tc/Ts zarejestrowano równie¿ przy hemaglutynogennym szczepie czeskim CAMP V-561, natomiast spadek liczby limfocytów T i Th w 52 h powodowa³ szczep CAMP V-562 (7).
Podsumowanie
Reasumuj¹c mo¿na stwierdziæ, ¿e u¿yte szczepy wirusa RHD ró¿ni¹ce siê zdolnoci¹ hemaglutynacji, powoduj¹ odmienn¹ odpowied immunologiczn¹.
wirusa RHD (x ± SD) h c a n iz d o g 8 4 52 56 60 Z K Z K Z K Z K 9 1 = n n=10 n=19 n=10 n=19 n=10 n=7 n=10 0 7 , 3 1 4 0 , 1 103,,8270 103,,6270 103,,8160 103,,7230 103,,9190 113,,0120 102,,5960 5 5 4 2 , 9 65,676 54,988 64,877 74,875 65,908 74,060 53,877 0 4 , 7 5 4 2 , 2 1 5112,,4964 630,,1575* 420,,1120 4192,,9656* 470,,7815 546,7,432 5100,,3309 2 8 , 9 3 5 5 , 4 389,,8609 580,,3475* 267,,9830 475,,9009* 361,,0115 413,,4860 473,,5742 * 3 8 , 2 2 3 2 , 6 120,,2425 363,,1891* 72,,4255 499,,1714* 29,,5197 397,,3986* 138,,3718 CAMP V-351 wirusa RHD (x ± SD) h c a n iz d o g 8 4 52 56 60 Z K Z K Z K Z K 9 1 = n n=10 n=19 n=10 n=19 n=10 n=7 n=10 3 , 1 1 4 , 4 73,,25 113,,41* 25,,73 05,,47 42,,93 05,,47 51,,05 4 , 7 7 3 , 8 770,,50 1641,,60 784,,00 778,,90 697,,73 880,,62* 580,,45 4 , 2 5 5 , 1 515,,48 567,,78 532,,04 558,,47 508,,82 1540,,47 4150,,20 3 , 1 4 6 , 6 313,,41 307,,45 356,,70 338,,31 3107,,28 376,,62 430,,17 3 , 3 1 1 , 7 261,,69 148,,36 243,,40 210,,84 244,,15 114,,40 147,,98
Medycyna Wet. 2007, 63 (10) 1254
Hemaglutynogenny szczep czeski CAMP V-351 wy-kazuje aktywnoæ jedynie we wskanikach odporno-ci naturalnej (indeks poch³aniania i % komórek po-ch³aniaj¹cych), która jest podobna do tej, jak¹ uzyska-no przy szczepach Kr-1 i CAMP V-562 wirusa RHD, natomiast niehemaglutynogenny szczep polski BLA wzbudza tylko aktywnoæ w zakresie odpornoci na-bytej (iloæ limfocytów T, Th, Tc/Ts), która najbardziej jest zbli¿ona do szczepu Fr-2 tego wirusa. Na podsta-wie uzyskanych wyników mo¿na stpodsta-wierdziæ, ¿e szcze-py wirusa RHD ró¿ni¹ce siê pod wzglêdem serologicz-nym (serotypy), ró¿ni¹ siê tak¿e pod wzglêdem im-munologicznym, co potwierdza³oby rezultaty wielo-letnich badañ w³asnych (3, 7, 12-19), ¿e w obrêbie tego wirusa prawdopodobnie wystêpuj¹ immunotypy (13), na co nie zwraca siê uwagi przy jego charakterystyce biologicznej i systematyce (5).
Pimiennictwo
1.Anon.: Karty informacyjne do za³o¿eñ technologicznych produkcji zwierzê-cej: Zwierzêta laboratoryjne, [w:] Mat. Informacyjno-Szkoleniowe ds. Zwie-rz¹t Laboratoryjnych ZG SITR, Warszawa 1987, 2, 26-77.
2.Chasey D., Lucas M. H., Westcott D. G., Sharp G., Kitching A., Hughes S. K.: Development of a diagnostic approach to the identification of rabbit haemor-rhagic disease. Vet. Rec. 1995, 137, 158-160.
3.Deptu³a W., Kêsy A., Tokarz-Deptu³a B., Stosik M., Travnicek M.: Dynamics of selected parameters in rabbits infected with rabbit haemorrhagic disease virus. Folia Vet. 1999, 42, 17-22.
4.Deptu³a W., Kostrzewa A., Stosik M., Tokarz-Deptu³a B., Wiktorowicz K.: Subpopulacje limfocytów krwi obwodowej u królików. Nowiny Lekarskie 1998, 67, 377-382.
5.Fauquet C. M., Mayo M. A., Maniloff J., Desselberger U., Ball L. A.: Virus Taxonomy. Elsevier Academic Press, Amsterdam 2005.
6.Huang Do Hai-Bo: Vaccination against and immune response to viral haemorrhagic disease of rabbits: a review of research in the Peoples Re-public of China. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 1991, 10, 481-498. 7.Hukowska-Szematowicz B.: Charakterystyka immunologiczno-genetyczna
wybranych szczepów wirusa RHD (rabbit haemorrhagic disease). Praca dok-torska, Wydz. Nauk Przyrod. Uniw. Szczecin., Szczecin 2006.
8.Kêsy A., Fitzner A., Niedbalski W., Paprocka G., Walkowiak B.: A new variant of the viral haemorrhagic disease of rabbits virus. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 1996, 15, 1029-1035.
9.Prieto J. M., Martin J. M., Espi A.: A new non-haemagglutinating strain of rabbit haemorrhagic disease virus. Mat. Konf. 5 Int. Cong. Europ. Soc. Vet. Virol. 2000, s. 204-205.
10.Ramiro-Ibanez F., Martin-Alonso J. M., Garcia Palencia P., Parra F., Alonso C.: Macrophage tropism of rabbit hemorrhagic disease virus is as-sociated with vascular pathology. Virus Res. 1999, 60, 21-28.
11.Schirrmeier H., Reimann I., Kõllner B., Granzow H.: Pathogenic, antigenic and molecular properties of rabbit haemorrhagic disease virus (RHDV) iso-lated from vaccinated rabbits: detection and characterization of antigenic variants. Arch. Virol. 1999, 144, 719-735.
12.Tokarz-Deptu³a B.: Kszta³towanie siê wybranych wskaników odpornoci nieswoistej u królików po zaka¿eniu wirusem VHD (viral haemorrhagic disease). Praca doktorska, PIW Pu³awy 1998.
13.Tokarz-Deptu³a B.: Obraz odpornociowy u królików po zaka¿eniu ró¿nymi szczepami i dawkami wirusa RHD (rabbit haemorrhagic disease) i po poda-niu rekombinowanego TNF-a. Rozprawa habilitacyjna, US Szczecin 2006 (w przygotowaniu).
14.Tokarz-Deptu³a B., Deptu³a W.: Dynamic alterations in peripheral blood lym-phocytes in rabbits experimentally infected with VHD (viral haemorrhagic disease) virus Polish strain Kr-1. Pol. J. Vet. Sci. (Suppl. 3) 2003, 6, 67-69. 15.Tokarz-Deptu³a B., Deptu³a W.: T and B lymphocytes and their subpopula-tions in peripheral blood in rabbits experimentally infected with Fr-2 strain of viral haemorrhagic disease (VHD) virus. Bull. Vet. Inst. Pu³awy 2004, 48, 367-370.
16. Tokarz-Deptu³a B., Deptu³a W.: The immunity during immunization with the viral haemorrhagic disease (VHD) in rabbits. Centr. Eur. J. Immunol. 2004, 29, 58-62.
17.Tokarz-Deptu³a B., Deptu³a W., Kêsy A.: Pomór królików ze szczególnym uwzglêdnieniem zjawisk odpornociowych. Medycyna Wet. 2002, 58, 497--500.
18.Tokarz-Deptu³a B., Hukowska B., Deptu³a W.: Ingestion capacity of PMN cells in peripheral blood of rabbits experimentally infected with VHD (viral haemorrhagic disease) virus strain originating from various biotopes. Pol. J. Vet. Sci. (Suppl. 3) 2003, 6, 271-274.
19.Tokarz-Deptu³a B., Nowaczyk P., Hukowska B., Deptu³a W.: Kszta³towanie siê wskaników nieswoistej odpornoci komórkowej u królików zaka¿onych wirusem VHD (viral haemorrhagic disease) szczep polski PD. Post Mikro-biol. (Supl. I) 2004, 43, 426.
Adres autora: prof. dr hab. Wies³aw Deptu³a, ul. Felczaka 3c, 71-412 Szczecin; e-mail: kurp13@sus.univ.szczecin.pl
