Medycyna Wet. 2008, 64 (8) 966
Artyku³ przegl¹dowy Review
Ocena jakoci mikrobiologicznej produktów ¿ywno-ciowych w oparciu o tradycyjne metody, jak np. kla-syczna metoda p³ytkowa, jest d³ugotrwa³a, poch³ania du¿e nak³ady pracy i materia³ów, a w konsekwencji generuje wiêksze koszty. Priorytetow¹ kwesti¹ jest czas oczekiwania na wynik badañ, szczególnie, jeli mamy do czynienia z produktami ³atwo psuj¹cymi siê. Sys-temy zapewnienia bezpieczeñstwa zdrowotnego ¿yw-noci, takie jak system HACCP, wymagaj¹ szybkiej oceny jakoci mikrobiologicznej, celem podjêcia dzia-³añ eliminuj¹cych zagro¿enia dla zdrowia konsumenta (9, 17).
Jedn¹ z metod, która skraca czas oczekiwania na wynik analizy, jak równie¿ zmniejsza nak³ad materia-³ów i pracy, jest metoda oparta na zjawisku impedy-metrii. Pomiar impedancji lub kondunktancji (przewod-noci) jest miar¹ aktywnoci metabolicznej mikroorga-nizmów w badanej próbce. Impedancja mo¿e byæ zde-finiowana jako opór w stosunku do przep³ywaj¹cego pr¹du zmiennego, który przebiega przez materia³ kon-dukcyjny. Inaczej mówi¹c, impedancja oznacza ca³ko-wit¹ opornoæ (omow¹, indukcyjn¹ i pojemnociow¹), jaka wystêpuje w obwodzie pr¹du zmiennego. Przep³yw sygna³u elektrycznego zale¿ny jest od czêstotliwoci, temperatury, sk³ada siê zarówno z elementów pojem-nociowych, jak i przewodz¹cych (10, 11, 14, 17). Kon-trola temperatury jest bardzo istotna w ka¿dym syste-mie impedymetrycznym, poniewa¿ jej wzrost o 1°C powoduje rednio wzrost o 0,9% pojemnoci i 1,8% kondunktancji (6).
Metoda impedymetryczna idea pomiaru
Mikrobiologia impedymetryczna nie jest now¹ dzie-dzin¹, pocz¹tek jej siêga 1898 r. Podczas spotkania
British Medical Association w Edynburgu Stewart za-prezentowa³ pracê dotycz¹c¹ zmian w molekularnej koncentracji i przewodnoci elektrycznej po¿ywki, wy-wo³anych przez wzrost drobnoustrojów. W nastêpnych latach ukazywa³y siê nieliczne prace dotycz¹ce zagad-nienia mikrobiologii impedymetrycznej, dopiero w po-³owie lat siedemdziesi¹tych przeprowadzono szerzej za-krojone badania nad t¹ technik¹. W Stanach Zjedno-czonych dwie grupy badawcze równolegle prowadzi³y intensywne badania z dziedziny mikrobiologii impedy-metrycznej, co w rezultacie zaowocowa³o opracowa-niem dwóch systemów impedymetrycznych o nazwie Malthus i Bactometer. Od tego czasu poczyniono du¿y postêp, czego odzwierciedleniem jest ukazanie siê po-nad 100 publikacji z zakresu mikrobiologii impedymet-rycznej w ci¹gu ostatnich 10 lat (2).
Wyró¿nia siê bezporedni i poredni pomiar impe-dancji. Bezporedni pomiar polega na zanurzeniu elek-trod w po¿ywce hodowlanej zawieraj¹cej badane mi-kroorganizmy. W wyniku aktywnoci metabolicznej drobnoustrojów, zawartych w badanym materiale, du¿e moleku³y (polisacharydy, bia³ka, t³uszcze) rozpadaj¹ siê na wiele mniejszych, które s¹ na³adowane elektrycznie (kwasy organiczne, aminokwasy, kwasy t³uszczowe). Zmiany w molekularnej kompozycji powoduj¹ wzrost kondunktancji roztworu, g³ównie w wyniku polaryza-cji zanurzonej w roztworze powierzchni elektrody (1, 5, 6, 11, 17). W metodzie poredniej naczynie pomia-rowe podzielone jest na dwie czêci, umo¿liwiaj¹c wy-mianê gazu. Jedna z czêci zawiera po¿ywkê hodow-lan¹ i drobnoustroje, a czêæ druga, w której odbywa siê pomiar impedancji, zawiera roztwór alkaliczny lub alkaliczny most agarowy. Gazy, g³ównie CO2, które s¹
produkowane podczas inkubacji w wyniku aktywnoci
Wykorzystanie zjawiska impedancji
w mikrobiologii i higienie ¿ywnoci
ADRIANA £OBACZ, JAROS£AW KOWALIK, STEFAN ZIAJKAKatedra Mleczarstwa i Zarz¹dzania Jakoci¹ Wydzia³u Nauki o ¯ywnoci UWM, ul. Oczapowskiego 7, 10-957 Olsztyn £obacz A., Kowalik J., Ziajka S.
Application of the impedance phenomenon in the microbiology and hygiene of food Summary
Rapid microbiological methods, which quickly evaluate the quality of food products, play an important role in food trade. Moreover, they are used in food safety assurance systems, e.g. HACCP. The article discusses a method based on the impedance phenomenon, its main basics, available impedance devices and the area of application of the impedimetric method in food microbiology and hygiene.
Medycyna Wet. 2008, 64 (8) 967
metabolicznej drobnoustrojów w zanieczyszczonej próbce, s¹ absorbowane przez wodorotlenek potasu w drugiej czêci naczynka, prowadz¹c do spadku kon-dunktancji roztworu alkalicznego (5, 17).
G³ówn¹ zasad¹ wszystkich systemów impedymet-rycznych jest pomiar zmian kondunktancji, impedancji lub kapacytancji w regularnych odstêpach czasu. Zmie-rzona wartoæ impedancji jest graficznie naniesiona na o rzêdnych (x), natomiast czas inkubacji jest naniesio-ny na o odciêtych (y) (krzywa impedancji).
W celu wyznaczenia liczby mikroorganizmów, u¿yt-kownik musi zdefiniowaæ okrelon¹ zmianê mierzonej wielkoci (liczba drobnoustrojów) jako wartoæ granicz-n¹. Je¿eli krzywa impedancji przekroczy wartoæ gra-niczn¹, wynik detekcji mo¿na uznaæ za pozytywny. Czas inkubacji wymagany do osi¹gniêcia przez krzyw¹ im-pedancji wartoci granicznej nazywany jest czasem de-tekcji (11, 13). Graficzna interpretacja bezporedniej metody impedymetrycznej i definicji wartoci granicz-nej oraz czasu detekcji przedstawia rycina 1.
Okrelenie liczby drobnoustrojów w metodzie im-pedymetrycznej odbywa siê w oparciu o pomiar czasu detekcji, który jest odwrotnie skorelowany z liczb¹ mi-kroorganizmów (6, 15, 17).
Czas detekcji zale¿y od pocz¹tkowej liczby oraz ki-netyki wzrostu badanych drobnoustrojów, a tak¿e w³a-ciwoci medium wzrostu (2, 11). Rzetelna i dok³adna kalibracja jest niezbêdna w analizie ilociowej drobno-ustrojów. W tym celu niezbêdne jest co najmniej 30 próbek, o zmiennej liczbie drobnoustrojów (ró¿nica kilku rzêdów wielkoci), wykorzystuje siê zarówno metodê impedymetryczn¹, jak i klasyczn¹ p³ytkow¹. Liczba drobnoustrojów, wyznaczona z wykorzystaniem klasycznej metody p³ytkowej, jest porównywana z za-stosowaniem oprogramowania komputerowego z odpo-wiednimi impedymetrycznymi czasami detekcji, celem opracowania równania regresji, wspó³czynników kore-lacji oraz rednich odchyleñ (6, 16, 17). Po zakoñcze-niu procesu kalibracji, pomiar liczby drobnoustrojów odbywa siê na podstawie zmierzonego czasu detekcji.
Obecnie na rynku dostêpne s¹ 4 urz¹dzenia impedy-metryczne (6):
Bactometer (bioMérieux): mierzony sygna³ kon-dunktancja, kapacytancja, impedancja; pomiar do 512 próbek w dwóch inkubatorach (mo¿liwoæ zastosowa-nia indywidualnej temperatury w ka¿dym inkubatorze); modu³y jednorazowe, zaopatrzone w elektrody wyko-nane ze stali nierdzewnej; system wykorzystuje po¿ywki wybiórcze oraz nieselektywne (1, 15, 17),
Malthus System (Malthus Instruments Ltd.): mie-rzony sygna³ konduktancja; mo¿liwoæ poredniego pomiaru impedancji; jednoczesny pomiar do 1200 pró-bek; inkubator umieszczony w k¹pieli wodnej; mo¿-liwoæ u¿ycia jednorazowych lub nadaj¹cych siê do wielokrotnego u¿ycia modu³ów; elektrody platynowo--ceramiczne (15, 17),
Rapid Automated Bacterial Impedance Technique (RABIT; Don Whitley Scientific Ltd.): mierzony
syg-na³ konduktancja; istnieje mo¿liwoæ poredniego pomiaru impedancji; maksymalna liczba inkubatorów 16, w ka¿dym inkubatorze znajduj¹ siê 32 naczynka z elektrod¹; system umo¿liwia jednoczesne przeprowa-dzenie do 512 oddzielnych testów z zastosowaniem in-dywidualnej temperatury w ka¿dym inkubatorze; inku-batory wykonane z aluminium, a elektrody z wysokiej jakoci stali (2, 17),
BacTrac (Sy-Lab): mierzony sygna³ impedancja; mo¿liwoæ poredniego pomiaru impedancji; system sk³ada siê z 2 termostatowanych komór analitycznych (inkubatorów); w ka¿dym z nich mieszcz¹ siê 32 prób-ki; praca w zakresie temperatury 0-65°C; inkubator wykonany jest z aluminium, natomiast elektrody ze stali nierdzewnej (17).
Wykorzystanie metody impedymetrycznej w mikrobiologii i higienie ¿ywnoci
Wykorzystanie metody impedymetrycznej w mikro-biologii ¿ywnoci koncentruje siê g³ównie na detekcji i analizie ilociowej okrelonych grup drobnoustrojów, g³ównie na wykryciu mikroorganizmów z rodziny En-terobacteriaceae, lub te¿ na oszacowaniu ca³kowitej liczby drobnoustrojów. Dane pimiennictwa wskazuj¹ równie¿ na wykorzystanie metody impedymetrycznej w detekcji miêdzy innymi takich gatunków, jak Esche-richia coli, Listeria monocytogenes, Clostridium per-fringens (10, 11, 17). Metoda impedymetryczna zna-laz³a tak¿e zastosowanie w wyznaczaniu czasu przy-datnoci produktów spo¿ywczych do spo¿ycia oraz wy-krywaniu obecnoci antybiotyków w mleku (15, 18). Felice i wsp. (5) wykorzystali poredni pomiar impe-dancji do okrelenia liczby drobnoustrojów w mleku surowym, przez pomiar powierzchniowej kapacytacji i ca³kowitej konduktancji przy czêstotliwoci 1000 Hz. Uzyskane rezultaty wskazuj¹, i¿ pomiar kapacytacji jest bardziej dok³adny, detekcja bakterii nastêpuje szybciej, a wspó³czynnik korelacji w oparciu o klasyczn¹ meto-dê p³ytkow¹ jest wy¿szy ni¿ w przypadku pomiaru kon-duktancji. Wy¿sza dok³adnoæ pomiaru kapacytacji w porównaniu do konduktancji zosta³a równie¿ potwier-dzona w badaniach Noblea i wsp. (12).
Ryc. 1. Prezentacja graficzna bezporedniej metody impedy-metrycznej, wartoci granicznej i czasu detekcji
wzrost impedancji/ spadek konduktancji
wartoϾ graniczna
czas detekcji czas
Medycyna Wet. 2008, 64 (8) 968
Atanassova i wsp. (3) analizowali wzrost i produk-cjê bakteriocyny przez Lactobacillus paracasei subsp. paracasei M3 w po¿ywce MRS, w oparciu o pomiar konduktancji. Porównanie pomiarów impedancji z kla-syczn¹ metod¹ p³ytkow¹ wykaza³o wysok¹ korelacjê pomiêdzy tymi metodami. Podkrelano równie¿ takie korzyci metody impedymetrycznej, jak wiêksza czu-³oæ i krótszy czas analizy w porównaniu do metod kla-sycznych.
Metoda impedymetryczna zosta³a zastosowana do ilociowego oznaczania bakterii jogurtowych Strep-tococcus thermophilus i Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus w po¿ywce (wzbogaconej sacharoz¹ i ukwaszonym mlekiem). Wykazano jej przydatnoæ do oznaczania typowych bakterii jogurtowych, a tak¿e krót-szy czas analizy (< 12 h), w porównaniu do metod kla-sycznych (13). Metodê tê wykorzystano ponadto do oceny jakoci mikrobiologicznej mro¿onych, mlecznych deserów oraz proszku mlecznego (8, 16).
Metoda impedymetryczna jest bardzo przydatna w ocenie stanu mikrobiologicznego ¿ywnoci, co ma odzwierciedlenie w oficjalnym jej uznaniu, np. przez AOAC International (Association of Official Analyti-cal Chemists International). Organizacja ta okreli³a mikrobiologiê impedymetryczn¹ jako jedn¹ z metod wykrywania Salmonella spp. w ¿ywnoci. W Wielkiej Brytanii i Irlandii Pó³nocnej wykorzystanie metody impedymetrycznej do wykrywania obecnoci Salmonel-la w produktach zwierzêcych jest uregulowane praw-nie od 1989 r. (17).
Podczas badañ produktów spo¿ywczych zazwyczaj ma siê do czynienia z heterogenn¹ mikroflor¹. W sytu-acji, gdy chce siê wykryæ obecnoæ konkretnego pato-genu, nale¿y zastosowaæ pod³o¿e o zmodyfikowanych, wybiórczych w³aciwociach. W ostatnich latach uka-za³y siê publikacje dotycz¹ce opracowania selektyw-nych pod³ó¿ dla mikrobiologii impedymetrycznej. Glassmoyer i Russel (7) opracowali specjalne medium wzrostu z dodatkiem akryflawiny i kwasu nalidyksy-nowego do impedymetrycznego oznaczania Staphylo-coccus aureus. Do oznaczeñ impedymetrycznych opra-cowano równie¿ sk³ad po¿ywki hodowlanej dla okre-lenia liczby pa³eczek Listeria monocytogenes (4).
Wykorzystanie metody impedymetrycznej w mikro-biologii i higienie ¿ywnoci nie ogranicza siê jedynie do analizy jakociowej i ilociowej drobnoustrojów. Mikrobiologia impedymetryczna mo¿e mieæ przewagê nad tradycyjnymi metodami mikrobiologicznymi m.in. do oznaczania obecnoci antybiotyków. Z danych pi-miennictwa wynika, w przypadku wykrywania penicy-liny G w mleku, i¿ metoda impedymetryczna jest 30 razy bardziej czu³a w porównaniu do tradycyjnych me-tod oznaczania (16).
Zjawisko impedancji zosta³o tak¿e wykorzystane do testowania antymikrobiologicznej aktywnoci okrelo-nych substancji i drobnoustrojów w stosunku do pato-genów ¿ywnoci (11, 17). Zalet¹ metody impedyme-trycznej jest mo¿liwoæ analizowania kilku substancji jednoczenie, w ró¿nych warunkach.
Metoda impedymetryczna znalaz³a zastosowanie równie¿ w przemyle mleczarskim w ocenie jakoci i aktywnoci kultur starterowych (11, 13, 17). Zmiany w kondunktancji spowodowane wzrostem drobnoustro-jów, nara¿onych na ró¿ne czynniki rodowiska, mo¿na uj¹æ w matematyczn¹ relacjê, co znalaz³o zastosowa-nie w prognozowaniu mikrobiologicznym i przyczynia siê do podniesienia bezpieczeñstwa mikrobiologiczne-go ¿ywnoci (11, 17).
Podsumowanie
W wiêkszoci publikacjach dotycz¹cych wykorzysta-nia zjawiska impedancji w celach detekcji i analizy ilo-ciowej mikroorganizmów w ¿ywnoci, mikrobiologia impedymetryczna okaza³a siê u¿yteczn¹ metoda alter-natywn¹ w porównaniu do metod konwencjonalnych. Zast¹pienie metod klasycznych metod¹ impedymetrycz-n¹ w rutynowych badaniach ¿ywnoci wymaga opty-malizacji metody i koniecznoci kalibracji, co wi¹¿e siê z nak³adem pracy. Jednak poprawnie wykalibrowany sprzêt daje mo¿liwoæ skrócenia czasu trwania analizy oraz mniejszego zu¿ycia materia³ów.
Pimiennictwo
1.Anon.: Bio Merieux. Bactometer for industrial QA and QC laboratories 1998. 2.Anon.: Don Whitley Scientific Limited Introduction to principles of
impedan-ce 1999.
3.Atanassova M. R., Chipeva V., Ivanova I., Haertle T.: Determination of the growth stages of Lactobacillus paracasei subsp. paracasei M3 from Bulgarian yellow cheese by electroconductivity. J. Microbiol. Methods 2001, 46, 227-233. 4.Capell C. J., Kirby R. M., Moss M. O.: A method and medium for the electrical
detection of Listeria spp. from food. Int. J. Food Microbiol. 1995, 25, 169-177. 5.Felice C. J., Madrid R. E., Olivera J. M., Rotger V. I., Valentinuzzi M. E.: Impedance microbiology: quantification of bacterial content in milk by means of capacitance growth curves. J Microbiol. Methods 1999, 35, 37-42. 6.Firstenberg-Eden R., Eden G.: Impedance Microbiology. Reseach Studies Press,
New York 1984.
7.Glassmoyer K. E., Russell S. M.: Evaluation of a selective broth for detection of Staphylococcus aureus using impedance microbiology. J. Food Prot. 2001, 64, 44-50.
8.Kleiss T., Albrecht J., Putallaz T., Cordier J.-L.: Impedance measurement of the microbial flora in dairy-based desserts. J. Microbiol. Methods 1995, 22, 131-137.
9.K³ossowska A., Malinowski E.: Drobnoustroje patogenne dla cz³owieka w mle-ku zbiorczym. Medycyna Wet. 2001, 57, 28-31.
10.Kowalik J., Ziajka S.: Ocena wzrostu Listeria monocytogenes w mleku na podstawie programu PMP70 oraz badañ w³asnych. Medycyna Wet. 2005, 61, 940-942.
11.Moldenhauer J.: Use of Impedance Methods in Pharmaceutical Methods. A News Letter for the Rapid Micro Users Group 2003, 3, 33-35.
12.Noble P. A., Dziuba M., Harrison D. J., Albritton W. L.: Factors influencing capacitance-based monitoring of microbial growth. J. Microbiol. Methods 1999, 37, 51-64.
13.Pirovano F., Piazza I., Brambilla F., Sozzi T.: Impedimetric method for selective enumeration of specific yoghurt bacteria with milk-based culture media. Lait 1995, 75, 285-293.
14.Richards J. C. S., Jason A. C., Hobbs G., Gibson D. M., Christie R. H.: Electro-nic measurement of bacterial growth. J. Phys. E.: Sci. Instrum. 1978, 11, 560-568.
15.Vasavada P. C.: Rapid Methods and Automation in Dairy Microbiology. J. Dairy Sci. 1992, 76, 3101-3113.
16.Walker K., Ripandelli N., Flint S.: Rapid enumeration of Bifidobacterium lactis in milk powders using impedance. Int. Dairy J. 2005, 15, 183-188.
17.Wawerla M., Stolle A., Schalch B., Eisgruber H.: Impedance microbiology: application in food hygiene. J. Food Prot. 1999, 12, 1488-1496.
18.White C. H.: Rapid Methods for Estimation and Prediction of Shelf-Life of Milk and Dairy Products. J. Dairy Sci. 1993, 76, 3126-3132.
Adres autora: mgr in¿. Adriana £obacz, ul. Oczapowskiego 7, 10-957 Olsztyn; e-mail: adriana.lobacz@uwm.edu.pl
