Marzenna Bartoszewicz | Adam Junka | Danuta Smutnicka
Wrażliwość klinicznych szczepów
Klebsiella
pneumoniae na antyseptyki stosowane
w leczeniu ran
Sensitivity of nosocomial
Klebsiella pneumoniae strains to antiseptics used
in wound treatment
Katedra i Zakład Mikrobiologii Akademii Medycznej im. Piastów Sląskich we Wrocławiu
} Adam Junka, Katedra i Zakład Mikrobiologii Akademii Medycznej im. Piastów Śląskich we Wrocławiu, ul. Chałubińskiego 4, 50–368 Wrocław, Tel.: (71) 784 13 01, Fax: (71) 784 01 17, e-mail: junad@op.pl
Wpłynęło: 08.11.2011 Zaakceptowano: 09.12.2011
Streszczenie: Pałeczki Klebsiella pneumoniae, ze względu na zdol-ność do wywoływania infekcji u pacjentów z osłabionym układem odpornościowym, stosunkowo często izolowane są z infekcji ran przewlekłych. Jednym z filarów nowo powstałej strategii leczenia ran przewlekłych Biofilm Based Wound Care jest zastosowanie no-woczesnych antyseptyków do eradykacji drobnoustrojów. Mimo licznych prac konsensusowych, w naszym kraju wciąż często sto-sowane są przestarzałe i nieskuteczne antyseptyki. Celem niniej-szej pracy było określenie minimalnych stężeń antyseptyków: di-chlorowodorku oktenidyny (OCT), diglukonianu chlorheksydyny (CHX), powidonu jodu (PVP-jod), nadtlenku wodoru (H2O2) oraz mleczanu etakrydyny (Ethacridini lactas), zdolnych do zahamowa-nia rozwoju pałeczek Klebsiella pneumozahamowa-niae izolowanych z zaka-żeń ran. Najskuteczniejszym antyseptykiem, spośród badanych, okazała się być oktenidyna, natomiast mleczan etakrydyny okazał się nieskuteczny w badanym przedziale stężeń.
Słowa kluczowe: antyseptyka | biofilm | Biofilm Based Wound Care | Klebsiella pneumoniae | rany przewlekłe
Abstract: Klebsiella pneumoniae rods, bacause of ability to cause infection in immunocompressed patients are relatively frequently isolated from chronic wounds infections. Use of modern antisep-tics to eradicate pathogens from the wound is one of the pillars of new concept of chronic wound treatment, called Biofilm Based Wound Care. However, obsolete and inefficient antiseptics are still in use in our country, despite number of consensus works concer-ning this issue. Aim of this work was to evaluate efficacy of vario-us antiseptics, including octenidine dihydrochloride, chlorhexidi-ne digucate, iodichlorhexidi-ne povidochlorhexidi-ne, peroxide and ethacridichlorhexidi-ne lactate in eradication of Klebsiella pneumoniae strains isolated from wounds infections. Octenidine dihydrochloride was the most efficient an-tiseptic, whereas ethacridine lactate was completely ineffective in analysed range of concentrations.
Wstęp
Klebsiella pneumoniae jest Gram-ujemną pałeczką
występu-jącą w środowisku naturalnym oraz kolonizuwystępu-jącą powierzch-nię skóry i błon śluzowych ludzi. Do głównych czynników odpowiedzialnych za chorobotwórczość Klebsiella
pneumo-niae zaliczane są enterotoksyny (których aktywność prowadzi
do biegunek), siderofory (związki wiążące żelazo pierwiast-kowe), endotoksyny (lipopolisacharyd), adhezyny (inicjują-ce pro(inicjują-ces przylegania bakterii do powierzchni) oraz otocz-ka [1]. Szczepy Klebsiella pneumoniae posiadają także zdol-ność do wytwarzania biofilmu, czyli zorganizowanej struktu-ry drobnoustrojów występujących w formie osiadłej (przylega-jącej do biomateriału lub tkanek pacjenta) i otoczonych war-stwą zewnątrzkomórkowego śluzu. Substancja ta, określana mianem bakteryjnej macierzy zewnątrzkomórkowej, chroni społeczność drobnoustrojów przed niesprzyjającymi warun-kami środowiskowymi, środwarun-kami przeciwdrobnoustrojowymi oraz układem immunologicznym gospodarza [2]. Powyższe cechy sprawiają, że bakterie z gatunku Klebsiella pneumoniae są czynnikiem etiologicznym wielu rodzajów infekcji, w tym zakażeń układu moczowego, pokarmowego, zapalenia i rop-ni płuc, posoczrop-nicy, wstrząsu endotoksycznego, stanu zapalne-go zatok, ucha środkowezapalne-go, zapalenia szpiku, zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych oraz tkanek miękkich [3]. Jakkol-wiek pałeczki Klebsiella pneumoniae odpowiedzialne są przede wszystkim za zakażenia dróg oddechowych oraz moczowych, to ze względu na zdolność do wywoływania infekcji u pacjen-tów z osłabionym układem odpornościowym, stosunkowo często izolowane są także z infekcji ran przewlekłych.
Key words: antisepsis | biofilm | chronic wounds | Biofilm Based Wound Care | Klebsiella pneumoniae
jest zabronione i stanowi poważne naruszenie przepisów prawa autorskiego oraz grozi sankcjami prawnymi.
niły, że w ranach przewlekłych występują przede wszyst-kim bakterie w formie biofilmowej, a zastosowanie zaawan-sowanych metod mikroskopowych (w tym mikroskopii sił atomowych) umożliwiło określenie roli tej struktury prze-strzennej w procesie hamowania gojenia się ran [4−6]. Po-zwoliło to na opracowanie koncepcji leczenia ran przewle-kłych nazwanej Biofilm Based Wound Care (ang. BBWC, strategia leczenia ran przewlekłych objętych procesem in-fekcyjnym wywołanym przez drobnoustroje w formie bio-filmowej) [7, 8]. Zgodnie ze strategią BBWC, eradykacji bakterii w formie biofilmowej służyć ma częste i agresyw-ne opracowanie rany, zastosowanie wysokich dawek anty-biotyków o długim czasie działania, użycie szerokiego spek-trum środków „przeciwbiofilmowych” (dyspersyny B, inhi-bitorów Quorum Sensing czy laktoferyny) oraz antysepty-ków o niskiej cytotoksyczności i wysokiej sile bójczej.
Niestety, zasady BBWC nie mogą być w chwili obecnej w pełni stosowane w naszym kraju, w związku z niską dostęp-nością (oraz wysoką ceną) środków o charakterze „przeciw-biofilmowym”. Powszechnie stosowane są natomiast pozo-stałe dwa filary strategii BBWC – debridement chirurgiczny oraz antyseptyka. Oczyszczenie chirurgiczne rany, prowadzą-ce do odsłonięcia żywej, zdrowej tkanki, uważane jest za czyn-nik konieczny do zainicjowania postępów gojenia zakażonej rany przewlekłej. Drugim filarem koncepcji BBWC jest an-tyseptyka. Spośród wielu stosowanych w naszym kraju anty-septyków, do grupy nowoczesnych produktów nadających się do leczenia ran należy PVP-jod oraz dichlorowodorek okteni-dyny (jakkolwiek wartość PVP-jodu zmniejszona jest na sku-tek brązowej barwy utrudniającej obserwację postępów goje-nia). Innymi, pospolicie stosowanymi, antyseptykami są: di-glukonian chlorheksydyny, nadtlenek wodoru oraz mleczan etakrydyny. Trzeba mieć jednak świadomość, że antyseptyki te, z racji wykazywania wielu niekorzystnych efektów ubocz-nych, znalazły się na liście produktów, które powinny być za-stąpione/wycofane ze stosowania w tym obszarze aplikacji [9]. W środowisku rany przewlekłej obecne są czynniki, któ-re znacząco obniżają zdolność miejscowych środków prze-ciwdrobnoustrojowych do eradykacji patogenów. Zalicza się do nich:
– nieregularności w topologii rany oraz warstwy martwicy w fizyczny sposób utrudniające dostęp antyseptyku do źródła zakażenia;
– obecność krwi i wysięku, zmniejszających stężenie anty-septyku w ranie;
– obecność zawartych we krwi i wysięku białek oddziału-jących z antyseptykiem i neutralizuoddziału-jących jego działanie przeciwdrobnoustrojowe.
Szczepy Klebsiella pneumoniae charakteryzują się wysoką zdolnością tworzenia biofilmu i stosunkowo często stanowić mogą czynnik etiologiczny zakażeń ran przewlekłych. Z tego powodu, w niniejszej pracy podjęto się określenia
minimal-Concentration) pięciu popularnie stosowanych w leczeniu ran antyseptyków: powidonu jodu (PVP-jod), dichlorowo-dorku oktenidyny, nadtlenku wodoru, diglukonianu chlor-heksydyny oraz mleczanu etakrydyny względem szczepów
Klebsiella pneumoniae izolowanych z ran przewlekłych.
Materiały i metody
Szczepy bakteryjne
Badaniem objęto 20 szczepów Klebsiella pneumoniae izo-lowanych w latach 2008−2010 z zakażeń ran od pacjentów hospitalizowanych w kilku ośrodkach szpitalnych (Wro-cław, Poznań, Trzebnica).
Antyseptyki
W badaniach zastosowano 4 używane w leczeniu ran pre-paraty antyseptyczne, zawierające jako substancję aktywną: chlorheksydynę (Galla Med), PVP-jod (B. Braun), dichloro-wodorek oktenidyny (Schülke & Mayr), mleczan etakrydy-ny (Polfa Rzeszów) oraz nadtlenek wodoru (POCH).
Potwierdzenie metodą mikroskopową zdolności szczepów do tworzenia biofilmu
W celu potwierdzenia zdolności szczepów do tworzenia bio-filmu posłużono się metodą mikroskopową wykorzystującą zdolność odczynnika Congo Red (sól disodowa kwasu 4-ami- no-3-[4-[4-(1-amino-4-sulfonatonaftalen-2-ylo)diazenylo-fenylo]fenylo]diazenylonaftaleno-1-sulfonowego, Sigma-Al-drich) do niespecyficznego wiązania ze związkami posia-dającymi wiązania typu beta, wchodzącymi w skład śluzu zewnątrzkomórkowego. Na ograniczone teflonem mikro-skopowe szkiełko podstawowe naniesiono 300 μl zawie-siny bakteryjnej o gęstości 105 komórek/ml i poddano
in-kubacji 24 h/37°C. Po upływie tego czasu, w celu usunię-cia komórek w formie planktonicznej, zawiesinę odpłuka-no i pozostawioodpłuka-no do wyschnięcia. Następnie na szkiełko naniesiono 200 μl 10 mM roztworu chlorku cetylopirydy-ny (związku utrwalającego, Sigma-Aldrich) i pozostawio-no do wyschnięcia w temperaturze 37°C. Po upływie cza-su koniecznego do wyschnięcia, na szkiełko naniesiono roz-twór 2:1 Congo Red i 10% (vol/vol) Tween 80 i pozosta-wiono w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następ-nie, roztwór Congo Red odpłukano, a szkiełko pozostawio-no w temperaturze pokojowej do wyschnięcia. W celu wy-barwienia komórek bakteryjnych użyto wodnego roztworu barwnika Giemsy 1:3 (vol/vol) POCH (5 min/temp. poko-jowa). Do wizualnej oceny zdolności szczepów do
tworze-nia biofilmu posłużono się mikroskopem optycznym, w po-większeniu 1000×.
Ocena skuteczności badanych antyseptyków (wartości
MIC90) względem szczepów Klebsiella pneumoniae
w hodowli biofilmowej oraz planktonowej
Do określenia wartości MIC badanych antyseptyków za-stosowano metodę mikrorozcieńczeń na polistyrenowych płytkach 96-dołkowych (SARSTEDT) według wytycznych opracowanych przez NCCLSI. Z 24-godzinnej hodowli płyn-nej badanego szczepu sporządzano zawiesinę o gęstości 1×108
komórek/ml (0,5 MacFarlanda). Otrzymaną zawiesinę roz-cieńczono 100-krotnie za pomocą TBS w celu otrzymania za-wiesiny bakteryjnej o gęstości 1×106 komórek/ml. W
kolej-nym kroku badania naniesiono po 100 μl zawiesiny bakteryj-nej o gęstości 1×106 komórek/ml do odpowiednich rzędów
płytki 96-dołkowej. Tak przygotowaną płytkę titracyjną inku-bowano 24 h/37°C. Po zakończeniu inkubacji, zawiesinę usu-nięto, a dołki przepłukano 3-krotnie za pomocą 0,9% NaCl, po czym naniesiono do nich 100 μl Bulionu Mueller Hintona (MHB). Następnie do dołków płytki wprowadzono rozcień-czenia odpowiednich antyseptyków w postępie geometrycz-nym (Tabele 1−3) i pozostawiono na 24 h/37°C.
W celu oceny wpływu antyseptyków na bakterie w formie planktonicznej, 100 μl zawiesiny bakteryjnej naniesiono do dołków płytki wraz z rozcieńczeniami antyseptyków opisa-nymi w Tabelach 1−3. Następnie inkubowano płytkę przez 24 h/37°C. W celu określenia MIC antyseptyków użyto me-tody Richardsa opartej na ocenie redukcji bezbarwnego
chlorku 2,3,5-trójfenylotetrazoliowego (20 μl, 1% TTC, Flu-ka) do czerwonego formazanu. Do barwnej redukcji związ-ku dochodzi jedynie w obecności żywych, aktywnych me-tabolicznie drobnoustrojów. Za MIC przyjmowano stężenie antyseptyku w dołku, w którym po 24 godzinach od nakro-plenia TTC nie doszło do zmiany zabarwienia. Za MIC90 przyjmowano to stężenie antyseptyku, które prowadziło do zahamowania wzrostu 90% badanych szczepów. Każdy po-miar przeprowadzano w trzech powtórzeniach.
Wyniki
Wszystkie badane szczepy Klebsiella pneumoniae wy-kazywały się zdolnością do tworzenia biofilmu na szkle. W przypadku części szczepów, zjawisko wytwarzania ze-wnątrzkomórkowego śluzu zaobserwowano już po 2 godzi-nach od rozpoczęcia doświadczenia (Ryc. 1). Jest to intere-sujące, ponieważ według danych literaturowych, bakterie od momentu adhezji do podłoża potrzebują zazwyczaj około 4 godzin do zainicjowania syntezy śluzu [10].
Minimalne stężenie antyseptyków hamujące wzrost
Kleb-siella pneumoniae badane było za pomocą metody
opracowa-nej przez NCCLSI. Najniższą wartością (najwyższą skutecz-nością) MIC względem bakterii w formie planktonicznej wy-kazywał się dichlorowodorek oktenidyny, najmniej skutecz-nym związkiem był zaś mleczan etakrydyny. W przypadku hodowli biofilmowej, wartości MIC były 4–32× wyższe od stężeń skutecznych względem hodowli planktonicznej.
Naj-Nr dołka płytki 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Stężenie antyseptyku [μg/ml] 0,49 0,98 1,96 3,91 7,82 15,63 31,25 62,50 125,0 250,0 KP KN
Nr dołka płytki 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Stężenie PVP-jodu [mg/ml] 0,04 0,07 0,15 0,29 0,58 1,17 2,34 4,69 9,38 18,75 KP KN
KP – kontrola pozytywna; KN – kontrola negatywna (kontrola jałowości – pożywka mikrobiologiczna, do której nie wprowadzono zawiesiny bakteryjnej).
Tabela 2. Stężenia PVP-jodu użyte do określenia wartości MIC.
KP – kontrola pozytywna; KN – kontrola negatywna (kontrola jałowości – pożywka mikrobiologiczna, do której nie wprowadzono zawiesiny bakteryjnej).
Tabela 3. Stężenia nadtlenku wodoru użyte do określenia wartości MIC.
Nr dołka płytki 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Stężenie H2O2 [mg/ml] 0,015 0,03 0,06 0,12 0,24 0,47 0,94 1,88 3,75 7,5 KP KN
KP – kontrola pozytywna; KN – kontrola negatywna (kontrola jałowości – pożywka mikrobiologiczna, do której nie wprowadzono zawiesiny bakteryjnej).
Tabela 4. Ocena skuteczności badanych antyseptyków (wartości MIC90) względem szczepów Klebsiella pneumoniae w hodowli biofilmowej oraz planktonowej.
μg/ml Chlorheksydyna Oktenidyna Mleczan etakrydyny mg/ml PVP-jod H2O2
MIC90 plankton 3,91 1,96 >250 MIC90 plankton 4,69 1,88 MIC90 biofilm 125 31,25 >250 MIC90 biofilm 18,75 7,5
niższym MIC charakteryzowała się oktenidyna, największym zaś mleczan etakrydyny (Tabela 4). Oktenidyna wykazywa-ła zdolność bójczą w stosunku do 90% badanych szczepów w formie biofilmowej nawet w 32-krotnym rozcieńczeniu, podczas gdy chlorheksydyna w rozcieńczeniu 8-krotnym, a PVP -jod oraz nadtlenek wodoru w rozcieńczeniu 4-krot-nym (Tabela 5). Z powodu ograniczeń metody (konieczność rozcieńczenia wyjściowego stężenia antyseptyku), nie udało się określić dokładnego stężenia mleczanu etakrydyny sku-tecznego względem badanych szczepów Klebsiella
pneumo-niae, jednak w analizowanym przedziale stężeń, wszystkie
szczepy bakteryjne okazały się być oporne na ten antyseptyk.
Dyskusja
Antyseptyki zawierające badane substancje aktywne do-puszczone są do obrotu handlowego w różnej postaci i pod różnymi nazwami (Tabela 6).
Antyseptyk przeznaczony do stosowania w ranach powi-nien charakteryzować się niską cytotoksycznością oraz sze-rokim spektrum oddziaływania przeciwdrobnoustrojowe-go. Cytotoksyczność antyseptyków przeznaczonych do sto-sowania w ranach przewlekłych badana jest za pomocą re-ferencyjnych linii komórkowych, które w warunkach natu-ralnych odpowiedzialne są za gojenie się ran (keratynocyty oraz fibroblasty). Dane o cytotoksyczności produktu wzglę-dem tych linii komórkowych powinny być umieszczone na karcie informacyjnej produktu lub w innej ogólnie dostępnej przestrzeni informacyjnej (np. na stronie internetowej pro-ducenta). Należy mieć jednak świadomość, że cytotoksycz-ność mierzona na liniach referencyjnych in vitro nie pozwa-la w sposób wiarygodny oszacować siły oddziaływania anty-septyku na tkanki pacjenta w warunkach klinicznych (wiary-godniejsze dane przedstawiają metaanalizy kliniczne).
Podobnie jest w przypadku działania przeciwdrobno-ustrojowego antyseptyków. Rezultaty badań autorów tej pracy nieodmiennie wykazują, że szczepy szpitalne charak-Chlorheksydyna Oktenidyna Mleczan etakrydyny PVP-jod H2O2
Rozcieńczenie preparatu, przy którym osiągane jest MIC90 (względem bakte-rii w formie biofilmowej)
8× 32× Np. 4× 4×
Skuteczność antyseptyków stosowanych w różnych rejonach aplikacji może zostać osłabiona na skutek minimalnego fizycznego rozcieńczenia preparatów przez specyficzne dla biotopu płyny i wydzieliny (np. wysięk, ropę, krew, etc.). Np. – niemożliwe do określenia na skutek nieaktywności w badanym przedzia-le stężeń; (n=20).
Grupa chemiczna Substancja czynna Stosowane preparaty
Biguanidy Chlorheksydyna Roztwór 2% chlorheksydyny (zamawiany aptecz-nie)
Związki halogenowe Powidon jodu Braunovidon®
Braunol® Związki utleniające Nadtlenek wodoru Crystacide®
Woda utleniona Bispirydyny Dichlorowodorek oktenidyny Octenilin® żel
Octenilin® płyn do irygacji Octenisept®
Barwniki akrydynowe Mleczan etakrydyny Ethacridin lactate Rivanol Solutio Ethacridini
Tabela 6. Przykłady dostępnych na rynku polskim preparatów antyseptycznych, stosowanych w leczeniu ran, zawierających jako substancje ak-tywne chlorheksydynę, powidon jodu, nadtlenek wodoru, dichlorowodorek oktenidyny i mleczan etakrydyny.
Tabela 7. Mechanizm działania badanych substancji antyseptycznych [14, 15].
Antyseptyk Mechanizm działania
Chlorheksydyna W małych stężeniach uszkadzanie błony cytoplazmatycznej poprzez zwiększenie jej przepuszczalności; w dużych stężeniach koagula-cja cytoplazmy, hamowanie układów enzymatycznych
Oktenidyna Oddziaływanie na błonę komórkową i hamowanie układów enzymatycznych
Powidon jodu Utlenianie grup sulfhydrylowych białek, utlenianie nienasyconych wiązań kwasów tłuszczowych Nadtlenek wodoru Utlenianie grup sulfhydrylowych białek, uszkodzenie DNA
2
1
teryzują się kilku-, a nawet kilkunastokrotnie wyższą opor-nością na antyseptyki niż szczepy referencyjne używane standardowo w badaniach mających na celu doprowadzenie do rejestracji antyseptyku i dopuszczenie go do obrotu han-dlowego. Podwyższona oporność szczepów klinicznych jest niezwykle istotna w przypadku aplikacji antyseptyku w ob-szarze, w którym dojść może do jego rozcieńczenia/neutra-lizacji na skutek obecności krwi, wysięku czy ropy. W ta-kim przypadku, racjonalny wybór produktu antyseptycz-nego możliwy jest jedynie przy znajomości lokalantyseptycz-nego profi-lu oporności danych gatunków bakteryjnych na najczęściej stosowane antyseptyki. Profil taki pozwala na określenie: – antyseptyku charakteryzującego się najniższym MIC
względem lokalnej populacji szczepów określonego ga-tunku;
– dopuszczalnego rozcieńczenia antyseptyku, które wciąż wykazywać będzie aktywność przeciwdrobnoustrojową względem lokalnej populacji szczepów określonego ga-tunku.
Należy pamiętać, że MIC antyseptyku wykazywane względem drobnoustrojów w formie biofilmowej jest wie-lokrotnie wyższe od minimalnego stężenia antyseptyku skutecznego względem bakterii planktonicznych. Obecnie, zgodnie z najlepszą wiedzą autorów, brak jest normy (kra-jowej czy europejskiej), która pozwoliłaby na standaryzację wyników dotyczących minimalnego stężenia hamującego antyseptyków względem bakterii w formie biofilmowej. Jed-nak zastosowanie opisanej w artykule metody, opracowanej według zaleceń NCCLSI i zmodyfikowanej przez autorów, jest stosunkowo nieskomplikowane oraz niedrogie, i z całą pewnością wykonywane może być przez laboratorium kli-niczne. Podobnie ma się rzecz w przypadku opisanej me-tody mikroskopowej, która umożliwia wizualną ocenę siły tworzenia biofilmu w konkretnym czasie. Prawdą jest, że szybkość tworzenia biofilmu zależy od właściwości gene-tycznych szczepu, ilości substratów odżywczych w środowi-sku, jak i rodzaju powierzchni, do której bakterie adheru-ją. Jednakże zastosowanie powyższej metody służyć może za
A
B
D
C
Ryc. 1. Mikroskopowe potwierdzenie zdolności szczepów do tworzenia biofilmu. Zdolność szczepu 1(16M) do tworzenia biofilmu na szkiełku mikroskopowym.
A – po godzinie od wprowadzenia zawiesiny na szkiełko mikroskopowe: komórki bakteryjne (strzałka 1) wykazywały zdolność do trwałego przylegania do po-wierzchni. B – po 2 godzinach: skupiska komórek bakteryjnych zaczynają wydzielać śluz zewnątrzkomórkowy (strzałka 2). C – w 8. godzinie: większość sku-pisk bakteryjnych otoczonych jest warstwą śluzu. D – w 24. godzinie od rozpoczęcia doświadczenia: większa część szkiełka pokryta jest gęstą, pokrywającą komórki bakteryjne, warstwą śluzu.
pewien wyznacznik siły tworzenia tej struktury przez okre-ślony szczep.
Jak to przedstawiono w części pracy opisującej wyniki, siła bójcza antyseptyków względem bakterii Klebsiella
pneu-moniae w formie biofilmowej oraz planktonicznej
prezentu-je się następująco: oktenidyna > chlorheksydyna > PVP-jod/ H2O2 > mleczan etakrydyny.
Nieskuteczność mleczanu etakrydyny w analizowanym za-kresie stężeń nie jest zaskakująca. O braku aktywności prze-ciwdrobnoustrojowej tego antyseptyku oraz efektach ubocz-nych, będących rezultatem jego stosowania, wiadomo z róż-nych źródeł już od przynajmniej 10 lat [11–13]. Mimo to, prawdopodobnie z racji przystępnej ceny, produkt ten wciąż jest powszechnie używany w naszym kraju, zarówno w wa-runkach szpitalnych, jak i ambulatoryjnych. Niestety, nie wia-domo do jak wielu przypadków niepowodzenia terapeutycz-nego dojść mogło na skutek stosowania tej substancji.
PVP-jod jest skutecznym antyseptykiem, z powodzeniem stosowanym w leczeniu ran, jednak w niniejszym badaniu, podobnie jak nadtlenek wodoru, wykazał się mniejszą sku-tecznością w eradykacji biofilmu niż chlorheksydyna oraz oktenidyna. Główną cechą odróżniającą te dwie grupy anty-septyków (PVP-jod i H2O2vs. oktenidyna i chlorheksydyna) jest ich mechanizm działania (Tabela 7). PVP-jod i nadtle-nek wodoru to związki reagujące niespecyficznie (poprzez reakcję utleniania), natomiast oktenidyna i chlorheksydyna oddziałują specyficznie (m.in. na drodze interakcji z błoną komórkową bakterii i ich systemami enzymatycznymi) [14].
Należy zwrócić uwagę na fakt, że wszystkie szczepy
Kleb-siella pneumoniae objęte badaniem zdolne były do
wyso-kiego poziomu produkcji macierzy zewnątrzkomórkowej (Ryc. 1), z którą antyseptyki, takie jak PVP-jod czy H2O2, wchodzą w reakcję właśnie na skutek niespecyficznego me-chanizmu działania. Śluz zewnątrzkomórkowy należy do
P B P B P B P B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2 3 1 4 KN KP 250 125 62,5 31,25 15,63 7,82 3,91 1,96 0,98 0,49 μg/ml P B P B P B P B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2 3 1 4 KN KP 250 125 62,5 31,25 15,63 7,82 3,91 1,96 0,98 0,49 μg/ml
oktenidyny; B – mleczanu etakrydyny.
1, 2, 3, 4 – numery porządkowe szczepów bakte-ryjnych poddanych badaniu. 1–12 – numery dołka. B – hodowla biofilmowa, P – hodowla planktonicz-na. Czerwone zabarwienie dołka jest efektem ak-tywności metabolicznej żywych drobnoustrojów. Zabarwienie jasnożółte zawiesiny świadczy o sile bójczej danego stężenia antyseptyku wystarczają-cej do zahamowania wzrostu drobnoustrojów. Za-barwienie czerwone dołków 1–10, widoczne na Ry-cinie 2B, świadczy o braku aktywności bójczej mle-czanu etakrydyny względem badanych szczepów w analizowanym przedziale stężeń. Dołki 11 – trola dodatnia (KD, jałowy bulion); dołki 12 – kon-trola ujemna (KU, zawiesina bakteryjna, do której nie dodano antyseptyku).
ność bakterii na środki przeciwdrobnoustrojowe i prawdo-podobnie jego obecność jest bezpośrednio odpowiedzialna za przedłużający się stan zapalny rany przewlekłej. Jednak w kontekście antyseptyki, istotniejsza jest eradykacja komó-rek bakteryjnych, które syntezują i odtwarzają warstwy tej zewnątrzkomórkowej macierzy. Antyseptykami, które naj-skuteczniej prowadziły do hamowania wzrostu komórek w formie biofilmowej, były antyseptyki działające specyficz-nie − dichlorowodorek oktenidyny (MIC90=31,25 μg/ ml) oraz diglukonian chlorheksydyny (MIC90=125 μg/ml). Jednak chlorheksydyna, mimo że wciąż szeroko stosowa-na w leczeniu ran przewlekłych, zstosowa-najduje się stosowa-na liście an-tyseptyków, które należy wycofać z tego typu zastosowań na skutek jej właściwości cytotoksycznych, mutagennych i neurotoksycznych [9]. Takich właściwości nie stwierdzono w przypadku dichlorowodorku oktenidyny, który wykazu-je dodatkową cechę predysponującą do stosowania w lecze-niu ran przewlekłych − mianowicie tzw. efekt przedłużone-go działania (ang. residual effect) – zdolność do utrzymu-jącego się (min. 24 godzin) połączenia z macierzą komórek gospodarza miejscu aplikacji i uwalniania z niego w stęże-niach przeciwdrobnoustrojowych, ale już nie cytotoksycz-nych [14]. Powyższe dane oraz uzyskane w pracy wyniki wskazują na dichlorowodorek oktenidyny jako antyseptyk, który powinien być stosowany w przypadku zakażeń ran przewlekłych szczepami Klebsiella pneumoniae.
Deklaracja przejrzystości:
Praca zrealizowana w ramach programu statutowego 341.
Konflikt interesów: nie zgłoszono.
1. Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller MA (eds). Medical Microbiology, 6th ed. Elsevier Publishing, Philadelphia, 2008.
2. Watnick P, Kolter R. Biofilm, city of microbes. J Bacteriol 2000;182(10): 2675–2679.
3. Peleg AY, Hooper DC. Hospital-acquired infections due to Gram-negative bacteria. N Engl J Med 2010;362(19):1804−1813.
4. Bjarnsholt T, Kirketerp-Møller K, Jensen PØ et al. Why chronic wounds will not heal: a novel hypothesis. Wound Repair Regen 2008;16(1):2−10. 5. Jensen PØ, Bjarnsholt T, Phipps R et al. Rapid necrotic killing of poly-morphonuclear leukocytes is caused by quorum-sensing-controlled production of rhamnolipid by Pseudomonas aeruginosa. Microbiology 2007;153(5):1329−1338.
6. Widegrow AD. Persistence of the chronic wound – implicating biofilm. Wound Healing Southern Africa 2008;1(2):5–7.
7. Wolcott R, Dowd S, Kennedy J, Jones C. Biofilm – Based Wound Care. Adv Wound Care 2010;1(3):311–318.
8. Wolcott RD, Rhoads DD. A study of biofilm-based wound management in subjects with critical limb ischaemia. J Wound Care 2008;17(4):145–155. 9. Kramer A, Daeschlein G, Kammerlander G et al. An assessment of the
evidence on antiseptics: a consensus paper on their use in wound care. J Wound Care 2004;13(4):1−7.
10. Flemming H, Wingender J, Szewzyk U. Biofilm Highlights. Springer Series on Biofilm, vol. 5. Springer Verlag, Heidelberg, New York, 2008. 11. Wugmeister M, Summers WC. A bacterial mutagenicity study of
Ri-vanol, an acridine derivative used as an abortifacient. Yale J Biol Med 1983;56(1):9−13.
12. Yamamoto T, Tamura Y, Yokota T. Antiseptic and antibiotic resistan-ce plasmid in Staphylococcus aureus that possesses ability to confer chlorhexidine and acrinol resistance. Antimicrob Agents Chemother 1988;32(6):932–935.
13. Oie S, Kamiya A. Bacterial contamination of commercially available etha-cridine lactate (acrinol) products. J Hosp Infect 1996,34(1):51–58. 14. Kramer A, Müller G, Reichwagen S, Widulle H, Heldt P, Nürnberg W.
Octe-nidine, Chlorhexidine, Iodine and Iodophores. Georg Thieme, Stuttgart, New York, 2008.
15. McDonell G, Russell AD. Antiseptics and disinfectants: activity, action, and resistance. Clin Microbiol Rev 1999;12(1):147–179.
