DOROTA TERYKS-WOŁYNIEC1 | IRENA CHOROSZY-KRÓL1
ZASTOSOWANIE METOD ALTERNATYWNYCH DO WYKRYWANIA
E. COLI O157 W PRODUKTACH ŻYWNOŚCIOWYCH
THE USE OF ALTERNATIVE METHODS FOR THE DETECTION OF
E. COLI O157 IN FOOD PRODUCTS
STRESZCZENIE: Wstęp Komensalne szczepy Escherichia coli nie są chorobotwórcze dla czło-wieka i stanowią integralną część mikroflory jelitowej. Wykazano jednak, że niektóre szczepy tych bakterii są odpowiedzialne za biegunki u niemowląt oraz zapalenia żołądka i jelit. Wero-toksyczne szczepy E. coli, zaliczane między innymi do serotypu O157, należą do groźnych en-teropatogenów przenoszonych przez żywność. Przebieg i objawy kliniczne zakażenia E. coli O157 zależą od cech osobniczych oraz czynników bakteryjnych, a przyczyną ogólnonarządo-wych zmian choroboogólnonarządo-wych są toksyny Shiga. Celem pracy była ocena zastosowania metody alternatywnej, wykorzystującej system 3M™ MDS do wykrywania E. coli O157 w produktach żywnościowych. Materiał i metody Materiał do badań stanowiły próbki żywności uzyskane w ramach współpracy z Państwową Stacją Sanitarno-Epidemiologiczną we Wrocławiu. Bada-nia wykonano równocześnie dwiema metodami: 3M™ MDS E. coli O157:H7 (w celu szybkie-go wykrywania bakterii w próbkach żywności dzięki wykorzystaniu izotermicznej amplifikacji i zjawiska bioluminescencji) oraz techniką ELFA systemu VIDAS®, w aparacie mini VIDAS® z ze-stawem VIDAS® UP E. coli O157:H7. Wyniki W badaniach własnych na 73 przebadanych pró-bek żywności, w trzech przypadkach przy zastosowaniu techniki 3M™ MDS E. coli O157:H7 oraz w jednym przypadku przy wykorzystaniu zestawu VIDAS® UP E. coli O157:H7 uzyskano wyni-ki fałszywie dodatnie, których nie potwierdzono metodą referencyjną. Wnioswyni-ki 1. Metody al-ternatywne – zarówno 3M™ MDS przy wykorzystaniu izotermicznej amplifikacji i zjawiska bio-luminescencji, jak i technika ELFA systemu VIDAS® – umożliwiają w znacznie krótszym czasie, w porównaniu z referencyjną metodą hodowlaną, wykrywanie w produktach żywnościowych pałeczek E. coli należących do serotypu O157. 2. Uzyskanie wyników fałszywie dodatnich przy wykorzystaniu metod alternatywnych do wykrywania E. coli O157 w produktach żywnościo-wych może wskazywać na niższą swoistość tych metod w porównaniu z referencyjnymi me-todami hodowlanymi.
SŁOWA KLUCZOWE: diagnostyka, Escherichia coli O157, żywność
ABSTRACT: Introduction Commensal Escherichia coli strains are not pathogenic for man and constitute an integral part of the intestinal microflora. However it is shown that certain strains of these bacteria are responsible for infant diarrhea and gastroenteritis. Verotoxic Escherichia coli (VTEC) strains include, inter alia, serotype O157 are dangerous food-borne enteropatho-gens. The course and clinical symptoms of E. coli O157 infection depend on individual charac-teristics and bacterial factors, and the cause of systemic lesions are Shiga toxin. The aim of this paper was evaluate the use of an alternative method using 3M™ MDS system for detecting E. coli O157 in food products. Material and methods Material consisted of food samples obta-ined in cooperation with the State Sanitary-Epidemiological Inspection in Wroclaw. The study was performed at the same time by two methods: 3M™ MDS E. coli O157:H7 in order to quickly
1 Zakład Nauk Podstawowych Wydziału Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Medycznego im. Piastów Śląskich we Wrocławiu 2 Pracownia Higieny Żywności
i Przedmiotów Użytku Wojewódzkiej Stacji Sanitarno-Epidemiologicznej we Wrocławiu
} JOLANTA SAROWSKA
Zakład Nauk Podstawowych, Wydział Nauk o Zdrowiu,
Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu,
ul. Chałubińskiego 4, 50-368 Wrocław, e-mail: jolanta.sarowska@umed.wroc.pl
Wpłynęło: 31.08.2016 Zaakceptowano: 10.10.2016 DOI: dx.doi.org/10.15374/FZ2016048
detect these bacteria in food samples by using an isothermal amplification and biolumine-scence technique and ELFA VIDAS® system, mini VIDAS® kit VIDAS® UP E. coli O157:H7. Results In our study, out of 73 tested samples of food in the three cases, using techniques 3M™ MDS E. coli O157:H7 and in one case using a set of VIDAS® UP E. coli O157:H7, obtained false positi-ve results, which are not confirmed by the reference method. Conclusions 1. Alternatipositi-ve me-thods, either 3M™ MDS using an isothermal amplification and bioluminescence, and the tech-nique ELFA VIDAS® system, make it possible in a much shorter time, in comparison with a re-ference culture method, the detection of E. coli, bacilli belonging to the serotype O157 in food products. 2. Obtaining of false positive results using alternative methods for the detection of E. coli O157 in food products may indicate a lower specificity of these methods compared with the reference breeding techniques.
KEY WORDS: diagnostics, Escherichia coli O157, food
Rezerwuarem tych bakterii są zwierzęta – tj. bydło, owce i kozy – których odcinek rekto-analny przewodu pokarmo-wego jest skolonizowany przez szczepy EHEC. Obecność
E. coli O157 w odchodach zwierząt oraz długi okres
wy-stępowania ich w środowisku może skutkować skażeniem wody i żywności [2].
Niska dawka infekcyjna (od 10 do 100 komórek), zdol-ność do namnażania się w warunkach chłodniczych oraz oporność na niektóre środki konserwujące zwiększają ry-zyko wywołania zakażenia po spożyciu wody lub żywno-ści zanieczyszczonej bakteriami E. coli. Te patogenne drob-noustroje były najczęściej izolowane z surowej i niedogo-towanej wołowiny oraz mięsa innych przeżuwaczy, a także kiełków, niepasteryzowanych soków owocowych i warzyw-nych oraz wody. Przypadki infekcji najczęściej były spowo-dowane spożyciem: żywności nieodpowiednio przetworzo-nej termicznie, niepasteryzowanego mleka i jego przetwo-rów, owoców lub warzyw, żywności suszonej lub liofilizo-wanej [1, 3].
Jak wynika z danych epidemiologicznych, ponad poło-wę rejestrowanych w krajach europejskich przypadków za-każenia VTEC wywołują werotoksyczne pałeczki E. coli O157, a znacznie rzadziej pałeczki należące do jednej z po-nad 100 innych grup antygenowych, wśród których wykry-wa się szczepy werotoksyczne. Dane te świadczą o bardzo dużym udziale pałeczek Escherichia coli nie-O157 wśród VTEC i wskazują, że w krajach, w których rutynowa dia-gnostyka w kierunku werotoksycznych szczepów jest oparta tylko na poszukiwaniu E. coli O157, wiele zakażeń może po-zostać w rzeczywistości nierozpoznanych [4].
Badania mikrobiologiczne próbek żywności są ruty-nowo prowadzone z zastosowaniem standardowych me-tod hodowlanych, które w przypadku wykrywania pato-genów jelitowych wymagają kilkudniowej inkubacji w róż-nych podłożach, co przy konieczności potwierdzenia uzy-skanych wyników za pomocą testów biochemicznych i se-rologicznych znacznie wydłuża czas analizy laboratoryj-nej. Dodatkowy problem stwarza także występowanie
WSTĘP
Komensalne szczepy Escherichia coli nie są chorobotwór-cze dla człowieka i stanowią integralną część mikroflory je-litowej. Wykazano jednak, że niektóre szczepy tych bakte-rii są odpowiedzialne za biegunki u niemowląt oraz zapale-nia żołądka i jelit.
Patogenne szczepy Escherichia coli zostały podzielone na typy. Istnieje sześć patotypów związanych z biegunką:
t produkujące toksynę Shiga (ang. Shiga toxin – Stx) E.
coli (ang. Shiga toxin-producing E. coli – STEC), które
można podzielić na werotoksyczne E. coli (ang. veroto-xin-producing E. coli – VTEC) oraz enterokrwotoczne
E. coli (ang. enterohemorrhagic E. coli – EHEC);
t enterotoksyczne E. coli (ang. enterotoxic E. coli – ETEC);
t enteropatogenne E. coli (ang. enteropathogenic E. coli – EPEC);
t enteroagregacyjne E. coli (ang. enteroaggregative E. coli – EAEC);
t enteroinwazyjne E. coli (ang. enteroinvasive E. coli – EIEC);
t adherencyjne E. coli (ang. diffusely adherent E. coli – DAEC) [1].
Do groźnych enteropatogenów przenoszonych przez żywność należą VTEC zaliczane między innymi do sero-typu O157, które stanowią poważny problem epidemiolo-giczny. Patogenne szczepy enterokrwotoczne, które u ludzi mogą wywołać łagodne biegunki, mogą także prowadzić do rozwoju ciężkich zakażeń, takich jak: krwotoczne zapa-lenie jelita grubego, zespół hemolityczno-mocznicowy czy małopłytkowa plamica zakrzepowa. Przebieg i objawy kli-niczne zakażenia EHEC, w tym E. coli O157, zależą od cech osobniczych oraz czynników bakteryjnych, a przyczyną ogólnonarządowych zmian chorobowych są toksyny Shi-ga. Czynnikami wirulencji szczepów EHEC, prócz toksyn Stx1 i Stx2, są m.in.: wyspa patogenności LEE (ang. locus of enterocyte effacement), plazmid wirulencji oraz adhezyny.
w próbkach żywności bakterii, które utraciły zdolność do wzrostu na podłożach stałych (ang. viable but noncultu-rable – VBNC), ale pozostają metabolicznie aktywne i za-chowują cechy wirulencji.
Szczególnego znaczenia nabierają zatem metody o naj-większej czułości i swoistości, pozwalające jednocześnie na szybkie wykrycie bakterii patogennych [1, 5]. W labo-ratoriach wykorzystywane są zautomatyzowane zestawy do immunodetekcji mikroorganizmów chorobotwórczych VIDAS® oraz techniki związane z analizą specyficznych se-kwencji ich kwasów nukleinowych. Znacznie dokładniejszą, w porównaniu z PCR (ang. polymerase chain reaction), jest metoda izotermalnej amplifikacji DNA (ang. loop-mediated isothermal amplification – LAMP). Wysoka swoistość me-tody LAMP – w porównaniu z PCR – jest związana z za-stosowaniem większej liczby starterów, rozpoznających kil-ka różnych sekwencji na matrycowym DNA, podczas gdy w PCR stosowane są zwykle dwa startery specyficzne dla da-nej sekwencji DNA [6].
Celem pracy była ocena zastosowania metody alterna-tywnej wykorzystującej system 3M™ MDS do wykrywa-nia bakterii z rodzaju E. coli O157 w produktach żywno-ściowych.
MATERIAŁY I METODY
Materiał do badań stanowiły 73 próbki żywności uzy-skane w ramach współpracy z Państwową Stacją Sanitarno- -Epidemiologiczną we Wrocławiu. Badano mięso i produk-ty mięsne oraz warzywa, kiełki i przyprawy. Badania wyko-nano równocześnie dwiema metodami:
t metodą alternatywną w oparciu o zastosowanie urzą-dzenia do diagnostyki molekularnej 3M™ – w której wykorzystano testy 3M™ Molecular Detection As-say E. coli O157:H7 używane z molekularnym sys-temem detekcji (MDS) w celu szybkiego wykrywa-nia tych bakterii w próbkach żywności dzięki wyko-rzystaniu izotermicznej amplifikacji i zjawiska bio-luminescencji;
t techniką ELFA (ang. enzyme linked fluorescent as-say) systemu VIDAS®, który automatycznie przepro-wadza kolejne etapy procesu w aparacie mini Vidas®,
z zestawem VIDAS® UP E. coli O157:H7 dzięki wy-korzystaniu rekombinowanej proteiny fagowej do wychwytywania obecnych w badanych próbkach pałeczek E. coli O157 H7.
Wyniki dodatnie uzyskane metodami alternatywnymi wymagają potwierdzenia hodowlaną metodą referencyjną zgodnie z normą PN-EN ISO 16654:2002 [7].
WYNIKI
Przeprowadzono analizę mikrobiologiczną próbek żywno-ści, które obejmowały dwie grupy produktów spożywczych: mięso i produkty mięsne oraz warzywa, kiełki i przyprawy. W Tabeli 1 przedstawiono dane dotyczące porównania wy-ników badań uzyskanych metodami alternatywnymi z wyko-rzystaniem testów 3M™ MDS i VIDAS® oraz referencyjną me-todą hodowlaną PN-EN ISO, zastosowaną w celu potwier-dzenia obecności pałeczek E. coli O157 w próbkach żywności. W badaniach własnych (na 73 przebadanych próbek żyw-ności) w trzech przypadkach przy zastosowaniu techniki 3M™ MDS E. coli O157:H7 oraz w jednym przypadku przy wykorzystaniu zestawu VIDAS® UP E. coli O157:H7 uzy-skano wyniki fałszywie dodatnie, których nie potwierdzono metodą referencyjną PN-EN ISO (Tabela 1, Ryc. 1). Błędne wyniki analiz dotyczyły dwóch próbek zawierających suro-we warzywa testowanych metodą LAMP oraz jednej próbki mięsa wołowego, w przypadku której fałszywie dodatni wy-nik uzyskano dla obu zastosowanych w badaniach metod al-ternatywnych.
Próbki żywności (n)
Wyniki potwierdzone przez obie zastoso-wane metody alternatywne
Wyniki potwierdzone wyłącznie metodą alternatywną albo referencyjną
PP PN FP FN 3M™ MDS VIDAS® 3M™ MDS VIDAS® 3M™ MDS VIDAS® 3M™ MDS VIDAS® I (41) 0/41 0/41 40/41 40/41 1/41 1/41 0/41 0/41 II (32) 0/32 0/32 30/32 32/32 2/32 0/32 0/32 0/32 73 0/73 0/73 70/73 72/73 3/73 1/73 0/73 0/73
Tabela 1. Porównanie wyników badań uzyska-nych metodami alternatywnymi (3M™ MDS i VIDAS®) oraz metodą referencyjną PN-EN ISO do wykrywania pałeczek E. coli O157 w prób-kach żywności.
I – mięso i produkty mięsne; II – warzywa, kiełki i przyprawy; PP – prawdziwie pozytywne; PN – praw-dziwie negatywne; FP – fałszywie pozytywne; FN – fałszywie negatywne.
Ryc. 1. Częstość wykrywania pałeczek E. coli O157H7 metodą izotermicz-nej amplifikacji w próbkach żywności.
OMÓWIENIE
Analiza wyników badań własnych nie potwierdziła obec-ności pałeczek E. coli O157 w 73 testowanych próbkach żywności. Wyniki badań uzyskane przez Laboratorium Za-kładu Badania Żywności i Przedmiotów Użytku Narodowe-go Instytutu Zdrowia PubliczneNarodowe-go – PaństwoweNarodowe-go Zakładu Higieny oraz laboratorium Państwowej Inspekcji Sanitarnej w latach 2007–2008 świadczą o sporadycznym izolowaniu na terenie Polski szczepów E. coli O157, a tym samym o ni-skim stopniu ryzyka wystąpienia zachorowań wywołanych tym serotypem u ludzi, co potwierdzają także dane z aktual-nych raportów [8, 9].
Na podstawie danych pochodzących z raportu z krajów Unii Europejskiej oraz z Islandii, Liechtensteinu, Norwegii i Szwajcarii za 2013 rok, laboratoryjnie potwierdzono 6043 przypadki zakażeń VTEC u ludzi, co w porównaniu z ro-kiem 2012 wskazuje na wzrost o 5,9%. Z kolei, biorąc pod uwagę żywność, występowanie werotoksycznych szczepów
E. coli stwierdzono w 2,5% próbek mięsa wołowego oraz
w 5% przebadanych próbek produktów mlecznych. Spośród wyizolowanych szczepów VTEC – zarówno z zakażeń, jak i z produktów żywnościowych – serotyp O157 występował najczęściej [9].
W opracowaniu Pappelbauma i wsp. przedstawiono cha-rakterystykę potencjalnych zagrożeń związanych ze skaże-niem żywności werotoksycznymi serotypami E. coli oraz omówiono chorobotwórczość tych pałeczek u ludzi [10]. Na podstawie przeprowadzonej analizy można zaobserwo-wać, że na terenie Europy w latach 2004–2011 VTEK E. coli O157 izolowano najczęściej z próbek surowego mięsa woło-wego oraz warzyw.
System 3M™ MDS do wykrywania Salmonella, Listeria i Escherichia coli O157 wykorzystuje metodę LAMP opar-tą na izotermicznej amplifikacji DNA przez polimerazę Bst w stałej temperaturze 60°C, z zastosowaniem starterów zna-kowanych pirofosforanem (PPi). Wyniki testu, które opie-rają się na pomiarze ilości ATP wytworzonego z uwolnio-nego PPi, są monitorowane luminometrycznie za pomo-cą systemu lucyferyna-lucyferaza. Urządzenie jest zaopa-trzone w oprogramowanie umożliwiające przetwarzanie uzyskanych pomiarów i przedstawienie wyników w posta-ci umownych jednostek świetlnych RLU (ang. relative light unit) w ciągu trwającego 75 minut cyklu, co włącznie z po-przedzającym wykonanie testu etapem preinkubacji znacz-nie skraca całkowity czas analizy w porównaniu z referen-cyjną metodą hodowlaną PN-EN ISO [11].
Hara-Kudo i wsp. zastosowali metodę LAMP do wy-krywania werotoksycznych (VT) serotypów E. coli (O157, O26, O111) i porównywali czułość oraz szybkość detekcji tych bakterii w próbkach mięsa wołowego i kiełkach rzod-kiewki, analizując także wyniki uzyskane metodą PCR oraz standardową metodą hodowli lub immunoseparacji
magnetycznej [12]. Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że metoda LAMP umożliwiła szybkie wy-krywanie szczepów VT E. coli w większości badanych pró-bek żywności, podczas gdy wykorzystanie PCR do detekcji tych drobnoustrojów nie było skuteczne w przypadku poło-wy badanych próbek zawierających kiełki rzodkiewki. Z ko-lei Zhao i wsp. opracowali metodę szybkiej detekcji E. coli O157 w żywności w oparciu o technikę izotermicznej am-plifikacji i zaprojektowali 6 starterów umożliwiających wy-krywanie charakterystycznych sekwencji genów rfbE, stx1 i stx2, przy użyciu których przetestowano 417 szczepów
Escherichia coli pochodzących z różnych próbek
żywno-ści [13]. Uzyskane wyniki charakteryzowały się wysoką czu-łością wynoszącą odpowiednio dla trzech badanych genów: 100%, 95,3% oraz 96,3%.
W badaniach własnych w trzech przypadkach (na 73 przebadanych różnych próbek żywności) przy zastosowaniu metody LAMP uzyskano wyniki fałszywie dodatnie, któ-rych nie potwierdzono metodą referencyjną PN-EN ISO. Pewne problemy ze swoistością metody izotermalnej ampli-fikacji zostały zaobserwowane także w przypadku wykrywa-nia pałeczek Salmonella, kiedy to zwrócono uwagę na poja-wianie się wyników fałszywie dodatnich z pałeczkami z ro-dzaju Citrobacter, co może wskazywać na konieczność pre-cyzyjniejszego dobrania starterów w celu poprawy parame-trów analitycznych [11]. Fałszywie dodatnie wyniki uzy-skane tą metodą zgłaszane były także przez innych auto-rów [14]. Zastosowanie w technice LAMP kilku starterów w znacznie wyższym stężeniu niż jest to przyjęte w trady-cyjnej metodzie PCR może prowadzić do wystąpienia nie-swoistej amplifikacji indukowanej poprzez tworzenie się di-merów starterów. Innym wyjaśnieniem tego zjawiska mo-głaby być amplifikacja DNA pochodzącego z uszkodzonych lub martwych komórek, co uniemożliwia potwierdzenie ich obecności metodami standardowymi.
WNIOSKI
Metody alternatywne – zarówno 3M™ MDS przy wyko-rzystaniu izotermicznej amplifikacji i zjawiska biolumine-scencji, jak i technika ELFA systemu VIDAS® – umożliwia-ją w krótszym czasie, w porównaniu z referencyjną metodą hodowlaną, wykrywanie w produktach żywnościowych pa-łeczek E. coli należących do serotypu O157.
Uzyskanie wyników fałszywie dodatnich przy wykorzy-staniu metod alternatywnych do wykrywania E. coli O157 w produktach żywnościowych może wskazywać na niższą swoistość tych metod w porównaniu z referencyjnymi me-todami hodowlanymi.
PIŚMIENNICTWO
1. Baldy-Chudzik K, Bok E, Mazurek J. Znane i nowe warianty patogennych
Escherichia coli jako konsekwencja plastycznego genomu. Postepy Hig Med
Dosw 2015;69:345–361.
2. Kutkowska J, Michalska-Szymaszek M, Matuszewska R, Chmiel E, Urbanik--Sypniewska T. Antygeny powierzchniowe i czynniki wirulencji Escherichia
coli O157. Post Mikrobiol 2015;54(1):53–64.
3. Januszkiewicz A. Werotoksyczne pałeczki Escherichia coli – epidemiologia, chorobotwórczość, lekooporność. Med Dośw Mikrobiol 2012;64(4):315–336. 4. Scientific report of EFSA and ECDC. The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2013. EFSA Journal 2015;13(1):3991.
5. Oliver JD. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathoge-nic bacteria. FEMS Microbiol Rev 2010;34(4):415–425.
6. Wang F, Jiang L, Ge B. Loop-mediated isothermal amplification assays for de-tecting Shiga-toxin-producing Escherichia coli in ground beef and human stools. J Clin Microbiol 2012;50(1):91–97.
7. Norma PN-EN ISO 16654:2002. Mikrobiologia żywności i pasz – horyzontal-na metoda wykrywania Escherichia coli O157.
K. Rozpowszechnienie Escherichia coli O157 w żywności z rynku krajowego. Bromat Chem Toksykol 2009;3:574–577.
9. Osek J, Wieczorek K. Występowanie zoonoz oraz czynników zoonotycznych u zwierząt i w żywności w Europie w 2013 r. Życie Wet 2015;90(4):210–216. 10. Pappelbaum K, Kasprzak J, Czaczyk K. Występowanie werotoksycznych
Escherichia coli w żywności, ze szczególnym uwzględnieniem serotypu
O104:H4. Żywność Nauka Technologia Jakość 2015;5(102):33–48. 11. Kuchta T, Knutsson R, Fiore A et al. A decade with nucleic acid-based
mi-crobiological methods in safety control of foods. Lett Appl Microbiol 2014;59(3):263–271.
12. Hara-Kudo Y, Nemoto J, Ohtsuka K et al. Sensitive and rapid detection of Vero toxin-producing Escherichia coli using loop-mediated isothermal amplifica-tion. J Med Microbiol 2007;56(3):398–406.
13. Zhao X, Li Y, Wang L et al. Escherichia coli O157 development and applica-tion of a loop-mediated isothermal amplificaapplica-tion method on rapid de-tection Escherichia coli O157 strains from food samples. Mol Biol Rep 2010;37(5):2183–2188.
14. Mikš-Krajnik M, Lim HSY, Zheng Q, Turner M, Yuk HG. Loop-mediated isother-mal amplification (LAMP) coupled with bioluminescence for the detection of Listeria monocytogenes at low levels on food contact surfaces. Food Con-trol 2016;60:237–240.
