... t>i ... ,., ••• .,.,. ..... ...,.,
1J41
TETRACYCLINEJ. 'It.'" d.,. ~~' • schul 1:50 • ou.tI.r IKI
.,
r I•
,11
1
DE INDUSTRIELE BEREIDINGVAN TETRA. CYCLINE
Delft, november 1960
J.va.nden Berg
Mr D.Fockstraat 7
w"
INHOUD
Hoofdstuk 1. De antibiotica van de tetracycline-groep. pagina
1,1. _" 1,2 . 1,3. 1,4. 1,5. 1,6. 1,7. Historische ontwikkeling • . . . . . . . Chemische en fysische eigenschappan . . . Biosynthese . . . . • . • . . .
Werking op enzymen . . . . • . . . . .
Werking op bacteriën . • . . . .
Werking op dierlijke groei . . • . . . .
Klinische ene andere toepassingen . . . • . • 1 1 4 4 5 7 7
Hoofdstuk 2. De bereiding van tetracycline. 2 ,1. 2,2. 2,3. 2,4. Hoofdstuk 3. 3,1. 3,2. 3,3. 3,4. 3,5. 3,6. 3,7. 3,8. 3,9. 3,10. 3,11. Hoofdstuk 4. 4,1. 4,2. 4,3. 4,4. 4,5. 4,6. Hoofdstuk 5. 5,1. 5,2 . 5,3. 5,4. 5,5. 5,6. Producerende firma's . . . • .
Bereiding door hydrogenering . . . Directe bereiding door fermentatie Volledig synthetische bereiding . .
• • • 9
Tetracycline producerende microorganismen.
10 .12 18 Inle iding . . . 21 S .aureofaciens . . . 21 S . viridifa.ciens (ATCC 11989) . . 24 stam 12416-c . . . . . . . . 25 stammen ATCC 11652, 11653 en 11654 . . . . 25 S.fuscofaciens (ATCC 12061) . • . . . . . 26 Streptomyces species (ATCC 11834) • . . . . 26 S.psammoticus • . . . • . . • . . . 27 stam P 4871 . . • • • • • . • 28 S.persimilis . . . • . . . . . 28 S.sayamaensis . . . . . . . • . . . 2 g De industriële bereiding van tetracycline
(door fermentatie). Algemene inleiding . • • . • • • . . . 30 Synthetische media • • . . . 31 Complexe media na verwijdering van chloride . 35 Complexe media met toevoeging van remstoffen 37 Media. met bijzondere voedingsstoffen . . . . 42 S .psammot icus . • • • . • . • • . . • • . . . 43 De winning van tetracycline uit fermentatievloeistn.
· 46
· 47 · 49 Algemene inleiding . . . • • • • • . •
Voorbehandeling . . . • • . • . . . .
Precipitatie met tweewaardige metaalionen . Extractie met organische oplosmiddelen Precipitatie met organische basen . • . .
Andere methoden . . . . • • • . . . .
· 49 . . 50
Hoofdstuk 6. Economische aspecten van de 6,1. 6,2. 6,3 . 6,4. 6,5 . 6,6.
ant ibiot ic a- fabricage. Inleiding Speurwerk . . • • • • . Marktonderzoek . . • . Vraag en aanbod . . . . Financiële gegevens Verbruik . . . • .
Hoofdstuk 7. Processchema tetracycline-bereiding. 7 ,1. Inleiding . . • • . . . . • . . . .
7,2. Bereiding media en entmateriaal • . • . • • 7,3. Luchtvoorziening . . . •
7,4. Fermentatietanks .
7,5. Leidingen en appendages
7,6. Algemene gegevens • . . . . • . . . 7,7. Beschrijving van het proces . . • • • .
pagina 53 55 56 59 60 62 64 64 66 67 70 71 75 Literatuur
.
.
. .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
. .
. . . .
.
. .
80HOOFDSTUK 1 . DE ANTIBIOTICA VAN DE TETRACYCLlN~GROEP.
1,1. HISTORISCHE ONTWIKKELmG.
Tetracyclines zijn antibiotica met een breed spectrum van anti-microbiële activiteit, die door bepaalde soorten van het geslacht Streptomyces worden geproduceerd. Ze vormen een groep van nauw verwante verbindingen die veel gebruikt worden bij de behandeling van besmettelijke ziekten.
Het eerste antibioticum van deze groep, het aureomycine, werd in 1948 door Duggar geïsoleerd (1). In 1950 ontdekten Finley e.m.
het terramycine (2). Dat deze beide verbindingen dezelfde grond-structuur bezitten,werd in 1952 door Stephens e.m.(3) aangetoond; de grondstructuur, die eveneens antibiotische activiteit bleek te vertonen (4,5), werd tetracycline genoemd. Hiervan afgeleid we~
den de namen chloortetracycline voor aureomycine en oxytetracy-cline voor terramycine.
Later werden nog andere antibiotica van het zelfde type geïsoleerd, te weten broomtetracycline (6) in 1955 en de demethyltetracyclines
(7) in 1957.
1,2. CHEMISCHE EN FYSISCHE EIGENSCHAPPEN.
De algemene structuurformule voor de tetracyclines is:
c~~ CH~ RI 1\3 GH Rl N/
A~,
\-
O
~
~~, ~(
'
LCON>ltI
iI I OH OH 0 Oil 0Hierin stellen Rl'
Rz
en R3 radicalen voor die verschillend zijn bij de diverse tetracyclines:tetracycline • • • • • • • • • . • . • • H chloortetracycline (7-chloortetracycl.). Cl broomtetracycline (7-broomtetracycline). Br oxytetracycline (5-hydroxytetraoycline). H 6-demethyltetracycline • • • • • • . . • H 7-chloo~~demetbyltetrac;yc11ne • • • • Cl H H H OH H H
"
Tetracycline, chloortetracycline en oxytetracycline z~ oplosbaar in glycolethers, pyridine en verdund zuur en alkali; zij zijn zeer weinig oplosbaar in water en lagere alcoholen en onoplosbaar in
ether en koolwaterstoffen. Het zijn lichtgele kristallijne stoffen die redelijk bestand zijn tegen verwarming: oxytetracycline b.v. verliest slechts 20 o
%
van zijn activiteit bij verwarming gedurende 40 uur op 105 in vacuo.De tetracyclines zijn amfoteer en vormen zouten met zowel sterke zuren als basen. De met zuren gevormde zouten zijn in het algemeen mooie kristallijne verbindmngen, die matig oplosbaar zijn in water. Tetracycline en oxytetraeycline vormen ook zouten met kalium of natriumhydroxyde. Het complex met natriumhexametafosfaat is van belang vanwege de snelle absorptie in het lichaa.m uit waterige me-dia.
Alle tetracyclines vormen rode, groene of gele chelaten met vele metalen zoals ijzer (ferro en ferri), aluminium, koper, cobalt, mangaan, nikkel, zink, calciu~ en magnesium. De verhouding tetra-cycline : metaal kan zowel 1:1 als 2:1 zijn; het metaal bepaalt de stabiliteit van het gevormde complex, terwijl de aard van het
tetracycline weinig invloed heeft,
(B,S).
De stabiliteit van waterige oplossingen van de tet~acyclines is afhankelijk van de structuur van het betreffende tetracycline al&-mede van de pH van de oplossing. DS,ha.lfwaardetijden van een aan-tal tetracyclines in resp. sterk zznr en loog worden gegeven in tabel I (10). Opvallend is de grote stabiliteit van de demethyl-tetracyclines.
TABEL I
Vergelijking van stabiliteiten tegen zuur en base Halfwaardetijd (min) in: Antibioticum 1,0 N HzSO. op 1000 0,1 N NaOH op 1000 tetracycline 1,0 6,B 7-ohloortetracyoline 2,J..
<
0,3 5-hydroxytetracycline 4,5 2,2 6-demethyltetracycline 24,B 3J..,5 7-chloor-6-demethyltetracycline 445,0 40,0In sterk zure oplossing worden teerd tot de biologisch weinig
alle tetracyclines vlot gedebydra-actieve anhydroderivaten (11, ]2): U/3 eH;)
"
/ AI R.3 ~~ ~l. N)
\/
'
I
.
~(~/ T-0~
Hel)I~)y
\.
'-./LCONHl..
I
,
011 Ij o elt 0 OH CH) eH"}KI
1<'3Rl
'N/ jI
I
Ir(~
/
I
/
V
,,-
Ç'
''
/
I
I
I
"OH I bH o~ 0 0 __ 0 ftL
c
C)"/}/~
- 3
-In zwak zure oplossingen (pH 2-6) ondergaan zowel de tetracyclines als de anhydrotetracyclines een langzame, reversibele ep~meris~ie aan <:+-4 tot de overeenkomstige epitetracyclines o:f quatrimycines. De antibiotische activiteit in vitro is veel geringer dan die van de oorspronkelijke tetracyclines; in vivo is deze echter nog zeer groot. E.e.a. wordt vermeld in de literatuur (13, 14, 15, 16). Tenslotte wordt in zwak alkalische oplossing (pH'" 8) de C-ring van de tetracyclines geopend, waarbij de biologisch inactieve isotetra-cyclines ontstaan. Zoals tabel I laat zien veroorzaakt verwijdering van het chlooratoom uit chloortetracycline een merkbare vertraging van deze reactie . (ll, 12, 17), die door de vOlgende vergelijking kan worden weergegeven:
Anbydrotetracycline en anhydrochloortetracycline zijn beide zeer bestendig tegen z~ren en basen, maar anbydrooxytetracycl~e wordt
in beide gevallen snel omgezet tot een mengsel van twee
stereo-isomeren
«-
en ~-apooxytetracycline (18, 19). In zuur milieu onder-gaan deze verbindingen verdere omzettingen. De apooxytetracyclines worden als volgt gevormd:~nhydrooxytetracycline ~- en 0-apooxytetrQCYCline
Volgens Burstall (20) is het reactiemechanisme een opening van de
~r1ng, gevolgd door een directe aanval van de C5-hydroxylgroep op de C 12-carbonylgroep. Hij houdt het voor mogelijk dat dit de
reactie is volgens welke de tetracyclines in het lichaam worden a:fgebroken.
Hoewel de tetracyclines nauw verwante structuren bezitten en de~
halve in vele opzichten sterk op elkaar gelijken, zij~ een groot aantal methoden ter onderscheiding bekend. Hiertoe behoren kleu~
reacties, papierchromatogra:fie, dif:fusie in agar, counter-current distributie, ultraviolet- en in:fraroodspectra alsmede bepaling van de stabiliteit bij verschillendë temperaturen.
4
-1,3. BIOSYNTHESE.
Snell, Birch en Thomson hebben na onderzoek'ingen met behu~p van radioactieve tracers de weg aangegeven volgens welke de biosyhthese van de tetracyclines plaats vindt
(21).
Glutaminaat blijkt eenonge-ëvenaardqen vermoedelijk directe precursor te zijn van het C ~C 4a gedeelte van ring A en van de carboxylgroep aan C 2 en de aminogroep aan C 4. De rest van het naftaceen-ringsysteem wordt opgebouwd door kop-aan-staart condensatie van acetaatresten; zie onderstaande figuur. Hierbij zijn dus grotere moleculen, zoals pentosen, hexosen en ge-hydroxyleerde pOlyhydrobenzoëzuren, die in andere gevallen als pre-cursors van aromatische en hydroaromatische ringsystemen zijn ge-noemd, niet als tussenprodukten betrokken. Tot deze conclusies was Killer trouwens reeds jaren eerder gekomen
(2a).
Volgens Snell en medewerkers worden de aminomethylgroep en de methyl-groep aan C 8 naderhand ingevoerd door directe biologische methyle-ring. Genoemde onderzoekers, die hun experimenten verrichtten met oxytetracycline, laten zich echter niet uit over de wijze waarop het chlooratoom bij chloortetracycline wordt ingebouwd. Het is inderdaad nog een omStreden punt of deze chlorering plaats vindt in een vroeg stadium van de biosynthese ofwel nadat het volledige ringsysteem is gevormd.
Het laatste mechanisme sluit uiteraard beter aan op het door Snell cs beschrevene en wordt door Burstall (20) geaccepteerd. Abraham (23)
gaat echter niet zO ver en spreekt slechts van een .. laat" stadium van de biosynthese. Andere onderzoekers, m.n. Gourevitch (24), Doerschuk
('25) en Kollár (26), hebben daarentegen op experimentele gronden sterke argumenten aangevoerd Toor de eerste hypothese.
1,4. WERKlliG OP ENZY.MEN.
Vele enzymatische systemen worden door de tetracyclines geremd; in
het bijzonder de oxydatieve fosforYlering, de vetzuuroxydatie en de argtntneafbraak zijn in dit verband onderzocht. Waarschijnlijk wordt de antibacteriële werking in vivo door dergelijke effecten
Toevoeging van een grote overmaat (10:1 - 50000:1) twee~rdige me-taalionen schijnt de door tetracyclines veroorzaakte remming te onderdrukken. Kleine hoeveelheden van deze metalen verhogen echter het remmende effect of zijn in sommige gevallen' zelfs een noodza-kelijke factor hiervoor; dit is b.v. het geval met de remming van pancreaslipase door chloortetracycline , di e slechts in 8. anwezig-heid van ionen als 00-, MIl", Ca", },{g'. en Ba-optreedt, (27).
l"rA
Vermelding verdient nog, dat bepaalde enzymsystemen, die door me-talen worden geremd, gereactiveerd kunnen worden door toevoeging van tetracyclines . (Z8).
l,4. YERKmG OP BACTERIEN .
In concentraties van 1 tot 3 ~/ml oefenen de tetrs.cyclines een krachtige bs.cteriostatische werking uit op zowel Gra~positieve
als Gra~negatieve organismen; hiertoe behoren Staphylococci, streptococci, Brucella, Eschericia, Klebsiella pneumoniae etc. Pathogene Rickettsiae en de grote virussen van het psittacosis en
lymphogranuloma type ondergaan een zelfde invloed.
In veel hogere concentraties is er een bacteriedodend effect op de meeste van deze organismen. Tabel II geeft de activiteit in vitro tegen Staphylococcus aureus voor een aantal tetracyclines en hun afbraakproducten, waarbij de activiteit van tetracycline op 100 is gesteld.
Uit een aantal verbanden tussen structuur en antibacteriële acti-viteit concludeert Bursts.ll (20) dat hiervoor het C ll-carbonyl-C 12-hydroxyl-systeem intact aanwezig dient te zijn. Ook is bekend dat dit systeem geheel of gedeeltelijk verantwoordelijk is voor de chelatie van metaalionen door de tetracyclines. Het ligt dus voor de hand te verwachten dat metaal ionen een rol spelen bij de
biolo-gische activiteit van deze antibiotica.
Dit blijkt inderdaad zO te zijn, want bepaalde tweewaardige metaal-ionen, met name Fe'·, MIl·', Ca'· en Mg-, kunnen - indien in overmaat aanwezig - de bacteriostatische werking van de tetrac~lines remmen. Vele andere metalen, die chelaten vormen met deze antibiotica, heb-ben echter geen invloed. De mate van remming varieert met het mi-croorganisme en met gebruikte metaal. Anderzijds kunnen zeer lage concentraties van dezelfde metalen activiteitsverhogend werken. Op grond van deze verschijnselen komt Albert (9) tot~e conclusie dat de antibacteriële activiteit in de eerste plaats moet worden
toegeschreven aan het vermogen van de tetracyclines om chelaten te vormen met voor de stofwisseling essentiële kationen. Weinberg (29), die dit probleem grondig heeft bestudeerd, Wijst er echter op dat
bepaalde afbraakproducten van de tetracyclines, die nog wel tot chelaatvorming in staat zijn, toch slechts zeer geringe biologische activiteit vertonen.
Burstall (ZO) heeft een hypothese opgesteld die rekening houdt met beide aspecten van deze zaak: Bepaalde metaalionen, die enerzijds
in lage concentraties de antibiotische activiteit kunnen verhogen, maar anderzijds in grote overm~ at deze juist kunnen verlagen. Vol-gens deze hypothese is het metaal in kwestie van vitaal belang voor de activiteit van een bepaald enzym in het microorganisme, b.v. als onderdeel van een essentieel coenzym. Door reactie met het tetracy-cline nu ontstaat een chelaat; dit heeft een grotere affiniteit voor het enzym dan het vrije metaalion maar kan niet deelnemen aan de reacties van het enzym. Het gevolg is een inactivering van het enzym onder deze omstandigheden. Wanneer echter een overmaat van het vrije metaalion wordt toegevoegd zal het chelaat enigermate van het enzym worden verdreven en zal het enzym dienovereenkomstig worden
gereac-tiveerd.
Volgens Burstall is het waarschijnlijk dat de verschillen in bacte-riostatische werking tussen de verschillende tetracyclines het gevolg zijn van verschillen in de snelheid waarmee deze de cellen binnen-dringen; ook de affiniteiten voor de enzymen in de cel kunnen ver-schillend zijn. Molecuulgrootte en -vorm alsmede de pK-waarden van de tetracyclines zouden hierbij een rol kunnen spelen.
TABEL II
Vergelijking van de antibacteriële activiteiten
Verbinding Activiteit in vitro
tegen Staph. aureus
tetracycline 100 epitetracycline* 5,2 anhydro~tracycline actief isotetracycline 0 chloortet~cycline 400 epichloortetracycline
*
16,8 anhydrochloortetracycline actief isochloortetracycline 0 oxytetracycline g6 epioxytetracycline- 4,4 anhydrooxytetracycline actief apooxytetracycline 0 isooxytetracycline 0 6-demethyl-tetracycline 96 6-demethyl-4-epi-tetracyclinem
7-chloor-6-demethyl-tetracycline 300 7chloor-6-demethyl-4-epi-tetracycline 28-) bedoeld wordt de 4-epi-verbinding.
Opmerking: Broomtetracyc~ine vertoont volgens Sensi (6) in zijn antibacteriële activiteit grote gelijkenis met chloortetracycline; volgens Doerschuk (25) is de activiteit tegen Staph.aureus in vitro 95
%
van die van chloortetracycline.1,6. WERKlliG OP DIERLIJKE GROEI.
De groei va.n jonge mensen en dieren wordt gestimuleerd door de toevoeging van tetracyclines aan hun dieet. Dit verschijnsel
wordt algemeen toegeschreven aan de bacteriostatische werking van deze antibiotica, maar er zijn aanwijzingen dat zij ook het ren-dement verhogen waarmee het lichaam de noodzakelijke sporenelemen-ten uit het voedsel opneemt. Zo leden kuikens, die gevoed werden met een dieet van een laag mangaangehalte, minder aan vertraagde groei wanneer tegelijkertijd chloortetracycline werd toegediend
(30).
1,7. KLlliISCHE EN ANDERE TOEPASSlliGEN.
De toediening van de tetracycline-antibiotica kan peroraal, intra-veneus of intramusculair gebeuren. Tetracycline, chloortetracycline en oxytetracycline onderhouden meetbare bloedspiegels gedurende 12 tot ZO uur. Voor de demethy1tetracyclines is onder dezelfde omstan-digheden deze tijd veel langer terwijl de bloedspiegelS bovendien aanmerkelijk hoger zijn; 7-ch1oo~6-demethyltetracycline bijvoor-beeld is 2 tot 3 maal zO actief als tetracycline en na 72 uur nog
in meetbare hoeveelheden aanwezig, (31).
De giftigheid is gering en de voornaamste bezwaren van klinische toepassing van de tetracyclines zijn diarrhee, veroorzaakt door remming van de darmflora, en ontwikkeling van resistente bacterië~
stammen; dit laatste bezwaar geldt trouwens voor alle antibiotica. Gebleken is echter dat stammen, die resistent zijn tegen een anti-bioticum van de tetracycline-groep, bezwijken kunnen voor een ander lid van deze groep. Dit geldt b.v. voor 12a-deoxyanhydrotetracycline, dat actief is tegen diverse staphylococcus- en streptococcus-stammen die resistent zijn tegen tetracycline
(3Z).
Een ander belangrijk toepassingsgebied is de verduurzaming van aan bederf onderheVige voedselvoorraden, in het bijzonder gevogelte, vis en vlees. Tenslotte zijn er een aantal plantenziekten, die met behulp van o.a. tetracyclines bestreden kunnen worden; een van de preparaten op dit gebied is Agri-mycin, dat 15
%
streptomycine en 1,5%
oxytetracyc1ine bevat.HOOFIl3TUK $3. DE BEREIDmG VAN TETRACYCLmE.
S' ,1.. PRODUCERENDE FIRMA'S.
Een zeer groot deel van de wereldproduktie aan te~racycline wordt verzorgd door een viertal firma's, die de voornaamste octrooien op dit gebied in handen hebben, te weten:
1) Lederle Laboratories Division (American Cyanamid Co), Pearl River, N.Y., Ver. Staten.
2) Charles prizer
&
Co, Brooklyn, N.Y., Ver. staten.3) Br1stol Laboratories !no., Soheneotady, N.Y., Ver. Staten. 4) Lepetit S.p.a., Milaan, Italië.
Men kan zeggen dat West- en Zuid-Europa alsmede het gehele Weste-lijk Halrrond door genoemde rirma's van tetraoycline worden voor-zien; deze hebben daartoe veelal ter plaatse fabrieken opgericht. Japan produceert zelf tetracycline evenals de Sowjet-Unie en China; over deze laatste landen is nog zeer weinig bekend, maar vermoe-delijk is de produktie er nog laag maar wel sterk groeiende.
In de Verenigde staten zijn er nog twee rirma's, die zich alleen met de verkoop Van tetracycline bezig houden, namelijk E.R.Squibb and Sons Division (Olin Mathieson Chemical Corp.) en The Upjohn Co. Beiden worden door Bristol van het produkt voorzien.
De handelsnamen, waaronder tetracycline op de markt wordt gebracht, zijn: Achromycin (LederIe), Tetracyn (Pfizer), POlycycline (Bris-tOl), Steclin (Squibb), Panmycin (Upjohn) en Ambramycine (Lepetit).
Er~ zijn in principe twee methoden ter bereiding van tetracycline in gebruik, te weten:
1) hydrogenering van chloortetracycline of broomtetracycline; 2) directe bereiding door rermentatie.
Het eerste proces - d.w.z. uitgaande van chloortetracycline - wordt toegepast door Lederle en Pfizer, terwijl Bristol en Lepetit ge-bruik maken van rermentatieprocessen. Ook de twee eerstgenoemde rirma's beschikken over ootrooien op de produktie van tetraoycline door fermentatie; Lepetit heeft bovendien de hydrogenering van broomtetracycline in een octrooi vastgelegd.
2,2. BEREIDmG DOOR HYDROGENERmG.
In 1953 werden methoden tot bereiding van tetracycline door seleo-tieye katalytische hydrogenering van chloortetracycline tegelijker-tijd door onderzoekers van Lederle (Boothe e.m., 37) en Pfizer (00-nover e.m., 38) gepubliceerd.
De groep van Boothe werkte bij kamertemperatuur en atmosrerische ' druk in aanwezigheid van één Mol triethylamine en als katalysator 10
%
palladium op houtskool. In 15-20 minuten werd ruim één Mol waterstof geabsorbeerd, waarbij ca 100 rog chloortetracyèltne perml (~ methylcellosolve) werd verbruikt. Er treedt enige warmteont-wikkeling op en na absorptie van één Mol waterstof is deze practisch
argelopen (37).
Conover en medewerkers gingen op vrijwel dezelfde manier te werk; ook zij gingen uit van een oplossing van chloortetracycline (in dioxaan-methanol) en gebruikten als katalysator palladiu~oolstof
(38). In 1955 heeft Pfizer op deze werkwijze octrooi verkregen (39)~
voor de bereiding van het benodigde chloortetracycline mag prizer gebruik maken van de betreffende Lederle-octrooien. Omgekeerd heeft prizer licentie verleend aan Lederle op het hydrogeneringsproces.
In het octrooi (39) worden ook pla_t ina en Raney-nikkel als moge-lijke katalysatoren genoemd. Voorts zij~ ook andere polaire oplos-middelen dan dioxaan-methanol bruikbaar, als ze maar inert zijn voor de betrokken verbindingen; genoemd worden ethanol, isopropanol, cellosolve en tetrahydrofura~n. Een iets hogere dan atmosferische druk versnelt de reactie.
Een schema van het proces, zoals dit bij Lederle wordt uitgevoerd, is in 1957 door Forbath (40) gepubliceerd en wordt hier weergege-ven in riguur 1. Op de eigenlijke fermentatie na is het gehele proces continu; ladingsgewijze uitvoering van de rermentatie maakt scherpe controle van de optimale bedrijrsomstandigheden mogelijk. Fermentatietanks met een inhoud van ca 100 000 liter zorgen voor de bevoorrading van vier opslagtanks met dezelfde inhoud; van hier uit wordt de rest van de installatie continu gevoed.
De rermentatievloeistor wordt afgeriltreerd van de vaste stor, vOOP-namelijk uit mycelium bestaande, waaraan het antibioticum is gead-sorbeerd. Door extractie met butanol wordt het antibioticum vrij-gemaakt en aldus afgescheiden van het vaste materiaal. Dit laatste wordt bovendien nog door een wast oren gevoerd in tegenstroom met butanol. Omdat het ook hierna nog enige antibiotische activiteit bezit, wordt het gedroogd en als toevoeging aan veevoeder gebruikt. De oplossing in butanol wordt onder vacuum ingedampt, waarbij ruwe kristallen chloortetracycline worden verkregen; zuivering gebeurt door omkristallisatie uit glycolether. De katalytische hydrogene-ring vindt plaats zoals boven beschreven.
Lepetit heeft een octrooi o~ de ~roductie van tetracycline door katalytische hydrogenering van broomtetracycline (41). Het micro-b:iologische gedèelte van het proces is dan beperkt tot de productie van broomtetracycline, die eveneens door Lepetit geoctrooieerd is (42) •
Hierbij wprdt een stam van S. aureofaciens, aangeduid met RO-l441, gekweekt in een medium met de volgende samenstelling:
moutextract (Ledoga) glucose (NH4 )2 S04 C'aC'°3 NaBr MsS04,7 HzO pH na steriliseren: 6,6 percent 1,5 5,0 0,8 0,8 0,1 0,001
De fermentatie werd uitgevoerd bij 27° in schudkolven en leverde na '72 uur een opbrengst van 420 mg<l>er ~oo~tetr~cyCïfii.~
De katalytische hydrogenering van broomtetracycline tot tetracyoLine wordt volgens het Lepetit-octrooi
(41)
uitgevoerd bij 10-500 C en 1-5 atm waterstofdruk gedurende 0,3-5 uur. De katalysator is ook hier palladium of platina op houtskool. Bij voorkeur wordt gewerktin aanwezigheid van een equivalente hoeveelheid trimethyl- of tri-ethylamine teneinde HOI en HBr te binden; het rendement van de reactie kan aldus van 65 tot 80
%
worden verhoogd.2,3. DIRECTE BEREIDmG DOOR FERMENTATIE.
a. Inleiding.
De eerste publicatie over bereiding van tetracycline door fermentàtie· is van Minieri en medewerkers (43), die daarbij gebruik maakten van een streptomyces-stam geisoleerd uit een grondmonster uit Texas. Na afscheiding door middel van tegenstroomverdeling bleek de geiso-leerde stof dezelfde te zijn als het kort tevoren door Oonover en Boothe door hydrogenering bereide tetracycline (1953). Binnen e~
kele jaren hadden de drie grote concurrenten op dit gebied, Lederle (44), Pfizer (45) en Bristol (46) octrooien verkregen op de pro-ductie van tetracycline door middel van fermentatieprocessen. De meeste tetracycline-producerende stammen zijn niet specifiek, aangezien ze in aanwezigheid van chloor ook chloortetracycline
vormen. Tot nu toe is slechts één soort bekend, die dit nadeel niet
hee~t, namelijk S.psammoticus, geisoleerd en geoctrooieerd door Le-petit. In alle andere gevallen moet de verhouding tetracycline: chloortetracycline zodanig ten gunste van het eerste gewijzigd wor-den dat industriële toepassing mogelijk wordt.
Zo kan S.aureofaciens, dat algemeen gebruikt wordt voor chloorte-tracyclineproductie, onder geschikte omstandigheden bijna uitslui-tend tetracycline gaan produceren. Deze omstandighèden zijn:
1) fermentatie in synthetische media, die geen chloride bevatten; 2) verwijdering van chloride uit de gebruikelijke media, die or;':'
ganische bestanddelen bevatten;
3) toevoeging van het chlorideverbruik remmende stoffen aan de gebruikelijke media, die organische bestanddelen bevatten.
b. Invloed van chloride.
Rolland en Sensi (47, 1955) waren de eersten die er op wezen, dat de verhoudingen van de gevormde hoeveelheden tetracycline en chloor-tetracycline afhankelijk zijn van de chlorideconcentraties in het voedingsmedium. Deze onderzoekers werkten met S.aureofaciens stam R0-9ll en hun bela,ngrijkste resultaten zijn samengevat in tabel III.
TABEL III
Invloed van chloride op de vorming van tetracycline Cl' (mg/l) TC (mg/l) CTC (mg/l) TO
+
eTC (mg/l)<2
1300 70 137010 1200 250 1450
50 450 800 ]2'50
100 150 1000 1150
Hieruit blijkt ook dat de totale hoeveelheid van de beide antibio-tica practisch constant blijft.
Figuur 2 toont het verband tussen de productie en de chloridecon-cenbratie voor een beginconcentratie van 50 mg per 1. Duidelijk is te zien, dat tot 40 à 50 uur chloride nog in flinke hoeveelheden aanwezig is en dat gedurende deze tijd practisch allen chloorte-tracycline wordt geproduceerd; eerst na deze tijd begint de
pro-ductie van tetracycline.
c. Remming door analoge verbindingen.
werken door geschikte remstoffen aan de fermentatiemedia toe te
voegen; Gourevitch (24) en Sekizawa (48) hebben hier ongeveer
te-gelijkertijd op gewezen (1955).
Gourevitch en medewerkers hebben de remming door bromide bij S.
aureofaciens onderzocht. In t8.bel V zijn de resultaten samengevat
van fermentaties inaanwezigheid van toenemende hoeveelheden chlo-ride en bromide.
TABEL V
Invloed van chloride en bromide op de fermentatie van S.aureof.
~~ tetracycline
bromide
(meq p 1) chloride (meq per 1)
1,7 2,95 6,45 13,1 26,7 55,4 114,0 0 30 20 7,5 7,5 7,5 7,5 7,5 0,78 43
<
35<
35<
35 <30 <30 <20 1,56 58 45 < 35 < 30 <'35 <20 <20 3,1 65 50 53 <: 45 43 <: 35 < 20 6,1 73 65 53 50 48 43<ro
12,15 80 68 63 50 48 43 38 24,3 85 80 65 65 50 50 4:5 48,7 91 90 68 65 50 48 45Hieruit blijkt dat het microorganisme in aanwezigheid van kleine
hoeveelheden chloride en zonder toeyoeging van bromide 30
%
te-tracycline en 70
%
chloortetracycline produceert. Bij vergrotingvan de hoeveelheid chloride daalt het percentage tetracycline,
maar niet verder dan tot 7,5
%,
een waarde die verder constantblijft. Toevoeging van bromide doet het percentage tetracycline
stijgen en wel tot een hogere waarde naarmate minder chloride
aanwezig is.
De auteurs hebben hebben de resultaten geinterpoleerd en aldus
het percentage tetracycline berekend als een functie van de
bro-mideconcentratie voor constante verhoudingen bromide : chloride.
Deze gegevens vindt men in tabel VI.
TABEL VI
Percentage tetracycline als functie van bromideconcentratie voor constante verhoudingen bromide : chloride
bromide
.
.
chloride bromide (meq p 1) 0,5 1 2 4 8 16 48,7 46 51 56 62 71 83 24,3 50 51,5 61 69 78 89 12,15 48 53 59,5 69,5 81 --6,1 51 55,5 64 76--
--3,1 51 58 65--
--
ming evenredig te zijn met deze verhouding en niet met de absolu-te concentraties van het bromide en het chloride. Dit beabsolu-tekent dat men hier van een concurrerende remming mag spreken. De afwij-kingen van dit gedrag bij hogere waarden van de verhouding bromide : chloride worden verklaard door aan te nemen dat het bromide dan
niet meer a~n als remstof optreedt, maar ook zelf in het
mole-cuul wordt ingebouwd. Inderdaad hebben dergelijke onderzoekingen
door Sensi en medewerkers (6) in 1955 tot de ontdekking van het
nieuwe antibioticum broomtetracycline geleid.
Voorts is gevonden dat de invloed van bromide op het
chloridever-bruik van stam tot stam kan varieren. Doerschuk en medewerkers
(25, 49) onderzochten drie mutanten van de
S.aureofaciens-moeder-stam A-377. Eén hiervan wordt slechts weinig door bromide geremd
en de chloortetracycline-productie is onafhankelijk van de
chlo-rideconcentratie over een traject van 0,02 - 10,0
stoichiometri-sche equivalenten van de totale tetracycline-potentiaal, d.d. de
som van de hoeveelheden tetracycline, chloortetracycline en broo~
tetracycline aan het eind van de fermentatie. De beide andere stammen ondervinden een sterke invloed van de aanwezigheid van
bromide, terwijl de chloortetracycline-product.ie afhankelijk is
van de chloride-concentratie. Binnen bepaalde grenzen zijn deze remmingen concurrerend en omkeerbaar.
De biosynthese van chloortetracline wordt in alle drie gevallen
geremd door rhodanide. Zowel dit als bromide veroorzaakt steeds een vermeerdering van de hoeveelheid tetracycline en wel ten koste van de hoeveelheid chloortetracycline; de totale
tetracycline-potentiaal blijft steeds gelijk. Rhodanide wordt in tegenstelling
tot bromide niet in het tetracycline-molecuul ingebouwd (25).
·TABEL VI
•
Invloed van analoge verbindingen op de synthese van CTC
concentratie
J'
tetracycline in geq per 1 KBr NaF KJ 0,04 75--
48 0,00 67 60 39 0,01 58 42 35 0,005 45 33 33 0,0005 32 30 31°
25 25 25*) steeds in aanwezigheid van 2 meq NaCl.
Andere analogen van chloride, met name fluoride en jodide, kunnen de chlorering eveneens remmen zoals aangetoond is door Kollár en
Járai (26) bij S.aureofaciens. Uit hun resultaten - weergegeven in
tabel VI - blijkt dat de remmende werking afneemt in de VOlgorde bromide, fluoride, jodide. Remming van de
chloortetracycline-pro-ductie heeft ook Sekizawa (50) geconstateerd (bij S.sayamaensis),
maar ten gunste van tetracycline slechts met bromide en niet met
fluoride en jodide. Szumski (36) rapporteert zelfs vermindering
van het percentage tetracycline met ca 50 ~ door fluoride bij S.
d. ~emming door organische zwavelverbindingen.
Een andere methode tot remming van de chlorering werd in 1955 door Sekizawa (48) ontdekt. Hij vond dat bepaalde organische
zwavel-verbindingen eveneens de eigenschap bezitten de synthese te ver-leggen van chloortetracycline naar tetracycline. De meest actieve verbinding in dit opzicht bleek 2-mercaptobenzothiazool te zijn. Dit werd in 1959 bevestigd door Goodman en medewerkers (51), die de remmende werking van een groot aantal verbindingen onderzochten. Drie van de sterkste remstoffen bleken te zijn
2,5-dimercapto-1,3,4-thiadiazool, 2-phenyl-5-mercapto-l,3,4-oxadiazool en
i-2-(2-furyl)-5-mercapto-oxadiazool, die in hoeveelheden van resp.
50, 5 en 10 ppm en in aanwezigheid van 0,+5
%
ammoniumchlorideaanleiding gaven tot een productie van 96-98
%
tetracycline. Zo~der remstof werd 5-10
%
tetracycline geproduceerd. Het doorSeki-zawa ontdekte 2-mercaptobenzothiazool doet hetzelfde, maar 1s aan-zienlijk giftiger voor het microorganisme (S.aureofaciens, stam BC-41). Hiermee wordt bedoeld dat de hoogste percentages tetracy-cline verkregen worden met hoeveelheden die de totale tetracytetracy-cline- tetracycline-potentiaal doen dalen.
Een soortgelijk onderzoek werd verricht door Lein en medewerkers
(52), die er in slaagden een verband te ~eggen tussen de remmende
werking en de structuur (1959). De actieve verbindingen, d.w.z.
meer dan 80
%
tetrs.cycline in aanwezigheid van 0,4%
natriumchl~ride, hebben de groepering (I) of de tautomeer (II) gemeen:
H
:---N"
I "0=8I
/
'---X
r---N~ :~C-SH
:
/
L---X
I IIDeze groeperingen komen dan voor in een cyclisch systeem, waarin
X een
N-,
0-, of S-atoom kan voorstellen. Voor destructuurfor-mules van de genoemde verbindingen wordt verwezen naar pag. 17.
Van de door Lein onderzochte verbindingen gaven meer dan 90
%
ts-tracycline: 2-benzoxazolethiol, 2,5-dimercapt~1,3,4-thiadiazool
en 2-mercaptobenzimidazool.
Cupri-ionen schijnen een essentiële ro~e vervullen bij de
bioche-mische chlorering. Dit werd reeds door Sekizawa (50, 1956)
opge-merkt en later door Goodman (51, 1959) en Kollár (26, 1960) beves-tigd. Zo kan b.v. de remmende werktng van 2-mercaptobenzothiazool op de chloortetracycline-synthese gedeeltelijk worden opgeheven door toevoeging van cupri-ionen. Volgens Kollár hebben bovendien
een aantal verbindingen, die bekend staan als reagentia op koper, invloed, b.v. thioglycolzuur, natriumcyanide en cupferron. Men denkt aan een koperhoudend enzym, maar het bewijs is nog niet ge-leverd.
structwurformules van een aantal actieve remstoffen behorende tot de groep der organische zwavelverbindingen. De formules zijn
zO geschreven, dat hun onderlinge overeenkomst duidelijk tot uiting komt.
/\r-I /\r-ILN)-SH
~/ ~
-N--N~n
I1~-SH
I( /-
-
-0/
o
I---N~ I~-SH
~---X/
a-mercaptobenzothiazool (Sekizawa, 48) 2-mercaptobenzoxazool (Lein, 52) 2-mercaptobenzimidazool (Lein, 52) 2- (Z-furyl)-5-mercapto-l,3 ,4-oxadiazool (Goodman, 51) 2-phenyl-5-mercapto-1,3,4-oxadiazoo1 (Goodman, 51) Z,5-dimercapto-l,3,4-thiadiazool (Goodman, 51; Lem, 52)2,4. VOLLEDIG SYNTHETISCHE BEREIDmG.
Gezien de lucratieve vooruitzichten, die een volledig chemische synthese zou bieden, is het niet te verwonderen dat dit probleem
in vele landen wordt onderzocht. Voor zover bekend houden Ameri-kaanse, Engelse, Duitse, Japanse, Russische en Chinese onderzoe-kers zich er mee bezig,
De moeilijkheden, die aan deze synthese verbonden zijn, zijn echter zeer aanzienlijk, in hoofdzaak door de vOlgende oorzaken:
1) Het voor alle tetracyclines karakteristieke ~tetracarbony~
systeem is zeer instabiel tegen loog;
2) reeds in betrekkelijk verdund zuur gaan de tetracyclines over in hun anhydroderivaten;
3) de stereochemische problemen zijn groot als gevolg van de talrijke substituenten en ringverbindingen, waardoor het minimum aantal asymmetrische koolstofatomen vijf is,
Met behulp van r5ntgendiffractie is de stereoformnle van
chloor-tetracycline vastgesteld (I), waarbij al~n over de orientatie
van de dimethylaminogroep nog geen zekerheid bestaat.
Essentieel voor volledige biologische activiteit is nu de
aanwe-zigheid van de dimethylaminogroep aan C 4 en het v~terstofatoom
aan C 5a, beide in de juiste - natuurlijke - configuratie. De ver-binding 6-deoxy-6-demethyl-7-chloortetracycline bijvoorbeeld bezit dezelfde krachtige antibacteriële activiteit als chloortetracycline
maar heeft een asymmetrisch. koolstofatoom minder, hetgeen de sy~
these vergemakkelijkt.
De meest succesvolle benaderingswijze is tot nu toe die, waarbij men uitgaat van een geschikt gesubstitueerd benzeenderivaat, dat
de uiteindelijke D-ring van het tetracyclinemolecuul omvat, waaraan
dan achtereenvolgens de C-, B- en A-ringen worden gekoppèld.
Deze weg wordt bewandeld door Muxfeldt bij diens synthese van enige verbindingen, die tetracyclinestructuur bezitten. Hij beperkte zich vQorlopig tot de opbouw van anbydro- en 6-deoxy-tetracyclines,
daarmee bewust de factoren, die de instabiliteit tegen zuur bepalen, buiten beschouwing latend,
Aldus te werk gaand, slaagde Muxfeldt (53) in 1959 in de synthese van (t)-dedimethylamino-12a-deoxy-anhydro-7-chloortetraoycline (11). Ter vergelijking diene de formule van anhydro-7-chloortetracycaine
(III).
II III
In 1960 heeft Muxf'eldt de synthese van de tetracyclische verbinding (IV) gepublioeerd (54), een verbinding waarin dus het p-tetraca~
bonylsysteem aanwezig is, maar waaraan een aantal substituenten nog ontbreken, o.a. de biologisch noodzakelijke dimethylaminO-groep aan C 4.
Volgens een reoente publicatie van dezelfde onderzoeker (55) is nu ook de vOlledige synthese van dedimethylamino-anhydro-chloor-tetraoycline (V) gelukt. Belangrijk is hier de invoering va.n de hydroxylgroep aan C 12a.
IV cl ~H)
i
I
.~.
/
V"1À-of(
\~
jl
hI
L~à
l
coN1i
~~"'~~ .,
r i l '
OH 11 0lf OH 0 0 VOngeveer dezelfde methodes worden gevolgd door onderzoekers van de American Cyanamid Co bij de bereiding van tetracycline-achtige verbindingen. Boothe en medewerkers (56, 1959) synthetiseerden
(t)-deddmethylamino-lZa-deoxy-6-demethyl-anhydro-7-chloor-tetra-cycline (VI). Deze verbinding wijkt slechts op de 6-plaats af van de door MuXfeldt (53) bereide, maar vertoont in tegenstelling tot deze biologische activiteit.
cl cl
)"'1
A./V""'
./
OffI
~/",/
I
~
I
,,,-/I
,,
fJ-C'N
!f<
I f IIr
OH o/-( oH 0I
tjH
/
",
/
~
/
~/OI1
r I JI
I IJ ~/'~'V."",,/" cONHl.(
I1
In
()~ 0 011 0 VI VIIDezelf'de onderzoekers - onder leiding van Fields - slaagden in 1960 in de stereospecifieke synthese van
(t)-dedimethylamino--6-demethyl-6,JZa-dideoxy-7-chloortetracycline (VII, 57).
Methoden tot stereospecifieke invoering van de J2a-hydroxylgroep zijn beschreven door Rolrnlund (58) en Muxfeldt (59), n.l. door oxydatie met resp. natriumnitriet en perbenzoezuur. Nu is de
hydroxylgroep aan C 6, zoals reeds eerder vermeld, niet essentieel voor de antibiotische werking, zod~l.t slechts invoering van de
dimethylamino-groep hiervoor nog noodzakelijk is (57). Russische onderzoekers hebbeh een methode hiertoe aangegeven (Shemyakin, 60).
HOOFDSTUK 3. TETRACYCLmE PRODUCERENDE MICROORGANISMEN •
3,1. mLEmmG.
Tetracycline wordt uitsluitend geproduceerd door microorganismen van het geslacht streptomyces·. Alle uit de natuur geisoleerde
stammen produceren onder normale omstandigheden, d.w.z. in aanw&-zigheid van cijloride, bij voorkeur chloortetracycline. Slechts
enkele kunnen, zelfs in aanwezigheid van overmaat chloride, ook
.. at tetracycline produceren. Omgekeerd is tot nu toe geen natuul'-lijke Streptomyces-stam geisoleerd, die uitsluitend tetracycline
en geen chloortetracycline produceert,
(6Z).
Kunstmatig - voornamelijk door bestraling - zijn een aantal
mutan-ten verkregen, waarvan het chlorerend vermogen aanzienlijk
is
ve~minderde Slechts één hiervan, S.psammoticus, schijnt dit vermogen geheel te hebben verloren en produceert derhalve alleen
tetracy-cline (63). Alla 8.ndare mutanten vereisen de bijzondere
omstan-digheden genoemd op blz. 13 om de chloortetracyclineproductie zO
veel mogelijk te onderdrukken.
Vele van de geisOleerde mutanten worden beschouwd als a~zonderlijke
soorten, vooral in de octrooiliteratuur. Dit wordt sterk in
twij-fel getrokken door Petty (S2),die enkele - S.viridifaciens, S.fus-cOfaciens, S.sayamaensis - identiek verklaart met S.aureofaciens en die ook ten opzichte van de andere zeer kritisch gestemd is. De moeilijkheid is, dat vele van dergelijke industrieel belangrijke
stammen niet,ter vergelijking met andene, beschikbaar zijn; voorts
zijn de beschrijvingen in octrooien vaak gebrekkig.
De tetracycline producerende stammen zullen hierna afzonderlijk aan een beschouwing worden onderworpen, terwijl een overzicht
gegeven wordt in tabel VII op blz. 22.
3,2. S. AUREOFACIENS.
De oorspronkelijke stam van S.aureofaciens werd in 1948 door Duggar
van de Amerioan Cyanamid Co geisoleerd uit een grondmonster uit
Missouri; dit is stam A-377
(1).
Een overenting hiervan isopge-nomen in de verzameling van het Northern Regional Research Labora-tory onder nummer NRRL 2209. Enkele eigenschappen van dit micro-organisme worden vermeld in tabel VIII.
TABEL VII
Overzicht van tetracycline producerende stammenl
-
-stam met nummer Octrooihouder Jaar van Literatuur
verlening
S.aureofaciens Lederle 1949 1, 24,25,
(vele mutanten en vari- 26, 42, 47,
anten; moeders tam nrs Pfizer 49, 51, 64,
A-377 en NRRL 2209) Bristol 67, 84, 86,
88, 89-93, 94-95.
S.viridif'aciens Bristol 1955 68, 84, 86,
(AT6C 11989) 89-93.
stam ATCC 12416-c Lederle 1956 69,81
stammen ATCC 11662/3/4 Pfizer 1956 70
S.fuscofaciens Pfizer 1955 71, 'i2
(ATCC 12061)
Streptomyces species ' 01in Ma thiesoIl 195
EP
73 (ATCC 11834)S .psammoticus Lepetit 1967 63, 74
oude naam: S.feofa~iens
(8 4623/33)
stam P 4871 Lepetit 1958 75
S .pers imilis Lepetit 1958 76
(RO-9JZ, PV-11640)
S .sayamaensis Lederle 1959 50
,
77, 78,79, 80.
1) voor zover beschreven in de literatuur (incl. octrooien) 2) octrooi later prijsgegeven
De voor de groei van S.aureofaciens noodzakelijke voedingsstoffen kunnen afwijken van die, welke nodig zijn voor de biosynthese van
antibiotica. Bovendien bestaan ~t dit betreft verschillen tussen
de talloze muta~ten en natuurlijke varianten, die in de loop der
jaren zijn geisoleerd.
Gluoose, saccharose en zetmeel zijn de meest toegepaste koolstof-bronnen voor S.aureofaciens; ook maltose, dextrinen, glycerol en mannitol ziJn bruikbaar. Goede stikstofbronnen zijn diverse amino-zuren, gehydrOlyseerd oaseine, sojameel, katoenmeel, grondnoten-meel, vleesextract en corn steep liquor (mais-v1eekwater); vooral
dit laatste blijkt van groot belang te zijn en .wordt dan ook alg~
meen aan fermentatiemedia toegevoegd. Ureum, ammoniumzouten, ni-triet en nitraat kunnen ook door S.aureofaoiens worden verbruikt. Er bestaat eohter een grote versoheidenheid in de mate waarin
koolstof- en stikstofbronnen door de diverse mutanten en varianten
worden verbruikt
(64).
Toevoeging aan het medium van minerale z out, en , zoals :fos:faat en
zouten van natrium, kalium en magnesium alsmede sporenelementen als cObalt, koper, zink, mangaan en ijzer is noodzakelijk. Voorts
dienen calciu~ en magnesiu~1onen Om andere redenen aan het
me-dium te worden toegevoegd; Niedercorn (65) heeft het eerst op het
belang hiervan gewezen. Het hierna VOlgende geldt niet alleen voor S.aureofaciens, maar voor alle andere stammen eveneens.
Tengevolge van de afbraak van koolstofbronnen en het verbruik van de gedurende de eerste uren gevormde ammoniak treedt tijdens de
:fermentatie een sterke p~daling op. Bovengenoemde tweewaardige
kationen oefenen hiertegen een bufferende werking uit. Daarnaast zorgen zij voor verwijdering van een groot deel van het gevormde antibioticum uit de vloeistof door ohelaatvorming en precipitatie. Dit is van groot belang aangezien ohloortetraoyoline in
oonoen-traties, hoger dan 100 mg per liter, een sterk remmende werking
op het mioroorganisme uitoefent
(66);
hetzelfde geldt ongetWijfeldToor tetracyoline.
Caloium wordt practisch altijd als carbonaat toegevoegd. Het vo~
deel hiervan is dat het slecht oplosbaar is bij normale pH van het medium en aldus een alkalische reserve vormt, die eerst in actie komt als de pH sterk daalt. Magnesium kan als fosfaat of als sulfaat worden toegevoegd.
Aanvankelijk werd S,aureofaciens alleen gebruikt voor de "productie
van chloortetracycline, waarop Lederle in 19~9 als eerste octrooi
verkreeg (67). Later bleken muta~ten onder de reeds genoemde bi~
zondere omstandigheden ook tot productie van tetracyoline in staat
te zijn; vermoedelijk wordt S.aureofaciens nog steeds het meest
3,3. S. VIRIDIFACIENS (ÄTCC 11989).
Dit microorganisme is geoctrooieerd door Bristol voor de productie van tetracycline. Dit vereist echter bijzondere omstandigheden, omdat anders in hoofdzaak chloortetracycline wordt geproduceerd. Het eerste octrooi dateert van 1955 (68), waarin S.viridifaciens vergeleken wordt met S.aureofaciens: tabel VIII.
TABEL VIII
Vergelijking van S. viridifa.ciens met S • aureotaciens
Glycerol-asparag-vleesextract agar Czapeck-Dox agar
(:1%
dextrine) Voedingsagar Asparagtne-moutex-glucose agar Aardappelbuizen Lakmoes melk S.Yiridifaciens S.aureofaciens (ATCC 11989) (NRRL 2209)goede groei; sporen; gOede groei; sporen;
geelgroen diff'.pigmentj geen diff.pigment;
luchtmycelium. luchtmycelium.
redelijke tot g~ede
sr;
redelijke groei;veel sporen; geen diff. weinig sporen; geen
pigment; luchtmyc. diff.pigment; luchtmyc.
goede groei; geén·.
luchtmyc.; kaneelkleur. diff.pigment.
goede groei; vorming van luchtmyc. en sporen enigszins geremd; stro-kleurig diff.pigment.
Goede groei; overvloe- Goede groei; overvloedig
dig luchtmyc.
&
sporen; luchtmycelium&
sporen;zeemkleurig diff.pigm. zeemkleurig diff.pigm. Verhoogde groei;
knob-belig oppervlak; zee~
kleurig diff.pigment. Geen noemenswaardige pH-verandertng of
pep-tonisatie in 15 dagen;
slechte groei.
verhoogde grQei; knob-belig oppervlak; beige d ift • pigment.
pH-stijging met pepto-nisatie; zeer gOede
groei.
S.viridifaciens is vooral gekanmerkt door de afscheiding van een intens blauwgrQene kleurstof, wanneer gekweekt op een medium
be-staande uit 1
%
saccharose, 1%
sojameel., 1%
sojapepton, 1,5%
~PO~ en 0,5
%
(NH4)tHPO~. Dit doet S.aureofaciens niet.Groei en tetracycltneproductie vinden plaats met de gebruikelijke
koolstofbronnen, zoals glucose, zetmeel, sacc~rose, maltose en
lactose. Goede stikstofbronnen zijn pepton, vleesextract, gistex-tract, corn steep liquor, sojameel e.d. Het best zijn ongezuiverde stoffen, die sporen groeifactoren en mineralen bevatten; anders moeten zeker deze laatste worden toegevoegd.
o 0
Het optimum temperatuurgebied is 25-30 voor groei en 26-28 voor productie va.n tetracycline.
3,4. STAM ATCC :l2416-c.
Lederle heeft uit een grondmonster uit Texas stammen geisoleerd die bleken te behoren tot de species S.aureofaciens. Door bestr~
ling met ultravilolet licht werd hieruit de stam UV-8 verkregen, die eBn zeer hoge productie geeft; hij is later opgenomen bij de
ATCC
onder nummer 12416-c.Deze stam wijkt op verscheidene punten af van S.aureofaciens. Op
Waksman-agar treedt overvloedig vegetatief mycelium op; dit is aanvankelijk wit, later geel en wordt geleidelijk bedekt met een poederachtig wit luchtmycelium, dat vervolgens sporuleert. Oude
cultures worden zwart.
Als koolstofbron kan saccharose of zet,meel gebruikt worden; ook organische zuren, b.v. azijnzuur of citroenzuur, komen hiervoor in aanmerking, waarvan gebruik gemaakt wordt bij de samenstelling van synthetische media (69). Goede stikstofbronnen zijn de gebrui-kelijke organische stoffen die eiwit bevatten alsmede ammonium-zouten. Eveneens zijn noodzakelijk anorganische zouten zoals fos-faten en sulfos-faten, die als kalium- resp. magnesiumzout kunnen worden toegevoegd. Beslist noodzakelijke sporenelementen zijn
zink, mangaan, koper, ijzer en chroom, die dus aan synthetische media dienen te worden toegevoegd •
Als bufferendestoffen komen naast calciumcarbonaat ook organische zouten in aanmerking, b.v. acetaten, citraten en lactaten en wel speciaal in synthetische en half-synthetische media. Het optimum temperatuurgebied voor de productie van tetracycline is 30-330
(64, 69).
Complexe media moeten op één van de bekende manieren worden behan-deld om productie van chloortetracycline~ te voorkomen. In het Lederle-octrooi (69) wordt vermeld dat 1 ppm chloride aanleiding geeft tot een chloortetracycline-productie van 14 mg/l.
3,5. STAMMEN ATCC 11652, 11653 EN 11654.
Deze drie sta.mmen, die geisoleerd zijn door Pfizer, bezitten zeer verschillende eigenschappen; hierop wordt uitgebreid ingegaan in twee octrooien van Pfizer (70, 87).
Bovengenoemde stammen kunnen gekweekt worden op media_ bestaa.nde uit de VOlgende bestanddelen: een koolhydraatbron zoals glucose, zetmeel of melasse ofwel glycerol; een organische stikstofbron b.v. sojameel. aardnootmeel, caseinehydrolysaat, cornsteep liquor, distillers solubles of gistextract. Voorts mineralen en sporenele-menten, waarvan de laatste in voldoende mate in leidingwater voor-komen. Tenslotte zotals altijd calciumcarbonaat als bufferende stof. De optimum temperatuur voor groei is 25-30° en voor produc-tie 28° .
~,6. S. FUSCOFACIENS (ATCC 12061).
In twee octrooien verleend aan P~izer (71, 72) wordt dit micro-organisme als een nieuwe species van Streptomyces bestempeld. In cultures van S.fuscofadiens wordt niet alleen tetracycline, maar ook een verbinding bekend 8.1s antibioticum PA-121 of quinocycline geproduceerd. De hoeveelheden van beide antibiotica varieren van stam tot stam.
Als koolstofbronnen voor de productie kunnen melasse, glucose, zetmeel en glycerol gebruikt worden; als stikstofbronnen sojameel, t arweglut en, grondnotenmeel, caseinehydrolysaat enz. Hogere op-brengsten verkrijgt men door toevoeging van stoffen die de groei van het microorganisme stimuleren. Hiertoe behoren cornsteep liquor, distilIers sOlubles, gistextract en katoenzaadmeel, terwijl Om
dezelfde redenen het gebruik van leidingwater- wordt aanbevolen. Zouten als natriumchloride, natriumnitraat, kaliumfosfaat en
magneSiumsulfaat kunnen eveneens een gunstig effect hebben evenals calciamcarbonaat. De optimum temperatuur voor de fermentatie is ca 28 C.
In het octrooi (72) wordt nog vermeld dat de chloride-concentratie van het medium zo laag mogelijk moet worden gehOuden om veront-reiniging van het tetracycline met andere antibiotica met een breed spectrum te voorkomen. Hiermee wordt kennelijk chloorteDPa-cycline bedoeld; quinochloorteDPa-cycline bevat geen chloor (62).
3,7. STREPTOMYCES SPEC:rES {ATCC 11834).
Dit is een mutant van een uit een grondmonster uit New Jersey ge-isoleerde streptomyceet. Op de productie van tBtracycline met be-hulp van deze stam is door Olin Mathieson in 1958 octrooi verkre-gen, dat echter later is prijsgegeven, (73). De stam is gedepo-neerd bij de ATCC onder nummer 11834.
Koolstofbronnen, die zowel voor groei als productie zijn te ge-bruiken, zijn glucose, maltose, saccharose, zetmeel en dextrine alsmede glycerol. Voor de productie van tetracycline z~ bovendien vetten, b.v. reuzelolie, sojaolie, lijnzaadolie, en vetzuren, b.v. stearinezuur, palmitinezuur en oliezuur, geschikt.
Goede bronnen voor stikstof en groeifactoren zijn caseinehydroly-saat, tarwe glut en , sojameel, gistextract en distilIers solubles. Verder zijn nog noodzakelijk fosfaten en calciumcarbonaat alsmede
sporenelementen zoals kalium, calcium, magnesium en ijzer. De
0p-timum temperatuur is ca 250, maar temperaturen van 20-350 C zijn
mogelijk (73). Om coproduct ie van chloortetracycline zoveel moge-lijk te voorkomen moet een chloorarm medium worden gebruikt, in het bijzonder een sojameel-preparaat, dat slechts de natuurlijke hoeveelheid chloride bevat, d.w.z. minder dan 0,03
%.
3,8. S. PSAMMOTICUS.
Lepetit heeft in 1957 octrooi verkregen op de product~e van
tetra-oyoline met behulp van deze stam. Naar analogie van een reeds in
1952 door Japanse onderzoekers geisoleerde stam wordt in het
be-treffende octrooi (74) nog gesproken van S.feofaciens. Volgens een latere publicatie van Virgilio en HengelIer (63) zijn beide stammen echter niet identiek. Zij menen dat de door Lepetit geoc-trooieerde stam als een afzonderlijke species moet worden beschouwd, o.a. op grond van het feit dat hij weinig proteolytisch is en uit-sluitend tetracyoline produoeert, zelfs in aanwezigheid van
aan-)t
zienlijke hoeveelheden chloride resp. bromide •
Het is duidelijk dat dit laatste kenmerk van zeer groot belang is
aangezien dit tot nu toe nog bij geen ander microorganisme is waar-genomen. Als gevolg van het bovenstaande is de naam veranderd in
S.psammoticus op grond Van het zanderige uiterlijk van het goed
gesporuleerde luchtlD7celium (Cir. psammos = zand) (63).
Het microorganisme vormt overvloedig bruingeel tot bruin
vegeta-tief myoelium op een eiwit bevattend medium, maar op media die
koolhydraten en minerale zouten bevatten is de groei slecht en ontstaan doorschijnende, zeer lichtbruine kolonies. Luchtmyoelium is weinig of niet aanwezig, terwijl sporulering moeilijk te
bewer-ken
is;
indien aanwezig zijn de sporen lichtbruin tot donkerge-kleurd. Pigmentvorming treedt meestal slechts op op media, waarop ook sporulering plaats heeft en dan is de kleur bruin met een neiging tot groen bij veroudering van de cultuur (74).
Voor de productie van tetracycline zijn sacoharose en glucose de beste koolhydraten; minder goed zijn maltose, dextrine en zetmeel. De meest geschikte stikstofbronnen zijn moutextract en cornsteep
liquor en verder caseinebydrolysaat, grondnotenmeel, sojameel en katoenmeel. Wat de mineralen betreft, noodzakelijk zijn fosfaten van oaloium en ammonium, oalciumcarbonaat (als buffer) en dan in afnemende volgorde van belangrijkheid: magnesium, sporen cobalt,
zink, kpper en sulfaat. De optimum pH-waarde aan het begin van de
fermentatie is 6,6 (74).
Bovengenoemde gegevens gelden voor de oorspronkelijke stam, geiso-leerd uit een grondmonster uit de omgeving van Rome. Deze is op-genomen in de verzameling van het Instituut voor Genetica van de Universiteit van Pavia onder nummer S 4623/33 •
. )t) In het kader van mijn afstudeerwerk is dit door mij
onder-zocht en onjuist bevonden. Drie stammen van de "species" S.ps
am-moticus produceren 0,07-0,10
%
chloortetracycline, onafhankelijkvan de hoeveelheid chloride in het medium. Tenminste één van de
drie stammen produceert in aanwezigheid van bromide ook
3,9. STAM P 4871.
stamP 4871 is geisoleerd uit een grondmonster uit de omgeving van Pavia en eveneens door Lepetit geoctrooieerd voor de
produc-tie van tetracycline (75).
Het vegetatieve mycelium is aanvankelijk kleurloos en wordt later geel tot oranje. Voor zover aanwezig, is het luchtmycelium wit en later grijs (in sommige gevallen bruin), terwijl eventueel ge-vormde sporen donkergrijs zijn gekleurd. Een geel pigment wordt vooral afgescheiden in media, die rijk zijn aan koolhydraten en
arm aan eiwitten.
Normale huishoudsuiker, glucose en dextrinen z~Jn als koolstofbron-nen voor de productie het meest geschikt; daarnaast geeft ruwe
saccharose uit melasse een redelijke productie. De beste stikstof-bron is moutextract (vooral uit gerst) terwijl ook sojameel, com steep liquor en gistextract bruikbaar zijn. Calciumcarbonaat is noodzakelijk als calciumbrort en als bufferende stof. Sulfaat wordt bij voorkeur als ammoniumzout toegevoegd omdat ammoniakale
stik-stof de tetracycline-productie verhoogt. Andere minerale zouten,
zoals magnesiumsulfaat, mangaansulfaat en zinksu6~aat zijn even-eens gunstig. De optimum temperaturen zijn 27-28 voor groei en
m
0 voor productd,;e.Indien gezorgd. wordt voor de afwezigheid van chloride in het med.ium produceert de stam P 4871 volkomen zuiver tetracycline (75).
3, 10. S. PERS IMILIS .
Door onderzoekers van Lepetit is deze stam geisoleerd en aangeduid als stam RO-9J2. Na octrooiering in 1958 (76) is de stam gedepo-neerd op het Instituut voor Genetica van de Universiteit van Pavia onder nummer PV-11640 en de naam S.persimilis.
Vegetatief mycelium wordt rijkelijk gevormd, afhankelijk van het medium in verschillende gele tinten. Ook wordt meestal veel
lucht-mycelium gevormd, althans op eiwitrijke media; de kleur is wit
ól"
soms grijsachtig. Sporulering vindt slechts onder zeer bepaalde omstandigheden plaats, n.l. in media die voldoende plantaardige eiwitten bevatten; de sporen zijn grijs gekleurd. Er wordt een geel tot geelbruin pigment gevormd.
De beste koolstofbronnen voor de productie van tetracycline zijn glucose en dextrinen, vervolgens gewone huishoudsuiker, terwijl een veel minder goede produotie verkregen wordt met zetmeel,
ga-lactose en andere mono- 'en disa.cchariden. Wat de mineralen betreft geldt hetzelfde als voor stam P 4871 (zie boven).
Als enige bron voor organische stikstof wordt door Lepetit mout-extract Ledoga 2436 gebruikt. Merkwaardig is dat geen of weinig tetracycline wordt geproduceerd bij toepassing van andere stik-stofbronnen, zoals sojameel, cornsteep liquor, gistextract, mout-extract, caseine-hydrolysaat enz. Hetzelfde is het geva.l met mengsels van Ledoga en één of meer van bovengenoemde stikstof-bronnen. De optimum temperatuur is 2So voor groei en 28-320 voor
productie.
In het octrooi (76) worden geen bijzondere maatregelen ten aanzien V8:n de chloride-concentratie van het medium vermeld; desondanks schijnt in aanwezigheid van moutextract Ledoga tetracycline "met grote selectiviteit" te worden gevormd.
3,11. S. SAYAMAENS IS •
In Japan wordt voor de productie van tetracycline - en ook chloor-tetracycline - gebruik gemaakt van S,sayamaensis. Deze species wordt in 1956 voor het eerst in de literatuur genoemd en wel door Sekizawa (50). Deze publicatie geeft geen beschrijving van de
cultuur, maar deze is later in een Japans octrooi verschenen (77). Ook Waksman (7S) vermeldt een aantal eigenschappen van S.sayamaen-sis en volgens hem bestaat er een nauwe verwantschap met S.aureo-faciens. Petty (62) gaat nog verder door beide microorganismen als identiek te beschouwen, dit op grond van een aantal gemeen-schappelijke eigenschappen, waaronder gevoeligheid voor de speci-fieke S.aureofaciens actinofaag.
De koolstof- en stikstofbronnen voor S.sayamaensis wijken ~let af van de gebruikelijke. In een Amerikaans octrooi (7g) worden ge-noemd zetmeel, saccharose, glucose en melasse resp. sojameel, a ardnoot me el , gistextract, vleesextract, peptonm ammoniumsulfaat, ureum, cornsteep liquor, distilIers solubles en vismeel. Als an-organische zouten zijn o.a. noodzakelijk calciumcarbonaat, ammo-niumsulfaat, ammoniumchloride, mononatriumfosfaat alsmede diverse sporenelemen~en zoals mangaan, cObalt, zink, koper en ijzer.
S.sayamaensis produceert voornamelijk chloortetracycline in aan-wezigheid van chloride, maar door toevoeging van remstoffen aan de fermentatiemedia kan de synthese practisch geheel verlegd worden naar tetracycline (50, 7g, SO).
HOOFDSTUK 4. DE mDUSTRIELE BEREIDmG VAN TETRACYCLINE (DOOR
;;
F:ERMENTAT IE) •
4,1. ALGEMENE mLEIDlliG.
Het welslagen van een fermentatieproces op industriële schaal is
afhankelijk van een aantal factoren, waarvan genoemd worden:
1) Het vermogen van het microorganisme om reproduceerbaar hoge
opbrengsten van het verlangde product te produceren en wel
in korte tijd en uit goedkope, gemakkelijk verkr~bare
grondstoffen.
2) Mogelijkheid tot eenvoudige winning van het product in zui-vere toestand.
3) Bereiding van een product, waarnaar vraag bestaat maar dat
niet op eenvoudige wijze synthetisch te fabriceren is. 4) Economische uitvoerbaarheid van het gehele fermentatie- en
winningproces.
De meeste details betreffende de industriële productie van een
be-paald antibioticum behoren tot de fabrieksgeheimen. De fabrikanten ontwikkelen hun eigen oultures, media en apparatuur teneinde de opbrengsten en de stabiliteit van hun producten te verhogen. De grote lijnen van het fermentatieproces zijn echter algemeen b&-kend en bovendien opvallend gelijk voor de diverse antibiotica. Wel bestaan aanzienlijke verschillen in de methoden van Winning
en zuivering.
De industriële productie van een antibioticum begint met de ont-wikkeling van sporen op een vaste VOedingsbOdem, hetgeen enkele dagen kan duren. De aldus verkregen sporen worden in steriel water
gesuspendeerd en in een bepaalde hoeveelheid gebruikt als ent mate-riaal voor het eerste van verscheidene vegetatieve stadia. Elk
stadium dient b.v. als 5-10
%
ent voor het VOlgende, zodat metelk stadium een tien- tot twintigvoudige volumevergroting wordt bereikt.
Het aantal vegetatieve stadia wordt hoofdzakelijk bepaald door de de bedrijfscapaciteit van de fermentatietank, waarin de eigenlijke productie plaats vindt; deze is meestal ongeveer driekwart van de
inhoud. In normale gevallen kan bij proeven in schudkolven met
één vegetatief stadium worden volstaan. Bij fermentaties op ind~
striële schaal speelt het laatste vegetatieve stadium zich vaak
af in een entvat (sead tank), waarvan de inhoud afgestemd is op
die van de fermentatietank. Voor de andere stadia wordt meestal
De fermentatietanks voor het eigenlijke productiestadium kunnen volumina van 20 000 tot meer dan 100 000 liter hebben. Voor proe-ven op semi-technische schaal worden tanks met een inhoud vah
enkele tientallen of honderden liters gebruikt. Metalen apparatuur is in het algemeen van roestvrij staal, maar in speciale gevallen-b.v. wanneer het gebruikte microorganisme gevoelig is voor sporen
ijzer - worden oQk~materialen toegepast. (dhduy\
Hoewel ook continue processen zijn en worden ontwikkeld, wordt ±n de industrie nog steeds uitsluitend ladingsgewijze fermentatie toegepast. Het voordeel hiervan is dat een voorkomende infectie tot een enkele tank beperkt blijft en niet het gehele systeem verontre1nü:.gt.
4,2. SYNTHETISCHE MEDIA.
Onderzoekers van LederIe, m.n. Minieri en medewerkers
(e9),
gebruik-ten Waksman agar voor stam ATCC 12416-0, een mutant van S.aureofa-01ens. Voor verdere bijzonderheden over deze stam wordt verwezen naar pagina 25. Waksman agar heeft de VOlgende samenstelling:percent glucose pepton monokaliumfosfaat magnesiumsulfaat heptahydraat agar 1,0 0,5 0,1 0,05 2,0
Groei en sporulering op dit medium is zeer goed. Het vegetatieve entmateriaal wordt verkregen in drie stappen, d.w.z. achtereen-volgens in schudkolven van 250 ml en 2 1 en een entvat van 500 1. Voor alle drie de vegetatieve stadia wordt het zelfde, hierna volgende, medium gebruikt.
saccharose natriumcitraat ammoniumsulfaat magnesiumsulfaat heptahydraat dikaliumfosfaat monokaliumfosfaat calciumcarbonaat zinksulfaat heptahydraat mangaansulfaat tetra.hydra.at kaliumbichromaat azijnzuur (volume) percent 3,0 0,1 0,33 0,035 0,01 0,01 0,1 0,004 0,001 0,0000016 0,04
gedestilleerd water; chloridegehalte van dit medium ca 1 ppm.
