K
osmos
Numer 1 Strony 95-103(242)PROBLEMY NAUK BIOLOGICZNYCH____________ Polskie Towarzystwo Przyrodników im. Kopernika
MAŁGORZATA PRZYBYŁO Zakład Fizjologii Zwierząt Instytut Zoologii
Uniwersytet Jagielloński
ul. Ingardena 6, 30-060 Kraków e-mail: kloc@zuk.iz.uj.edu.pl
CZYNNIKI WPŁYWAJĄCE NA PROCES BIOSYNTEZY N-GLIKANÓW W GLIKOPROTEINACH
WSTĘP
Biosynteza N-glikozydowo wiązanych łań cuchów cukrowych glikoprotein powoduje po wstanie ze wspólnego prekursorowego oligosa- charydu jednostek wielomannozowych, hybry dowych, kompleksowych i poli-N-acetylola- ktozoaminowych ( K o r n f e l d i K o r n f e l d 1985,
P r z y b y ł o 1998). O ile sam proces biosyntezy N-glikanów został dosyć dobrze poznany, to kwestia jego regulacji pozostaje nadal nie w pełni wyjaśniona. Odpowiedzi wymagają bo wiem pytania: w jaki sposób ze wspólnego pre kursorowego oligosacharydu powstaje tak sze rokie spektrum struktur N-oligosacharydo- wych, dlaczego nie wszystkie potencjalne miej sca N-glikozylacji są wykorzystywane oraz dla czego każde miejsce N-glikozylacji danego biał ka ma charakterystyczne dla siebie struktury
oligosacharydowe? Specyficzność biosyntezy N- glikanów wynika z faktu, że w przeciwieństwie do kwasów nukleinowych czy białek, nie jest ona kontrolowana przez obecność jakiejkolwiek „matrycy”. Znalezienie odpowiedzi na powyższe pytania ma nie tylko znaczenie teoretyczne, ale i praktyczne. Analiza profilu glikozylacji białek jest bowiem ważnym czynnikiem ich struktu
ralnej charakterystyki i jest niezbędna do peł nego zrozumienia podstaw ich funkcji. Ponadto może pozwolić zrozumieć proces patogenezy wielu stanów chorobowych, którym towarzyszą zmiany w profilu glikozylacji białek oraz zapew nić molekularne markery do ich diagnozowa nia, czy też monitorować proces glikozylacji podczas produkcji rekombinowanych glikopro tein o własnościach terapeutycznych.
CZYNNIKI WPŁYWAJĄCE NA SYNTEZĘ PREKURSOROWEGO OLIGOSACHARYDU
Czynnikiem determinującym poziom N-gli kozylacji jest dostępność prekursorowego oli gosacharydu związanego z fosforanem dolicho- lu, donora oligosacharydu dla nowo syntetyzo wanych łańcuchów polipeptydowych. Na po ziom jego syntezy wpływa przede wszystkim dostępność Dol-P, aktywnych donorów mono- sacharydów, zużywanie gotowego prekursoro wego oligosacharydu oraz poziom aktywności
enzymów zaangażowanych w produkcję sub stratów cyklu fosfodolicholowego.
Kluczowy etap w syntezie prekursorowego oligosacharydu stanowi wytwarzanie GlcNAc- P-P-Dol, które katalizowane jest przez N-acety- loglukozoamino-1 -fosforan transferazę UDP- GlcNAc:Dol-P (GPT). Enzym ten aktywowany jest przez Dol-P-Man, dzięki czemu produkowa
na jest taka ilość GlcNAc-P-P-Dol, która gwa
Stosowane skróty: Dol-P — fosforan dolicholu; Dol-P-Glc — fosfodolichyloglukoza; Dol-P-Man — fosfodoli- chylomannoza; Dol-PP — difosfodolichol; Fuc — fukoza; Gal — galaktoza; Gic glukoza; GlcNAc N-acetyloglukozoamina; GlcNAc-P-P-Dol — difosfodolichylo-N-acetyloglukozoamina; GPT — N-acetyloglu- kozoamino-1-fosforan transferaza UDP-GlcNAc:Dol-P; Man — mannoza; NeuAc — kwas N-acetyloneurami- nowy; UDP-Gal — urydynodifosfogalaktoza.
rantuje tworzenie kompletnych dziewięcio- mannozowych struktur (L e h rm a n 1991). Zwrot na regulacja przez nieprawidłowo podwyższone stężenie prekursorowego oligosachaiydu zwią zanego z Dol-P, zapobiega nadmiernemu zuży ciu Dol-P przez GPT i zapewnia produkcję wyko rzystywanej w warunkach fizjologicznych ilości
prekursorowego oligosachaiydu. Nadekspresja GPT powoduje nadmierne wykorzystywanie ograniczonej puli Dol-P, ograniczenie syntezy Dol-P-Man i Dol-P-Glc, a w konsekwencji for mowanie skróconego prekursorowego oligosa- charydu.
WPŁYW STRUKTURY POLIPEPTYDU NA POZIOM JEGO WŁASNEJ N-GLIKOZYLACJI
Glc3MangGlcNAc2 przenoszony jest z lipido wego nośnika na Asn tripeptydowej sekwencji Asn-X-Thr/Ser, gdzie X jest dowolnym amino kwasem z wyjątkiem proliny (O p d e n a k k e r i współaut. 1993, Lis i S h a r o n 1993). Przeprowa dzone badania wykazały jednak, że tylko 1/3 potencjalnych miejsc akceptorowych jest N-gli- kozylowana ( K o r n f e l d i K o r n f e l d 1985) i w warunkach fizjologicznych struktura białka wydaje się być głównym czynnikiem determinu jącym stopień glikozylacji danego miejsca in
vivo.
Glikozylacja Asn-X-Ser/Thr nie zachodzi, jeśli jej N- i C-końce nie są zablokowane przez inne aminokwasy oraz polipeptyd zawierający przynajmniej 45 reszt aminokwasowych nastę pujących po Asn oraz 15 dodatkowych związa nych z rybosomem nie jest syntetyzowany (H u b b a r d i I v a t t 1981, P a q u e t i M o s c a r e l l o 1985,
K o r n f e l d i K o r n f e l d 1985, G e e th a -H a b ib i współaut. 1990). Ponadto przeniesienie oligosa chaiydu na Asn-X-Ser/Thr zachodzi tylko wte dy jeśli utworzone zostaje wiązanie wodorowe pomiędzy tlenem grupy hydroksylowej Ser/Thr a atomem wodoru grupy amidowej Asn (B a u s e
1983, Im p e r ia li i S h a n n o n 1991). Duże hydro fobowe aminokwasy (Trp, Leu) (jako X-amino
kwas) zaburzając tworzenie tego wiązania utrudniają N-glikozylację (Im p e r ia li i S h a n n o n
1991, K a s t u r i i współaut. 1997). Wykazano
również, że jeśli jako X-aminokwas w Asn-X- Ser/Thr występują aminokwasy obdarzone ła dunkiem ujemnym (Asp, Glu) lub zawierające grupę amidową (Asn, Gin), to utrudniają one N-glikozylację, natomiast aminokwasy dodat nio naładowane, hydroksyaminokwasy (Ser, Thr) i Cys ułatwiają ją (S h a k in -E s h e lm a n i współaut. 1996).
Czas w którym N-glikozylacja może zacho dzić jest ograniczony, gdyż akceptorowa Asn jest częścią rosnącego polipeptydu, któiy zwija się; a kiedy białko już ulegnie zwinięciu, poten cjalne miejsca N-glikozylacji mogą nie być do stępne dla oligosacharydylo transferazy zależ nej od Dol-P. Efektywnej N-glikozylacji ulegają zatem te sekwencje, które są dostępne i zwykle są one zlokalizowane na odcinkach łańcucha poli- peptydowego ułatwiających tworzenie (3-skrętu i pętli (R u d d i D w e k 1997). Również tworzenie mostków dwusiarczkowych zachodzące ko- translacyjnie może zmniejszać wydajność pro cesu N-glikozylacji (O p d e n a k k e r i współaut.
1993).
CZYNNIKI WPŁYWAJĄCE NA PROCES N-GLIKOZYLACJI W APARACIE GOLGIEGO
Decydującą rolę w determinowaniu ostate cznej struktuiy syntetyzowanych N-oligosacha- rydów odgrywa aparat Golgiego. Do zajścia gli kozylacji w tym organellum niezbędny jest transport nukleotydowych donorów monosa- charydów do jego przestrzeni luminalnej, a hi potezę, że reguluje on poziom N-glikozylacji białek potwierdzono do tej poiy tylko w jednym przypadku (B r a n d li i współaut. 1988).
W warunkach panujących w komórce przy wystarczającym poziomie nukleotydowych do norów monosachaiydów, ostateczna struktura anten łańcuchów N-oligosachaiydowych zależy od względnego stężenia glikozylotransferaz oraz ich specyficzności substratowej, a także od do stępności miejsca glikozylacji na który działa enzym. Aktywność glikozylotransferaz może
być regulowana przez ich potranslacyjne mody fikacje, wewnątrzkomórkowe stężenie jonów metali czy kofaktoiy (B r o c k h a u s e n 1993, Mo-
re m e n i współaut. 1994). Większość glikozylo- transteraz (z wyjątkiem fukozylotransferaz i sjalilotransferaz) wymaga obecności dwuwarto- ściowych jonów metali. Glikozylotransferazy są często glikoproteinami, a ich własna glikozyla cja może wpływać na ich stabilność, transport i aktywność, a przez to i sam proces N-glikozy lacji zachodzący przy ich udziale. Zasocjowanie z kofaktorem może zmieniać kinetykę i specyfi czność enzymu. [3 1,4 Galaktozylotransferaza w obecności a-laktoalbuminy syntetyzuje laktozę, a w przypadku jej braku łańcuchy poli-N-acety- lolaktozoaminowe (O ’K e e f e i współaut. 1980). Na aktywność związanych z błoną aparatu
Gol-giego enzymów mogą mieć również wpływ lipidy błony — ich skład, dynamika, ładunek powie rzchniowy (P a q u e t i M o s c a r e l l o 1985).
Biosynteza terminalnych struktur N-glika nów zachodzi dzięki glikozylotransferazom, a ich specyficzność sugeruje, że mogą współza wodniczyć o wspólny substrat. Współzawodnic two dotyczące GlcNAc-transferaz przedstawio no na Ryc. 10 w pracy P r z y b y ł o (1998). Innym przykładem jest wzajemnie wykluczająca się sjalilacja i fukozylacja ugrupowania Gal(31- 4GlcNAc powszechnie występującego na łańcu chach typu kompleksowego ( K o r n f e l d i K o r n - f e l d 1985, H u b b a r d i I v a t t 1981).
W obrębie aparatu Golgiego glikozydazy i glikozylotransferazy wykazują komórkowo-spe- cyficzną kompartmentalizację ( C o l l e y 1997). Nie ma jednak doświadczalnych dowodów, że różnice w dystrybucji tych enzymów wpływają na strukturę syntetyzowanego przez komórkę glikanu, chociaż mechanizm ten mógłby być ważny dla rozdzielenia enzymów konkurują cych o ten sam substrat.
Konsekwencją specyficzności glikozylotran- sferaz jest również fakt, że niektóre reszty monosacharydowe są sygnałami „stop” na ścieżce syntezy N-oligosacharydów. Przedzielo ne jednostki oligosacharydowe powstałe na skutek działania GlcNAc-transferazy III nie mo gą ulegać dalszemu rozgałęzianiu; a jeśli sub- stratem GlcNAc-transferazy III lub IV była jed nostka GlcNAc iMan5GlcNAc2 to zatrzymana zostaje droga prowadząca do syntezy N-glika- nów typu kompleksowego. GlcNAc-transferaza III i (3 1,4 galaktozylotransferazy z kolei tworzą parę enzymów wzajemnie wykluczających swo ją działalność na tym samym substracie
(B r o c k h a u s e n 1993). Kwasy sjalowe są dołą czane do glikoprotein przez różne sjalilotran- sferazy i zwykle kończą one wzrost anteny, chociaż mogą służyć jako sygnały dla innych sjalilotransferaz — powstają wówczas wielo- sjalilowane reszty (B r o c k h a u s e n 1993).
Czynnikiem warunkującym syntezę danego typu N-glikanu jest więc poziom ekspresji po szczególnych glikozylotransferaz ( K o r n f e l d i
K o r n f e l d 1985). Obserwowane różnice w stru
kturze glikanów czy enzymatycznej aktywności glikozylotransferaz pomiędzy różnymi typami tkanek czy komórek w obrębie tego samego gatunku (P a u ls o n i C o l l e y 1989, P a u ls o n i współaut. 1989, P a r e k h i współaut. 1989, Ra- d e m a c h e r i współaut. 1988), sugerują regulację na poziomie transkrypcji, gdyż geny kodujące glikozylotransferazy wydają się podlegać ko- mórkowo-zależnej ekspresji (B r o c k h a u s e n
1993).
Sama specyficzność glikozylotransferaz nie tłumaczy jednak dlaczego w obrębie tej samej komórki różne glikoproteiny mają zupełnie inne glikany, a w obrębie danego białka N-glikozyla- cja jest miejscowo-specyficzna i w stałych wa runkach heterogenność N-glikozylacji danego miejsca jest zdefiniowana i powtarzalna. Na białkowo — specyficzną N-glikozylację w danej komórce może wpływać trzeciorzędowa stru ktura podlegającego glikozylacji białka. Najbar dziej znanymi przykładami takiego specyficzne go rozpoznania glikoprotein przez glikozylo transferazy jest synteza Man-6-P markerów w enzymach lizosomowych przez GlcNAc-1 -fosfo- transferazę (von F ig u r a i H a s ilik 1986, B a r a ń ski i współaut. 1991), reglukozylacja nie zwinię tych białek w ER przez glukozylotransferazę UDP-Glc:glikoproteina (S o u s a i w spółaut.
1992), czy też rzadka sjalilacja diantenowych N- glikoprotein wątrobowych przez oc2,3 sjalilo- transferazę (Y e h i CUMMINGS 1997). Struktura białka może zatem stanowić istotny czynnik ograniczający „przypadkowe” współzawodnic two o wspólny substrat między glikozylotran- sferazami.
Kluczową rolę w określaniu struktury glika nu w danym miejscu wydaje się odgrywać pier- wszorzędowa struktura polipeptydu. Specyficz ny typ glikozylacji danego miejsca jest zachowa ny niezależnie od typu komórki, w której zacho dziła ekspresja (Cum m ing 1991). Rekombinowa- ne białka (erytropoetyna, tkankowy aktywator plazminogenu, interferon-(31 oraz interleuki- na-2) niezależnie od tego, gdzie następowała ich ekspresja, miały takie same typy struktury jak natywny odpowiednik.
Miejscowo — specyficzna obróbka oligosa- charydu jest możliwa dzięki odmiennej jego dostępności dla różnych enzymów i zależy od rozpoznania polipeptydu w kombinacji z wiąza niem oligosacharydu. Pewne glikozylotran sferazy rozpoznają nie tylko pierwszorzędową strukturę swojego substratu, ale też jego kon formację, a łańcuch polipeptydowy oddziaływu- jąc z oligosachaiydem stabilizuje konformację oligosacharydu, która może być lub nie prefe rowana przez dany enzym (B r o c k h a u s e n 1993,
S c h a c h t e r 1986). Oddziaływania typu oligosa- charyd — oligosacharyd mogą również prowa dzić do miejscowo-specyficznej glikozylacji
(Cum m ing 1991). Koncepcja miejscowo-specyfi cznej obróbki oligosachaiydów ( C a r v e r i Cum m ing 1987) sugeruje zatem istnienie jednego mechanizmu dekodującego ukryte przez poli- peptyd instrukcje. Nie mniej jednak mikrohete- rogeność obserwuje się nawet w obrębie danego miejsca N-glikozylacji. Dla erytropoetyny posia
dającej trzy miejsca N-glikozylacji, z danym miejscem może być związanych 23 lub więcej różnych glikanów (S ea m o n 1991).
Lokalizacja miejsca glikozylacji na łańcuchu polipeptydowym wydaje się korelować z jego obróbką. W swoich badaniach P o l l a c k i Atkin
son zauważyli, że miejsca N-glikozylacji zlokali
zowane w obrębie 100 pierwszych aminokwa sów są wzbogacone w oligosacharydy typu kom pleksowego, podczas gdy jednostki wieloman- nozowe dominują w miejscach położonych na 200 i dalszych aminokwasach ( K o r n f e l d i
K o r n f e l d 1985).
INNE CZYNNIKI WPŁYWAJĄCE NA PROCES N-GLIKOZYLACJI
Na proces N-glikozylacji może również wpły wać „środowisko” komórki. Glikozylacja rekom- binowanych białek ulega zmianom pod wpły wem licznych czynników, takich jak ciśnienie tlenu, pH, amoniak, brak glukozy czy czas trwa nia hodowli komórkowej (S ea m o n 1991, J e n kins i współaut. 1995); również hormonalna stymulacja i cytokiny mają zdolność do mody fikowania tego procesu (M a c k ie w ic z i współaut. 1989, L eh rm a n 1991, C a r s o n i współaut. 1990). Profil glikozylacji białek może ulegać modyfikacji podczas różnych biologicznych pro
cesów takich jak wzrost, rozwój, różnicowanie czy stany chorobowe (S h a h i współaut. 1992, Lis i S h a r o n 1993, B r o c k h a u s e n 1993, O pde- n a k k e r i współaut. 1993, N a t s u k a i L o w e 1994). Stanom chorobowym towarzyszy często poja wianie się nowych struktur oligosachaiydo- wych czy onkofetalnych antygenów, zmiany w sjalilacji, fukozylacji, galaktozyłacji oraz sto pniu przedzielenia czy rozgałęzienia oligosacha- rydów (Ż a k 1990, B r o c k h a u s e n 1993, Lis i
S h a r o n 1993, LAiD LERi L ity ń s k a 1997).
ZABURZENIA W SYNTEZIE N-GLIKANÓW PRZYCZYNĄ CHOROB
Jeszcze do niedawna łańcuchy oligosacha- rydowe dołączone do białek uważano za zbędny element, który tylko utrudnia ich oczyszczenie czy scharakteryzowanie. Tymczasem znaczny postęp w metodach analizy oligosacharydów i technikach biologii molekularnej pozwolił na poznanie procesu biosyntezy glikanów i zrozu mienie, że są one ważne dla samych białek, gdyż mogą wpływać na ich funkcję, strukturę, fizy czne własności czy transport (V a rk i 1993). Ostatnio ustalono również, że u podłoża pew nych chorób leżą zaburzenia w syntezie części cukrowej glikoprotein.
fosforanowy, warunkujący ich późniejszy trans port z aparatu Golgiego do lizosomów (K o r n f e l d 1987). W przypadku jego braku enzymy lizosomowe nie są kierowane do właściwego kompartmentu, lecz ulegają sekrecji na zew nątrz komórki. Choroba wtrętów komórkowych ujawnia się tylko w pewnych typach komórek dotkniętych nią osób to jest w komórkach tkan ki łącznej, pewnych komórkach nerwowych i komórkach Schwanna na peryferyjnych ner wach, a manifestuje się obecnością w lizoso- mach licznych wtrętów, czyli nie zdegradowa nego materiału.
CHOROBA WTRĘTÓW KOMÓRKOWYCH (ANG. I-CELL DISEASE)
Choroba ta tradycyjnie zaliczana jest do chorób spichrzeniowych lizosomów, z których większość spowodowana jest przez nieprawid łowy katabolizm glikokonjugatów. Nie mniej jednak u podstaw tej dziedziczonej w sposób autosomalno — recesywny choroby leży brak aktywności N-acetyloglukozoamino- 1-fosfo- transferazy (EC 2.7.8.17) (O w a d a i N e u f e l d
1982, R e u s e r 1984, K o r n f e l d 1987, S a n d o v a l
i współaut. 1989), enzymu katalizującego prze niesienie GlcNAc-1-P na wybrane reszty man- nozy w oligosacharydach typu wielomannozo- wego enzymów lizosomowych (por. Ryc. 9 w pracy P r z y b y ł o 1998). Białko to jest kluczowym enzymem zaopatrującym nowo syntetyzowane hydrolazy lizosomowe w marker
mannozowo-6-ZESPÓŁ NIEDOBORU WĘGLOWODANÓW W GLIKOPRO- TEINACH (ZESPÓŁ CDG, ANG. CARBOHYDRATE-DEFICIENT
GLYCOPROTEIN SYNDROME)
Ta autosomalno — recesywnie dziedziczo na choroba opisana po raz pierwszy przez Jae- kena i współaut. w 1980 r., należy do wielona- rządowych chorób i charakteryzuje się obniżo nym stopniem N-glikozylacji wielu białek. Przy padki tej choroby stwierdzono w 9 krajach eu ropejskich oraz Iranie, Syrii, Japonii, Tunezji i USA. Jej klinicznymi objawami są między inny mi ostre uszkodzenia układu nerwowego, upo śledzenie wzrostu, patologia wątroby, niepra widłowości w budowie szkieletu i hypogona-
dyzm (J a e k e n i współaut. 1993), a najbardziej charakterystyczne markery stanowi wzrost fra kcji disjalotransferryny i asjalotransferryny
kompensujący spadek tetrasjalilowanej trans- ferryny dominującej w surowicy zdrowych osób oraz przesunięcie białek w kierunku katody w izoelektrycznym ogniskowaniu na skutek
niedobór aktywności fosfomannomutazy (50- krotne obniżenie aktywności enzymu w porów naniu z normą). Enzym ten katalizuje konwer sję Man-6-P do Man-l-P (Rye. 1).
Rye. 1 Szlaki przemian metabolicznych fruktozy i mannozy.
zmniejszonego stopnia ich sjalilacji (Wa d a i
współaut. 1992, Ya m a s h it a i współaut. 1993).
Klinicznie wyróżnia się trzy typy zespołu CDG, z których typ I jest najlepiej udokumentowany i scharakteryzowany.
Przyczyn prowadzących do powstania ze społu niedoboru węglowodanów w glikoprotei nach typu I upatruje się w niedoborze pobiera nia mannozy (Pa n n e e r s e l v a m i Fr e e z e 1996),
niedoborze konwersji Man-6-P do Man-l-P lub w niedoborze konwersji dehydrodolicholu do dolicholu (Ok h u r a i współaut. 1997). Fakt, że
struktura N-oligosacharydów transferryny po zostaje niezmienna u pacjentów z zespołem CDG typu I, a tylko całkowita liczba oligosacha- rydów ulega zmniejszeniu, wskazuje na zabu rzenia we wczesnych etapach N-glikozylacji. Badania przeprowadzone przez van Schaftinge- na i Jaekena 1995, wykazały, że u pacjentów z zespołem CDG typu I stwierdza się znaczny
Znaczne obniżenie aktywności tego enzymu pozbawia komórkę możliwości syntezy odpo wiedniej ilości Man-l-P i GDP-Man, które są niezbędne do syntezy prekursorowego oligosa- charydu (por. Ryc. 7 w pracy Pr z yb yło 1998).
GDP-Man jest również niezbędna do syntezy innych glikokonjugatów — pewnych O-man- nozylowanych proteoglikanów w mózgu oraz kotwic glikozylofosfatydyloinozytolowych. Tak więc, w przypadku niedoboru fosfomannomu tazy, nieprawidłowa glikozylacja wynika z niewystarczającej dostępności specyficznych nukleotydowych donorów cukrów.
Inna grupa (Oh k u r a i współaut. 1997) ba
dając wielostopniową drogę syntezy prekur sorowego oligosacharydu przez metaboliczne znakowanie zsynchronizowanych hodowli fi- broblastów pobranych od pacjentów z zespołem CDG typu I przy użyciu [3H] glukozoaminy, [3H] mannozy i [3H] mewalonianu wykazała, że w
komórkach tych w fazie S dochodzi do nagro madzenia [3H] dehydrodolicholu, podczas gdy ilość [3H] dolicholu i [3H] prekursorowego oli- gosacharydu jest znacznie niższa niż w kontrol nych fibroblastach (Ryc. 2).
Ryc. 2 Szlak syntezy dolicholu z mewalonianu.
Na tej podstawie wyciągnięto wniosek, że konwersja dehydrodolicholu do dolicholu jest częściowo upośledzona, co w rezultacie prowa dzi do zmniejszenia puli dolicholu i obniżenia poziomu N-glikozylacji białek. Enzymem kata lizującym konwersję dehydrodolicholu do doli cholu jest reduktaza dehydrodolicholowa, ale obecnie brak jest mikrometody pozwalającej na badanie jej aktywności w hodowlach komórko wych.
Ostatnio pojawiły się również doniesienia, że przyczyną obniżonej glikozylacji w zespole CDG typu I może być silne obniżenie zdolności fibroblastów do syntezy glukozylowanego pre- kursorowanego oligosachaiydu związanego z dolicholem, co w rezultacie prowadzi do nagro madzenia w tych komórkach MangGlcNAc2-PP- Dol (B u r d a i współaut. 1998). Z badań nad komórkami wyższych Eukaryota i drożdży wia domo, że struktura MangGlcNAc2 może być przenoszona na białko, ale proces ten zachodzi ze zmniejszoną wydajnością i w efekcie prowa dzi to do obniżonej glikozylacji. Nie wiadomo jednak czym spowodowane jest nagromadzenie MangGlcNAc2-PP-Dol — czy powstaje ono na skutek niedoboru enzymu syntetyzującego Dol- P-Glc, czy też glukozylotransferazy zależnej od Dol-P-Glc.
Przyczyną zespołu CDG typu II jest nato miast dramatyczny spadek aktywności N- acetyloglukozoaminotransferazy II (GlcNAc- transferaza II), spowodowany przez mutację punktową genu kodującego to białko, położone go w chromosomie 14q21 (Ch a r u k i współaut.
1995). GlcNAc-transferaza II działająca na jed nostkę GlcNAciMan3GlcNAc2 powoduje doda nie reszty GlcNAc na ramieniu Mana 1-6. U osób zdrowych, białka pasma 3 erytrocytów posiada ją diantenowe łańcuchy typu poli-N-acetylola-
ktozoaminowego, u których na ramieniu Ma na 1-6 trimannozylowej struktury korowej znaj duje się 10-12 powtarzających się jednostek Gal(31-4GlcNAc(31-3, a na ramieniu Mana 1-3 jest 5 lub 6 takich jednostek. W fibroblastach pacjentów z zespołem CDG typu II obserwuje się 98% zmniejszenie aktywności N-acetylo- glukozoaminotransferazy II w porównaniu z normą, a w jednojądrowych komórkach krwi zupełnie się jej nie wykrywa. W efekcie u osób tych dochodzi do 50% spadku syntezy łańcu chów poli-N-acetylolaktozoaminowych w gliko- proteinach błonowych erytrocytów pasma 3 i pasma 4.5, ponieważ nie jest możliwa rozbudo wa ramienia Mana 1-6 trimannozylowej stru ktury korowej.
Biochemiczne przyczyny leżące u podstaw zespołu CDG typu III nie są jeszcze znane.
WRODZONA NIEDOKRWISTOŚĆ DYSERYTROPOETYCZNA TYPU II (HEMPAS, ANG. CONGENITAL DYSERYTHROPOETIC
ANEMIA TYPE II)
HEMPAS jest rzadką chorobą genetyczną dziedziczoną w sposób autosomalno — rece- sywny ( B e u t l e r 1995, F u k u d a i współaut. 1987). Nasilenie tej choroby obserwuje się w północnej Europie, Włoszech i północnej Afryce. Charakteryzuje ją anemia od postaci łagodnej do ostrej, anizo — i poikilocytoza oraz anizo- chromia, wielojądrowość późnych erytrobla- stów, nieefektywna erytropoeza i nieprawidło wości w budowie błony erytrocytów. Ponadto białka pasma 3 wykazują w elektroforezie w żelu poliakryloamidowym w obecności SDS ma sę mniejszą niż w prawidłowych erytrocytach. Anomalie morfologiczne obserwuje się również w granulocytach, płytkach krwi, megakariocy- tach i makrofagach.
W prawidłowych ludzkich erytrocytach biał ka pasma 3 i pasma 4.5 — o czym wcześniej wspomniano — posiadają łańcuchy oligosacha- rydowe typu poli-N-acetylolaktozoaminowego. Natomiast u osób z HEMPAS białka te nie mają laktozoaminoglikanów, lecz glikany występują w postaci trimannozylowych hybrydowych struktur, co wskazuje na niedobór aktywności
Ryc. 3. Schemat budowy sjalil-Lewisx.
GlcNAc-transferazy II — 21% normy (F u k u d a i współaut. 1987). W tych okolicznościach enzy my, które w prawidłowych erytrocytach synte tyzują laktozoaminoglikany w białkach pasma 3 ((31,4 Gal-transferaza, (31,3 GlcNAc-transfera- za i (31,6 GlcNAc-transferaza) nie będąc „wyko rzystane”, prawdopodobnie „znajdują” inny substrat, gdyż obserwuje się nagromadzenie tych struktur w glikolipidach (F u k u d a i współ aut. 1987).
W innych przypadkach komórki wykazują prawidłowy poziom aktywności GlcNAc-trans- ferazy II, a mimo to nadal syntetyzowane są trimannozylowe hybrydowe oligosacharydy w białkach pasma 3 z powodu niskiej aktywności mannozydazy II, która powoduje konwersję GlcNAciMan5GlcNAc2 do GlcNAciMan3GlcNAc2 (Fu kuda i współaut 1990).
Analiza genów kodujących mannozydazę II i N-acetyloglukozoaminotransferazę II wykaza ła, że geny te nie są odpowiedzialne za wywoła nie wrodzonej niedokrwistości dyserytropoety- cznej typu II, ale choroba spowodowana jest prawdopodobnie przez defekt czynnika trans- krypcyjnego regulującego zarówno mannozyda zę II, jak i GlcNAc-transferazę II (Iolascon i współaut. 1997).
NIEDOBÓR IZOMERAZY FOSFOMANNOZYLOWEJ (ANG. PHOSPHOMANNOSE ISOMERASE DEFICIENCY)
Choroba ta opisana dotychczas u trojga tu reckiego rodzeństwa, charakteryzuje się cykli cznymi wymiotami, wrodzonym zwłóknieniem wątroby i niedoborem N-glikozylacji białek. Po dobnie, jak w zespole CDG typu I obserwuje się, że dominującą formą transferryny osocza u tych osób są formy di — i asjalilowane (De K o n in g i współaut. 1998). W niedoborze tym nie obserwuje się charakterystycznego dla 80% pa cjentów z zespołem CDG typu I obniżenia aktywności fosfomannomutazy, lecz wykrywa się niedobór izomerazy fosfomannozylowej. En zym tez katalizuje konwersję fruktozo-6-P do mannozo-6-P (Ryc. 1). Niedobór aktywności te go białka prowadzi do zmniejszenia poziomu syntezy GDP-Man, czego skutkiem jest zmniej szenie N-glikozylacji białek.
INNE CHOROBY WYNIKAJĄCE Z ZABURZENIA SYNTEZY N-GLIKANÓW
Opisane powyżej choroby wynikające z upo śledzonej syntezy N-glikoprotein nie wyczerpu ją wszystkich przykładów chorób, w których
stwierdza się zaburzenia w syntezie części cu krowej glikokonjugatów. Zespół adhezji leuko cytów typu II (ang. leukocyt adhesion deficiency syndrome type II) to choroba, w której erytrocy ty nie posiadają antygenów grup H i Lewis, a neutrofile charakteryzują się obniżoną ruchli wością i niezdolnością do adhezji do komórek endotelialnych przed i po indukcji ekspresji E-selektyny (czego efektem są nawracające in fekcje bakteryjne) (E t z io n i i współaut. 1992,
K o ś c ie la k 1995). Neutrofile nie posiadają stru ktury sjalil-Lewisx (Ryc. 3) na glikoproteinach powierzchniowych i glikolipidach będącej ligan- dem E-selsktyn i P-selsktyn (co właśnie unie możliwia im adhezję) i prawdopodobnie od zwierciedla to ogólny niedobór w metabolizmie fukozy w komórkach chorych, gdyż niedobór fukozylacji obserwuje się w licznych glikopro teinach.
U chorych z zespołem Trt obserwuje się nie dokrwistość hemolityczną, leukopenię i trom- bocytopenię, a w krwi stwierdza się obecność n iepraw idłow ych erytrocytów ( K o ś c ie la k
1995). Choroba ta jest wywoływana przez mu tację genu kodującego (31,3 Gal-transferazę, en zymu, który przenosi Gal na GlcNAc wiązany O-glikozydowo do seryny. Powstające w efekcie łańcuchy Gal(31-3GlcNAcal-3Ser— białko, po sjalilacji są obecne głównie na glikoforynie, biał ku błonowym erytrocytów. U chorych z zespo łem Tn obserwuje się natomiast na tym białku struktury GlcNAc-Ser lub SA-GlcNAc-Ser.
W napadowej nocnej hemoglobinurii w krwi chorych oprócz prawidłowych erytrocytów, stwierdza się też obecność erytrocytów, które wykazują podwyższoną wrażliwość na lizę me- diowaną przez komplement ( K o ś c ie la k 1995). W błonie komórkowej tych komórek stwierdza się znaczne zmniejszenie ilości 3 białek, których funkcja polega na ochronie komórki przed akcją przypadkowo aktywowanego komplementu. Białka te połączone są z błoną erytrocytów za pośrednictwem kotwic glikozylofosfatydy- loinozytolowych i właśnie zaburzenia w ich syn tezie (na poziomie przeniesienia GlcNAc na atom 6 inozytolu) powodują wystąpienie u pa cjentów hemoglobinurii, która u jednych poja wia się nieregularnie, a u innych podczas snu.
Nieprawidłową glikozylację białek obserwu je się również w chorobach nowotworowych
(La id l e r i Lit y ń s k a 1997, Ko b a t a 1998), artre-
tyzmie reumatoidalnym czy alkoholizmie
(McDo w e l l i Ga h l 1997). Genetyczne upośle
dzenie w syntezie proteoglikanu siarczanu de- rmatanu stwierdza się w zespole Ehlers-Dardos
i wynika ono z niedoboru galaktozylotransfera- zy I (Qu e n t in i współaut. 1990). Osteochon-
drodysplazje spowodowane są natomiast przez upośledzone sulfonowanie proteoglikanów chrząstki (McDo w e l l i Ga h l 1997).
FACTORS THAT CONTROL N-GLYCOSYLATION OF GLYCOPROTEINS S u m m a ry
The synthesis of the polypeptide chain of a glycoprotein is under genetic control. In contrast, its N-oligosaccharides are attached to the protein and processed by a series of enzyme reactions. As a result, N-glycosylation is species-, tissue- and cell-specific, and is determined by the structure of the protein backbone. Moreover, despite the fact that the same glycosylation machinery is available to every protein
in a given cell, glycoproteins mostly exist as population of glycosylated variants of a single polypeptide. This article reviews factors that control the N-glycosylation process and molecular basis of a number of diseases associated with defects in glycoprotein synthesis such as I-cell disease, carbohydrate-deficient syndrome and congenital dyseiy- thropoetic anemia type II.
LITERATURA
B aran sk iT . J., K o e ls h G., H a r ts u c k J. A., K o r n f e l d S . , 1991.
Mapping and molecular modeling o f a recognition do main fo r lysosomal enzyme targeting. J. Biol. Chem.
266, 23365-23372.
B ause E., 1983. Structural requirements o f N-glycosylation
o f proteins. Studies with proline peptides as conforma tional probes. Biochem. J. 209, 331-336.
B e u t le r E., 1995. Congenital dyserythropoetic anemias.
[W:] Hematology (Williams) B e u t l e r E., Lichtm an M. A.,
C o l l e r B. S., Kipps T. J. (red,). McGraw-Hill, New York, str. 467-470.
B ra n d li A. W., H ansson G. C., R o d r ig u e z -B u o la n E., Simons
K. 1988. A polarized epithelial cell mutant deficient
translocation ofUDP-galactose into the Golgi complex. J.
Biol. Chem. 264, 16283-16290.
B rock h a u sen I., 1993. Clinical aspects o f glycoprotein bio
synthesis. Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 30, 65-151.
B u rd a P., B o r s ig L., de Rijk-van Andel J., W a v e r s R., Jaek en
J., C a rc h o n H., B e r g e r E. G., 1998. A novel carbohy
drate-deficient glycoprotein syndrome characterized by a deficiency in glucosylation o f the dolichol-linked oligo saccharide. J. Clin. Invest., 102, 647-652.
C a rso n D. D., F a r r a r J. D., L a id la w J., W r ig h t D. A., 1990.
Selective activation o f the N-glycosylation apparatus in uteri by estrogen. J. Biol. Chem. 265, 2947-2955.
C a r v e r J. P., Cumming D. A., 1987. Site-directed processing
o f Nlinked oligosaccharides: the role o f three-dimen- tional structure. Pure Apply. Chem. 59, 1465-1476.
C haru k J. H. M ., T an J ., B e rn a rd in i M ., H ad d ad S., R eith - m eier R. A . F., J aek en j., S c h a c h t e r H ., 1995. Carbohy
drate-deficient glycoprotein syndrome type II. Eur. J.
Biochem., 230, 797-805.
C o l l e y K. J., 1997. Golgi localization o f glycosyItransfer
ases: more questions than answers. Glycobiology 7,
1-13.
Cumming D. A., 1991. Glycosylation of recombinant protein
therapeutics: control and functional implications. Glyco
biology 1, 115-130
D e K on in g T. J., D o r la n d L., Van D ig g e le n O. P., Boonman
A. M. C., de J o n g G. J., van N o o r t W. L., de S c h r y v e r
J., D uran M., van der B e r g I. E. T., G e r w ig G. J., B e r g e r
R., PoLL-The B. T., 1998. A novel disorder o f N-glycosyl
ation due to phosphomannose isomerase deficiency.
Bioch. Bioph. Res. Commun., 245, 38-42.
E tzio n i A., Frydman M., P o lla c k S., A v id o r I., P h illip s M. L.,
P a u ls on J. C., G e rs h o n i-B a r u c h R., 1992. Brief report:
recurrent severe infections caused by a novel leukocyte adhesion deficiency. N. Eng. J. Med. 327, 1789-1792.
Fukuda M. N., D e l l A . , S c a r te z z in i P., 1987. Primary defect
o f congenital dyserythropoetic anemia type II. J. Biol.
Chem. 262, 7195-7206.
Fukuda M. N., M a s ri K. A., D e l l A . , L u z z a tto L., M orem e n K. W., 1990. Incomplete synthesis o f N-glycane in congeni
tal dyserythropoetic anemia type II caused by a defect in the gene encoding -mannosidase II. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 87, 7443-7447.
G eeth a -H a b ib M., P a rk H. R., L e n n a rz W. J., 1990. In vivo
N-glycosylation and fate o f Asn-X-Ser/Thr tripeptides.
J. Biol. Chem. 265, 13655-13660.
H u b b ard S. C., I v a t t R. J., 1981. Synthesis and processing
o f asparagine-linked ligosaccharides. Annu. Rev.
Biochem. 50, 555-583.
Im periali B., Shannon K. L. 1991. Differences between Asn-
Xaa-Thr containing peptides: a comparizon o f solution conformation and substrate behaviour witholigosaccha- ry Itransf erase. Biochemistry 30, 4374-4380.
Io la s c o n A., D e l G iu d ice E. M., P e r r o t t a S., G r a n a tie r o M.,
Z e la n te L., Gasparini P., 1997. Exclusion o f three candi
date genes as determinants o f congenital dyserythro poetic anemia type II (CDAII). Blood 90, 4197-4200.
Jaek en J., V a n d e r s c h u e re n -L o d e w e y c k x M., C a s a e r P.,
S n o e c k L ., C o r b e e lL . , E g g e r m o n t E ., E e c k le r R . , 1980.
Familial psychomotor retardation with markedly fluc tuating serum prolactin, FSH and GH levels, patrialTBG deficiency, increased serum arylsulfatase A and in creased CSFprotein: a new syndrome? Pediatr. Res. 14,
179.
J aek en J., C a rc h o n H., S t i b l e r H., 1993. The carbohydrate-
deficient glycoprotein syndromes: pre-Golgi and Golgi disorders. Glycobiology 3, 423-428.
Jenkins N., Jam es D., H o o k e r A., 1995. Changes in N-glyco
sylation o f recombinant human interferon^ during batch fermentation. GlycoNews, second’95, 1-5. Oxford Gly-
coSystems Ltd, Abingdon, UK.
K a s tu ri L., C h en H., Shak in-E shlem an S. H. 1997. Regulation
o f N-linked core glycosylation: use o f a site-directed mutagenesis approch to identify Asn-Xaa-Thr/Ser se- quons that are poor oligosaccharide acceptors. Biochem.
J. 323, 415-419.
K o b a ta A., 1998. A retrospective and prospective view o f
gly copathology. Glycoconjugate J., 15, 323-331.
K o r n f e ld R., K o r n f e l d S., 1985. Assembly o f asparagine-
linked oliqosaccharides. Annu. Rev. Biochem. 54, 631-
664.
K o r n f e l d S., 1987. Trafficking o f lysosomal enzymes.
K o ś c ie la k J., 1995. Diseases o f aberrant glycosylation. Acta Boch. Pol., 42, 1-10.
L a id le r P., Lityńska A., 1997. Tumor celi N-glycans in meta
stasis. Acta Bioch. Pol. 44, 343-357.
Lehrm an M ., 1991. Biosynthesis o f N-acetylglucosamine-P-
P-dolichol, the committed step o f asparagine-linked oli gosaccharide assembly. Glycobiology 1, 553-562.
Lis H., S h a ro n N., 1993. Protein glycosylation. Structural and
functional aspects. Eur. J. Biochem. 218, 1-27.
M a c k ie w ic z a ., S c h u lt z D., M a th is on J., Ganapathi M., Kush- n e r I., 1989. Effect o f cytokines on glycosylation of acute
phase proteins in human hepatoma cell lines. Clin. Exp.
Immunol. 75, 70-75.
M c D o w e ll G., G a h l W., 1997. Inherited disorders o f glyco
protein synthesis: cell biological insight. Proc. Soc. Exp.
Biol. Med. 215, 145-157.
M orem en K. W., T rim b le R. B., H e r s c o v o c s A., 1994. Glyco-
sidases o f the asparagine-linked oligosaccharide pro cessing pathway. Glycobiology 4, 113-125.
Natsu k a S., L o w e J . B., 1994. Enzymes involved in mamma
lian oligosaccharide biosynthesis. Curr. O p in . Struct.
B iol. 4, 6 8 3 -6 9 1 .
O ’K e e fe E., M o r d ic k T ., B e l l J. E., 1980. Bovine galactosyl-
transferase: interaction witha-lactoalbumin and the role of a-lactoalbumin in lactose synthetase. Biochemistry
19, 4962-4966.
O k h u ra T ., Fukushima K ., K urishaki A ., Sagami H ., O g u r a K ., Ohno K., H a r a -K u g e S., Yam ashita K., 1997. A partial
deficiency o f dehydrodolichol reductase is a cause of carbohydrate-deficient glycoprotein syndrome. J. Biol.
Chem. 272, 6868-6875.
O pdenakker G., Rudd P. M., P on tin g C. P., D w e k R. A. 1993.
Concepts and principles of glycobiology. FASEB J. 7,
1330-1337.
O wada M., N e u f e ld E. F., 1982. Is there a mechanism for
introducing acid hydrolases into liver lysosomes that is independent o f mannose-6-phosphate recognition?
Bioch. Bioph. Res. Commun. 105, 814-820.
P an n eerselvam K., F r e e z e H. H ., 1996. Mannose corrects
altered N-glycosylstion in carbohydrate-deficient glyco protein syndrome fibroblasts. J. Clin. Invest. 97, 1478-
1487.
P a q u e t M. R ., M o s c a r e l l o M . A. 1985. The modulation of
glycosyltransferase activity in Golgi membranes. [W :]
Membrane fluidity in biology, t. 4 Cellular aspect, Aca
demic Press, str. 209-245.
P a rek h R. B., D ew k R. A., Thom as J. R., O p den ak ker G.,
R a d e m a c h e rT . W ., W it t w e r A. J., H o w a rd S. C., N e ls o n
R., S ie g e l N. R., Jenn in gs M. G., H arakas N. K., F e d e r
J ., 1989. Cell-type specific and site-specific N-glycosyl-
ation o f type I and type II human tissue plasminogen activator. Biochemistry 28, 7 6 4 4 -7 6 6 2 .
P a u ls o n J. C., C o l l e y K. J., 1989. Glycosyltransf erases.
Structure, localization and control of cell type-specific glycosylation. J. Biol. Chem. 264, 17615-17618.
P a u ls o n J. C., W e in s te in J., S c h a u e r A ., 1989. Tissue-spe-
cfic expression of sialyltransferases. J. Biol. Chem.
264, 10931-10934.
P r z y b y ło M., 1998. Budowa i synteza łańcuchów cukrowych
glikoprotein. Kosmos 238, 69-82.
Q u en tin E., G la d e n A., R o d e n L., K r e s s e H., 1990. A genetic
defect in the biosynthesis o f dermatan sulphate proteog lycans: galactosyltransferase I deficieccy in fibroblasts from apatioent with a progeroid syndrome. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87, 1342-1346.
R ad em a ch er T. W., P a re k h R. B., D w e k R. A., 1988. Glyco biology. Annu. Rev. Biochem. 57, 785-838.
R e u s e r A. J. J., 1984. Genetic heterogeneity in lysosomal
storage disorders. [W:] Molecular basis o f lysosomal storage disorders. B a r r a n g e r J. A., B ra d y R. O. (red.), Academic Press Incorporation, Orlando 287-309.
Ru d d P. M., D w ek R. A., 1997. Glycosylation: heterogeneity
and the 3D structure o f proteins. Crit. Rev. Bioch. Mol.
Biol. 32, 1-100.
S a n v a d a l I. V., C hen J. W., Yuan L., A u g u s t J. T., 1989.
Lysosomal integral membrane glycoproteins aer ex pressed at high levels in the inclusion bodies o f I-cell disease fibroblasts. Arch. Biochem. Biophys. 271, 157-
167.
S c h a c h t e r H ., 1986. Biosynthetic controls that determine the
branching and microheterogeneity o f protein-bound oli- gosacharides. Biochem. Cell Biol. 64, 163-181.
Seam on K., 1991. Evaluation o f recombinant glycoproteins.
GlycoNews, summer91, 5-7. Oxford GlycoSystems Ltd, Abingdon, UK.
Shah S., La n c e P., Smith T. J., S c h a c h t e r H., 1992. n-Butyr-
ate reduces the expresion of (3-galactoside a2,6-sia- lyltransferase in Hep G2 cells. J. Biol. Chem. 267,
10652-10658.
Shakin-E shlem an S. H., S pitaln ik S. L., K a s tu ri L., 1996. The
amino acid at the X position o f Asn-X-Ser sequon is an important determinant o f N-linked core-glycosylation efficiency. J. Biol. Chem. 271, 6363-6366.
S ou sa M. C., F e r r e r o G. M., P a ro d i A. J., 1992. Recognition
o f the oligosaccharide and protein moieties o f glycopro teins by UDPGlaglycoprotein glucosyltransferase. Bio
chemistry 31, 97-105.
V an S c h a ftin g e n E., Jaek en J., 1995. Phosphomannomutase
deficiendy is a cause o f carbohydrate-deficient glycopro tein syndrome type I. FEBS Lett. 377, 318-320.
V a rk i A., 1993. Biological roles o f oligosaccharides: all of the
theories are correct. Glycobiology 3, 97-130.
V o n F ig u r a K., H a s ilik A., 1986. Lysosomal enzymes and
their receptors. Annu. Rev. Biochem. 55, 167-193.
W a d a Y., Nishikawa A., O k am oto N., Inui K., Tsu kam oto H.,
O kada S., T an igu ch i N., 1992. Structure o f serum trans
ferrin in carbohydrate-deficient glycoprotein syndrome.
Bioch. Bioph. Res. Commun. 189, 832-836.
Yam ashita K., Id o e H., O h k u ra T., Fukushima K., Yu asa I.,
O hno K., T a k es h ita K., 1993. Sugar chains o f serum
transferrin from patients with carbohydrate deficient glycoprotein syndrome. J. Biol. Chem. 268, 5783-5789.
Y e h J. C., Cummings R. D. 1997. Differential recognition of
glycoprotein acceptors by terminal glycosyltransfer- ases. Glycobiology 7, 241-251.
